Micropropagação de jambu [Acmella oleracea (L.) R.K. Jansen]

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1 91 Micropropagação de jambu [Acmella oleracea (L.) R.K. Jansen] MALOSSO, M.G.; BARBOSA, E.P.; NAGAO, E.O. Universidade Federal do Amazonas, Instituto de Ciências Biológicas, Bloco E, Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais. Avenida Rodrigo Otávio Jordão Ramos, 3000 Mini-Campus Universitário, Bairro Japiim. CEP: 69, , Manaus (AM) Brasil. RESUMO: O objetivo deste trabalho foi definir um protocolo para rápida multiplicação in vitro de jambu, uma planta medicinal da Amazônia com atividade larvicida contra Aedes Aegyptii. Segmentos nodais advindos de plantas adultas mantidas em casa de vegetação foram submetidos a três concentrações de hipoclorito de cálcio. Brotos axênicos resultantes do tratamento com 0,25% deste agente desinfestante foram utilizados como fonte de explantes para quatro experimentos de multiplicação. O meio de cultura indicado foi o MS suplementado com 0,1 mg L -1 de cinetina, que proporcionou 100% de explantes com brotação, 93,33% de plantas enraizadas e ausência total de calos. Experimentos comprovaram que as posições centrais da gema promovem 86,67% de explantes com brotação e brotos com 7,61 cm de altura, além de induzir 100% de plantas enraizadas, e que o substrato Plantmax é o mais indicado para a aclimatação, apresentando 78,81% de plantas vivas. Deste modo, esta espécie pode ser produzida em larga escala pelo protocolo aqui estabelecido. Palavras-chave: micropropagação, plantas medicinais, Amazônia, atividades anestésica e larvicida, Acmella oleracea ABSTRACT: Micropropagation of jambu [Acmella oleracea (L.) R.K. Jansen]. The objective of this work was to develop a protocol for a fast in vitro multiplication of jambu, an Amazonian medicinal plant with larvicidal activity against Aedes aegyptii. Nodal segments from adult plants maintained in a greenhouse were subjected to three calcium hypochlorite concentrations. Axenic sprouts resultant of the treatment with a 0.25% solution of this disinfectant agent was utilized as explant source for four multiplication experiments. MS medium supplemented with 0.1 mg L -1 kinetin was established, which led to 100% explants with sproutings, 93.33% rooted plants and total absence of callus. Experiments proved that bud central positions resulted in 86.67% explants with sproutings and in 7.61cm-height sprouts, besides inducing 100% rooted plants; also, Plantmax substrate was the most indicated for acclimatation, presenting 78.81% live plants. Thus, this species can be produced in large scale through the protocol here established. Key words: Micropropagation, medicinal plants, Amazonia, larvicidal and anesthetic activities, Acmella oleracea INTRODUÇÃO A Acmella oleracea (L.) R.K. Jansen (Compositae), popularmente conhecida como jambu, é uma espécie medicinal da Amazônia que promove sensação de formigamento e, por isso, a população do Norte do Brasil utiliza o chá de suas folhas no tratamento de males da boca e da garganta, bem como anestésico para dor de dente (Lorenzi & Matos, 2002). Embora não haja, até o momento, ensaios farmacológicos sistematizados com este vegetal, estudos realizados por Ramsewak et al. (1999), detectaram a presença de espilantol nesta espécie e, seus estudos demonstraram que esta N- isobutilamida apresenta potente atividade larvicida contra Aedes aegyptii, podendo ser utilizado como importante ferramenta no controle da dengue no Brasil. Por estas razões, diversas indústrias têm coletado estes indivíduos de maneira indiscriminada, acarretando em sua erosão genética. Recebido para publicação em 20/08/2007 Aceito para publicação em 18/12/2007

2 92 No que se refere à produção de plantas, a adoção de metodologias biotecnológicas como a micropropagação é de extrema importância, uma vez que esta técnica produz um grande número de plântulas em um curto espaço de tempo e, de acordo Guerra et al. (1999), também garante a fitossanidade e estabilidade genética das mudas, o que possibilita a reinserção dessas espécies em seu habitat natural, visto que este está sendo incessantemente devastado pela ação antrópica. Portanto, o desenvolvimento de um protocolo de micropropagação in vitro torna-se importante ferramenta para a produção de biomassa vegetal, principalmente quando a espécie em estudo já apresenta uso potencial como fitoterápico. MATERIAL E MÉTODO Este trabalho foi realizado com Acmella oleracea L. R. K. JANSEN, popularmente conhecida como Jambu. Esta espécie da família Compositae foi identificada pelo Prof. Dr. Ari de Freitas Hidalgo e a excicata encontra-se depositada no Herbário da Universidade Federal do Amazonas, sob o número HPM/UFAM:042-C. As plantas aqui utilizadas foram compradas na Feira do Japiim I, no mês de agosto de Para os testes de assepsia, foram utilizados explantes provenientes de plantas adultas, mantidas por seis meses em vasos na casa de vegetação da Universidade Federal do Amazonas. Segmentos nodais de jambu, com aproximadamente 0,5 cm foram lavados com detergente ODD neutro e enxaguados em água corrente. A primeira assepsia foi realizada com a imersão dos explantes em solução de Benomil 1% (m/v), por uma hora, seguida de um banho em solução de álcool 70% por 1 minuto. Na seqüência, aos explantes foi adicionada uma solução de hipoclorito de cálcio 0,50% (m/v) por 30 minutos. O mesmo procedimento foi realizado como descrito anteriormente, porém, com soluções de 0,25 e 0,10% (m/v) de hipoclorito de cálcio, respectivamente. Ao término de cada etapa de desinfestação, os explantes foram lavados três vezes com água destilada estéril e inoculados em meio de cultura MS basal, acrescido de 30,0 g L -1 de sacarose e 8,0 g L -1 de agar-agar, e mantidos em sala de crescimento. Após 30 dias, os explantes foram avaliados quanto à presença ou ausência de fungos e bactérias, bem quanto a sua porcentagem de sobrevivência. Quatro experimentos foram montados para desenvolver o protocolo de multiplicação in vitro desta espécie. Para estes experimentos, os explantes foram retirados de plantas axênicas crescidas in vitro. No primeiro, segmentos nodais foram inoculados em meio de cultura MS suplementado com as citocininas: benzilaminopurina, cinetina e thidiazuron nas respectivas concentrações de 0,0; 0,1; 1,0; 3,0 e 5,0 mg L -1. No segundo, gemas localizadas em diferentes posições no caule (1 a 6), foram seccionadas e inoculadas em meio de cultura MS suplementado com 0,1 mg L -1 de cinetina. No terceiro, segmentos nodais foram inoculados, respectivamente, em meio MS, WP e B5 nas concentrações originais e nas concentrações diluídas duas e quatro vezes, todos suplementados com 0,1 mg L -1 de cinetina. Todos estes experimentos foram mantidos em sala de crescimento e, após 30 dias, os explantes foram avaliados quanto à porcentagem de explantes com brotação, ao número de brotos por gema, ao número de gemas por haste, a altura de brotações e a presença de calos e raízes. Para a aclimatação desta espécie, plântulas enraizadas in vitro, com parte aérea de aproximadamente 12,0 cm de altura foram plantadas em bandejas de isopor contendo três tipos diferentes de substrato: Plantmax, terra e areia. Estas plântulas foram mantidas cobertas por frascos de vidro transparente durante 30 dias, na casa de vegetação, quando, então, os vidros foram retirados. Após 45, 60 e 75 dias do plantio, as plântulas foram avaliadas quanto a sua sobrevivência ou não em ambiente ex vitro. Em todos os experimentos deste trabalho foram utilizados 10 explantes por tratamento e estes foram realizados em triplicata. O delineamento experimental adotado neste trabalho foi o inteiramente casualizado e para a comparação das médias dos tratamentos utilizou-se o teste de Tukey ao nível de 5%. RESULTADO E DISCUSSÃO Todos os explantes tratados com a concentração de 0,50% (m/v) de hipoclorito de cálcio morreram (Tabela 1). Segundo Nietsche et al. (2006), este fato pode ser explicado pela relação entre o tamanho do explante e a ação do agente desinfestante, uma vez que tecidos pequenos são muito susceptíveis à degeneração dos tecidos causados pelo hipoclorito de cálcio. Com este experimento, também foi verificado que, com o tratamento de 0,10% (m/v) de hipoclorito de cálcio nenhum explante foi descontaminado, indicando que concentrações muito baixas desta substância não apresentam atividade bactericida efetiva no jambu. Embora o tratamento com 0,25% de hipoclorito de cálcio tenha proporcionado baixa porcentagem de explantes vivos e descontaminados, esta espécie possui uma alta e rápida taxa de multiplicação, que é o número de brotos por gema multiplicado pelo número de gemas por haste (Oliveira & Silva, 1997), tornando possível assim, a proposta de desenvolver um protocolo de micropropagação in vitro para este vegetal a partir desta assepsia.

3 93 TABELA 1. Porcentagem de desinfestação de segmentos nodais de jambu com três diferentes diluições de hipoclorito de cálcio. A partir dos resultados pode ser indicado para a multiplicação in vitro de jambu, o tratamento com 0,1 mg L -1 de Cinetina, uma vez que este proporcionou a maior taxa de explantes com brotações e boa taxa de multiplicação, além da maior altura do broto e a ausência total de calos (Tabela 2). De acordo com Lu (1993), o thidiazuron é mais ativo que a benzilaminopurina para a maioria das espécies vegetais cultivadas in vitro. No entanto, para o jambu, tanto o thidiazuron como a benzilaminopurina mostraram-se menos efetivos na taxa de multiplicação. Os tratamentos acrescidos de baixas concentrações de citocininas, além de menos onerosos, apresentam ainda pouca probabilidade de indução de variação somaclonal (Serafini et al., 2001), e, alterações genéticas nestes indivíduos, podem levar à justamente perda da característica desejada. Gemas coletadas em diferentes posições da haste foram avaliadas quanto à capacidade de germinar novas brotações e, com este experimento, verificou-se que as gemas da posição 3 induziram a maior porcentagem de explantes com brotação e maior taxa de enraizamento, quando comparada com as demais gemas (Tabela 3). Esse dado é importante porque nem todas as gemas da haste são potencialmente úteis, e não devem ser usadas indistintamente no processo de repicagem, pois não fornecerão explantes uniformes quanto ao desenvolvimento in vitro. Isto ocorre porque elas podem acumular níveis diferentes de reguladores vegetais endógenos em diferentes posições da haste e, portanto, podem promover respostas diversas (Pereira et al., 2005). As diluições pela metade e pela quarta parte dos meios WP e B5 promoveram as menores taxas de multiplicação desta espécie e, as concentrações basais destes dois meios de cultura induziram as menores alturas de broto (Tabela 4). O mesmo ocorreu TABELA 2. Efeito de diferentes tipos e concentrações de citocininas no desenvolvimento in vitro de explantes de jambu.

4 94 TABELA 3. Efeito das diferentes posições da gema no desenvolvimento in vitro de explantes de jambu. TABELA 4. Efeito de diferentes diluições dos meios de cultura basais, MS, B5 e WP e suas diluições pela metade e pela quarta parte, no desenvolvimento in vitro de explantes de jambu. com o meio MS/4. Esta diferença no desenvolvimento dos explantes provavelmente ocorre porque as vias bioquímicas e metabólicas básicas que funcionam nas plantas que crescem sob condição ex vitro são conservadas nas células e tecidos cultivados in vitro e, por isso, os meios nutritivos devem proporcionar os nutrientes necessários ao metabolismo das células em cultivo para o crescimento e diferenciação dos tecidos (Pereira & Fortes, 2003). Embora não tenha havido diferença estatística significativa entre o meio de cultura MS e MS/2 para as demais características analisadas, o meio de cultura MS na concentração original foi considerado o mais adequado para o desenvolvimento in vitro de jambu, já que induziu brotação em todos os explantes, bem como a maior taxa de multiplicação (Tabela 4). Como todos os explantes deste tratamento apresentaram raízes, esta etapa pôde ser eliminada do protocolo, tornando-o menos oneroso. A aclimatação ex vitro das plântulas de jambu apresentou alto índice de sobrevivência após 45 dias de plantio, no substrato Plantmax (Tabela 5). Até após 75 dias de aclimatação, as plantas sobreviventes continuaram verdes e vigorosas.

5 95 Tabela 5. Porcentagem de explantes de jambu que sobreviveram à aclimatação em diferentes tipos de substratos. AGRADECIMENTO À FAPEAM e à SUFRAMA pelo apoio financeiro e ao Dr. Ari de Freitas Hidalgo pela identificação da espécie vegetal. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA Um dos fatores que influenciou no índice de mortalidade das plantas enraizadas está relacionado principalmente ao substrato, cujos nutrientes são limitados e/ou esgotados em pouco tempo. Segundo Silva et al. (2001), o substrato Plantmax tem sido considerado adequado para o procedimento de aclimatação devido aos seus constituintes químicos, principalmente pela presença de fósforo, que, de acordo com Mendonça et al. (2003), estimula o crescimento da parte aérea da planta, ou ainda às características físicas que apresentam maior porosidade total, o que dá a este substrato maior capacidade de retenção de água e aeração. Conforme Torres et al. (1998), outro fator que pode ter propiciado a mortalidade das plântulas em processo de aclimatação é a mudança drástica de condições ambientais, uma vez que a transferência do ambiente in vitro para o ex vitro exige que se adapte rapidamente a estas novas condições ambientais para sobreviver. Durante a aclimatação, as plântulas passam de um ambiente onde há baixa transpiração para outro que exige maior transpiração, o que pode ocasionar estresse hídrico e, ainda, há outras adaptações importantes como a passagem de um estado heterotrófico para um autotrófico e a alteração de um ambiente asséptico para outro sujeito ao ataque de microorganismos saprófitos e, eventualmente patogênicos, que podem levar muitas mudas ao óbito. Assim, com os resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que a produção de Acmella oleracea via micropropagação é viável e o protocolo pode ser utilizado para propagar esta espécie em larga escala. GUERRA, M.P. et al. Estabelecimento de um protocolo regenerativo para a micropropagação do abacaxizeiro. Revista agropecuária Brasileira, v.34, n.9, p , LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. Nova Odessa: Plantarum, p. LU, C.Y. The use of thiadizuron in tissue culture. Vitro Cell Development Biology, v.29, n.2, p.92-6, MENDONÇA, V. et al. Diferentes substratos e recipientes na formação de mudas de mamona (Sunrise solo). Revista Brasileira de Fruticultura, v.25, n.1, p , NIETSCHE, S. et al. Estabelecimento in vitro de explantes de três cultivares de bananeira. Ciência Rural, v.36, n.3, p , OLIVEIRA, R.P.; SILVA, S.O. Avaliação da micropropagação comercial em bananeira. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.32, n.4, p , PEREIRA, J.E.S. et al. Influência do número de gemas, presença ou ausência de folhas e posição do explante na multiplicação in vitro de batata. Horticultura Brasileira, v.23, n.1, p.86-9, PEREIRA, J.E.S.; FORTES, G.R.L. Protocolo para a produção de material propagativo de batata em meio líquido. Pesquisa agropecuária Brasileira, v.38, n.9, p , RAMSEWAK, R.S.; ERICKSON, A.J.; NAIR, M.G. Bioactive N-isobutiylamides from the flower buds of Spilanthes acmella. Phytochemistry, v.51, p , SERAFINI, L.A.; BARROS, N.A.; AZEVEDO, J.L. Biotecnologia na agricultura e na agroindústria. Guaíba: Agrishow, p. SILVA, R.P.; PEIXOTO, J.R.; JUNQUEIRA, N.T.V. Influência de diversos substratos no desenvolvimento de mudas de maracajuazeiro-azedo (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa DEG). Revista Brasileira de Fruticultura, v.23, n.2, p , TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SP/EMBRAPA-CNPH, p.