Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 1706

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1 Mudas enxertadas de tomateiro e enzimas oxidativas Edvar de Sousa da Silva 1 ; Daniele Vieira de Menezes 2 ; Laís Busca Consoline 1 ; Ewerton Gasparetto da Silva 1 ; Giuseppina Pace Pereira Lima 2 ; Rumy Goto 1 1 UNESP-FCA. Rua José Barbosa de Barros, nº 1780, , Botucatu-SP. 2 UNESP IBB, Distrito de Rubião Junior, s/n, , Botucatu-SP. edvardesousa@yahoo.com.br, danyguns@hotmail.com, lais_consoline@hotmail.com, wertogasparetto@hotmail.com, gpplima@ibb.unesp.br, rumy@fca.unesp.br RESUMO Injúria mecânica, como ocorre na enxertia, pode induzir danos em vegetais, os quais geralmente são correlacionados com o aumento da formação de espécies reativas de oxigênio (ERO), que causam estresse oxidativo. Para avaliar um possível estresse, foi analisada a atividade de enzimas oxidativas, tais como, peroxidase (POD), polifenoloxidase (PPO), catalase (CAT) e superoxido dismutase (SOD) para possível correlação com os danos. Mudas de tomateiro Guardião (porta-enxerto), Pizzadoro (enxerto) e enxertadas utilizando três métodos de enxertia (Contato em Bisel, Garfagem Fenda e Encostia) foram usadas para as avaliações enzimáticas. As mudas foram colhidas aos 12 dias após a enxertia, maceradas em nitrogênio líquido e as atividades das enzimas POD, PFO, CAT, SOD foram determinadas por espectrofotometria. As mudas enxertadas com diferentes métodos e as pé-franco não diferiram quanto às atividades das enzimas POD, CAT e SOD. As mudas enxertadas, pelo método de Encostia, apresentaram maior atividade da PPO quando comparadas com as mudas de Guardião pé-franco, porém não diferiram das mudas enxertadas por Contato em Bisel, Garfagem Fenda e Pizzadoro pé-franco. A enxertia pelo método da encostia induziu formação de ERO e consequentemente, aumento da atividade de PPO, que nesse caso, pode ser tomada como marcador bioquímico do estresse oxidativo em tomateiro enxertado. PALAVRAS-CHAVE: Solanum lycopersicum, enxertia, estresse. ABSTRACT Tomato seedlings grafted and oxidative enzymes Mechanical damage, as in the grafting, may induce defects in plants, which generally correlates with increased formation of reactive oxygen species (ROS) that cause oxidative stress. To evaluate potential stress oxidative enzyme activity, such as peroxidase (POD), polyphenoloxidase (PPO), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) was analyzed for possible correlation with the damage. Tomato seedlings Guardião (rootstock), Pizzadoro (graft) were grafted using three grafting methods (Contact at bevel, Cleft graffting and Supported grafting) and were used for enzymatic evaluations. Seedlings were collected at 12 days of grafting and macerated in liquid nitrogen and POD, PPO, CAT and SOD enzyme activities were determined by spectrophotometry. The grafted seedling with different methods and those ungrafted, did not differ in terms of the activities of enzymes POD, CAT and SOD. Grafted seedling by the method of Supported grafting showed higher PPO enzyme activity when compared to Guardião seedlings ungrafted, however it did not differ from PPO activity observed in seedlings by Contact at bevel, Cleft grafting and Pizzadoro ungrafted. The Supported grafting method induced ROS production and consequently, Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 1706

2 increased activity of PPO, which in this case can be taken as a biochemical marker of oxidative stress in tomato grafted Keywords: Solanum lycopersicum, grafting, stress. Nas plantas sob estresse, seja por injúrias causadas por ferimentos ou patógenos, hídrico, salino, osmótico, temperatura, luminosidade, efeito de herbicidas, ocorre a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO). Estas formas de oxigênio, como o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ), radical superóxido (O -2 ) e o radical hidroxila (OH - ) são conhecidos por oxidar importantes constituintes celulares, tais como ácidos nucléicos, fosfolipídeos de membrana (camada bipolar) e proteínas, podendo levar as células à morte (Sarowar et al., 2005). Para combater os danos causados pelo estresse oxidativo, as plantas desenvolveram um sistema de defesa, em que se destacam as variações nas atividades de enzimas do sistema antioxidativo, que agem como eliminadores das formas reativas de oxigênio (Yoshimura et al., 2004). A enxertia causa injuria nas hortaliças que pode gerar estresse, causando alterações nos níveis de ERO e por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade de enzimas oxidativas em mudas enxertadas de tomateiro. MATERIAL E MÉTODOS As enxertias foram feitas de acordo com Goto et al. (2003), utilizando-se os métodos em estudo com auxilio de lâminas para realização do corte das mudas. Os tratamentos foram plantas pé-franco de tomateiro Guardião (porta-enxerto), Pizzadoro (enxerto) e enxertadas utilizando três métodos de enxertia (Contato em Bisel, Garfagem Fenda e Encostia). A atividade da POD (EC ) foi estimada pelo método de Lima et al. (1999). O ensaio foi realizado em 5,0 ml de 0,1 M tampão acetato de sódio (ph 5,0), o substrato utilizado foi composto por 0,5 ml de 30% peróxido de hidrogênio em tampão fosfato de potássio 0,2 M (ph 6,7) e 0,5 ml de solução de fenol e aminoantipirina. A reação iniciou-se pela adição do extrato bruto e após cinco minutos, adicionou-se 2 ml de álcool etílico absoluto. A atividade enzimática foi realizada em 505 nm e expressa em µmol H 2 O 2 de composto min -1 g -1 massa fresca. Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 1707

3 A atividade da PPO (EC ) foi determinada pelo método adaptado de Kar & Mishra (1976), pela mensuração da conversão do catecol em quinona. O substrato utilizado foi composto por catecol 0,1 M em tampão fosfato de potássio 0,2 M (ph 6,7). As leituras foram feitas após a adição de ácido perclórico a 395 nm. A atividade enzimática foi expressa em µmol catecol oxidado min -1 g -1 massa fresca. A atividade da CAT (EC ) também foi determinada por adaptação do método de Kar & Mishra (1976). Para a análise da atividade foi usado 150 µl de amostra, acrescido de EDTA, DTT e PVPP. O substrato usado foi a solução de peróxido de hidrogênio 50 mm. As leituras foram feitas a 240 nm durante 2 minutos. A atividade enzimática foi expressa em CAT µmol H 2 O 2 min -1 ng MF -1. A atividade da SOD (EC ) (Beauchamp & Fridovich, 1973) foi avaliada pela capacidade da enzima em inibir a fotorredução do azul de nitrotetrazólio (NBT) em um meio de reação composto por metionina, EDTA, NBT e riboflavina em tampão fosfato de potássio 50 mm. A produção de formazana azul, resultante da fotorredução do NBT foi determinada pela absorção a 560 nm. Uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de enzima necessária para a inibição de 50% da fotorredução do NBT. As comparações dos dados referentes às atividades das enzimas foram realizadas com base no desvio padrão das médias. RESULTADOS E DISCUSSÃO As mudas enxertadas com diferentes métodos e as pé-franco não diferiram quanto às atividades das enzimas POD, CAT e SOD (Figuras 1, 3 e 4). Resultados semelhantes foram descritos em outros trabalhos, em que não ocorreu diferença na atividade da CAT quando compararam plantas enxertadas de tomateiro, porta-enxerto e enxerto pé-franco (Fernández-Garciá et al., 2004; He et al., 2009). Por outro lado, maior atividade da POD foi observada em porta-enxerto, plantas enxertadas e enxerto pé-franco de tomateiro consecutivamente (Fernández-Garciá et al., 2004). Maior atividade da SOD foi descrita em plantas pé-franco de tomateiro em relação a plantas enxertadas (He et al., 2009), diferente do resultado deste trabalho, que não mostrou diferença de atividade desta enzima entre as plantas enxertadas por vários métodos e plantas pé-franco do porta-enxerto e enxerto. Isto mostra a necessidade de mais estudos relacionando enzimas oxidativas e plantas enxertadas. Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 1708

4 As mudas enxertadas, pelo método de Encostia, apresentaram maior atividade da PPO quando comparadas com as mudas de Guardião pé-franco, porém não diferiram da das mudas enxertadas por Contato em Bisel, Garfagem Fenda e Pizzadoro (péfranco) (Figura 2). Diversos estudos relacionando atividade da PPO e a presença de patógenos tem sido descrito, como por exemplo, Ralstonia Solanacearum em tomateiro pé-franco (Silva et al., 2007; Vanitha, et al., 2009), provavelmente, por esse patógeno induzir estresse oxidativo, formando ERO; entretanto, estudos relacionando enxertia e PPO são escassos, mostrando assim, a importância de estudos com a atividade da PPO em plantas enxertadas de tomateiro. A enxertia pelo método da encostia induziu formação de ERO e consequentemente, aumento da atividade de PPO, que nesse caso, pode ser tomada como um marcador bioquímico do estresse oxidativo em tomateiro enxertado. AGRADECIMETOS Os autores agradecem a CAPES (bolsa de Doutorado) e ao programa de pós-graduação Agronomia-Horticultura da UNESP-FCA, as empresas Takii Seeds e Nunhems. REFERÊNCIAS BEAUCHAMP CO; FRIDOVICH I Isoenzymes of superoxidase dismutase from wheat germ. Biochimica et Biophysica Acta 317: FERNÂNDEZ-GARCIA N; CARVAJAL M; OLMOS E Graft union formation in tomato plants: peroxidase and catalase involvement. Annals of Botany. 93: GOTO R; SANTOS HS; CAÑIZARES KAL Enxertia em hortaliças. 1ed. Botucatu: Editora UNESP. 85 p. HE Y; ZHU Z; YANG J; NI X; ZHU B Grafting increases the salt tolerance of tomato by improvement of photosynthesis and enhancement of antioxidant enzymes activity. Environmental and Experimental Botany 66: LIMA GPP; BRASIL OG; OLIVEIRA AM Polyamines and peroxidase activity in bean (Phaseolus vulgaris L.) grown under saline stress. Sci. Agrícola 56: KAR M; MISHRA D Catalase, peroxidase and polyphenoloxidase activities during rice leaf senescense. Plant Physiology, 57: SAROWAR S; KIM EN; KIM YJ; OK SH; KIM KD; HWANG BK; SHIN JS Overexpression of a pepper ascorbate peroxidase-like 1 gene in tobacco plants enhances tolerance to oxidative stress and pathogens. Plant Science 169: SILVA RF; PASCHOLATI SF; BEDENDO IP Indução de resistência em tomateiro por extratos aquosos de Lentinula edodes e Agaricus blazei contra Ralstonia solanacearum. Fitopatol. bras. 32: VANITHA SC; NIRANJANA SR; UMESHA S Role of Phenylalanine Ammonia Lyase and Polyphenol Oxidase in Host Resistance to Bacterial Wilt of Tomato. J Phytopathol 157: Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 1709

5 Figura 1. Atividade da enzima peroxidase (POD) em plantas de tomateiro enxertadas através dos métodos Contato em Bisel, Garfagem Fenda e Encostia, porta-enxerto e enxerto pé-franco (peroxidase activity (POD) in tomato plants grafted with methods Contact at bevel, Cleft graffting and Supported grafting, rootstock and graft ungrafted). UNESP-FCA, Botucatu, SP, Silva, ES, Figura 2. Atividade da enzima polifenoloxidase (PPO) em plantas de tomateiro enxertadas através dos métodos Contato em Bisel, Garfagem Fenda e Encostia, portaenxerto e enxerto pé-franco (polyphenoloxidase activity (PPO) in tomato plants grafted with methods Contact at bevel, Cleft graffting and Supported grafting, rootstock and graft ungrafted). UNESP-FCA, Botucatu, SP, Silva, ES, Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 1710

6 Figura 3. Atividade da enzima catalase (CAT) em plantas de tomateiro enxertadas através dos métodos Contato em Bisel, Garfagem Fenda e Encostia, porta-enxerto e enxerto pé-franco (catalase activity (CAT) in tomato plants grafted with methods Contact at bevel, Cleft graffting and Supported grafting, rootstock and graft ungrafted). UNESP-FCA, Botucatu, SP, Silva, ES, Figura 4. Atividade da enzima superoxido dismutase (SOD) em plantas de tomateiro enxertadas através dos métodos Contato em Bisel, Garfagem Fenda e Encostia, portaenxerto e enxerto pé-franco (superoxide dismutase activity (SOD) in tomato plants grafted with methods Contact at bevel, Cleft graffting and Supported grafting, rootstock and graft ungrafted). UNESP-FCA, Botucatu, SP, Silva, ES, Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 1711