EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO DE Hansenula wingei NO CONTROLE DE Penicillium expansum E Apergillus ochraceus

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1 UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS PATRÍCIA SIMER EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO DE Hansenula wingei NO CONTROLE DE Penicillium expansum E Apergillus ochraceus TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO II FRANCISCO BELTRÃO

2 PATRÍCIA SIMER EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO DE Hansenula wingei NO CONTROLE DE Penicillium expansum E Apergillus ochraceus Trabalho de Conclusão de curso apresentado ao Curso Superior de Tecnologia em Alimentos da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de Tecnólogo em Alimentos. Orientador: Prof. Dr. Alexandre Rodrigo Coelho Co-orientador: Profa. Dra. Alessandra Machado-Lunkes FRANCISCO BELTRÃO

3 FOLHA DE APROVAÇÃO EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO DE Hansenula wigei NO CONTROLE DE Penicillium expansum E Apergillus ochraceus Por Patrícia Simer Trabalho de Conclusão de Curso aprovado como requisito parcial para a obtenção do título de Tecnólogo em Alimentos, no Curso Superior de Tecnologia em Alimentos da Universidade Tecnológica Federal do Paraná. BANCA AVALIADORA Profª Dr. Alexandre Rodrigo Coelho Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR (Orientador) Profª Drª Alessandra Machado Lunkes Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR (Co-orientadora) Prof. Dr. Hernan Vielmo Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR Prof. Dr. Cleusa Inês Weber Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR (Coordenador de curso) Francisco Beltrão, Abril de A folha de aprovação assinada encontra-se na coordenação do curso. 3

4 A Deus pela força, saúde e coragem para a realização deste trabalho. A meus pais Ari e Geneci pelo incentivo, amor, compreensão e carinho prestados durante esta caminhada, grata eternamente. 4

5 AGRADECIMENTOS À Deus por permitir que eu chegasse ao fim de mais um desafio. Ao Prof. Dr. Alexandre Rodrigo Coelho pela orientação, pelos ensinamentos passados, pelo carinho, incentivo e atenção prestados e principalmente pela oportunidade gerada, sem os quais não seria possível a realização deste trabalho. À Profª Drª Alessandra Machado Lunkes pela colaboração, apoio e amizade. Aos membros da banca que gentilmente aceitaram o convite para avaliação deste trabalho de conclusão de curso. À Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Aos técnicos laboratoristas Camila, Cristiane, Ronaldo, João, Poliane e Thaís pela ajuda em momentos de esquecimento. Aos colegas de laboratório, especialmente ao Ciro Portes pelos ensinamentos passados, a Andrielen V. de Oliveira e ao Rubens P. Calegari. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa-CNPq, pela concessão de bolsa. À Profa. Dra. Elisabete H. Hashimoto e a tecnóloga Alessandra M. Gasperini pela disponibilização de cepas da levedura utilizada. À todos os colegas do curso Superior em Tecnologia em Alimentos, especialmente as companheiras de todas as horas Bruna Raquel Böger, Camila Baldo, Mariluci Fortes e Adriana Menegaro. Aos meus pais por todo o carinho, exemplo, amor e esforços realizados para a minha formação profissional. Ao meu irmão pelo apoio prestado. Aos amigos, também considerados como meus pais, Eroni e Selmo, pelo grande carinho e apoio. À toda a minha família pela força. Enfim, a todos que eu não tiver mencionado e que estiveram presentes durante a realização do trabalho, o meu muito obrigado. 5

6 A menos que modifiquemos nossa maneira de pensar, não seremos capazes de resolver os problemas causados pela forma como nos acostumamos a ver o mundo. (Albert Einstein) 6

7 RESUMO SIMER, Patrícia. Efeito de frações ultrafiltradas do cultivo de Hansenula wingei no controle de Penicillium expansum e Apergillus ochraceus Trabalho de Conclusão de Curso (Curso Superior de Tecnologia em Alimentos). Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Francisco Beltrão. O Brasil se classifica entre os quatro maiores produtores mundiais de frutas, juntamente com China, Índia e EUA. Porém, a competitividade das frutas frescas brasileiras no mercado internacional é bastante vulnerável. Isto ocorre devido a sua susceptibilidade à infecção fúngica no campo, assim como ataque durante o armazenamento, acarretando em consideráveis perdas econômicas. Aliado ao interesse dos consumidores por produtos naturais e mais saudáveis se faz necessário uma maior atenção quanto à qualidade das frutas frescas que serão exportadas, devido a sua exposição prolongada em condições propícias a proliferação de fungos deteriorantes/micotoxigênicos. Assim o biocontrole empregando leveduras antagonistas, com ênfase em linhagens killer, em função da baixa possibilidade de resíduos tóxicos, se mostra como uma relevante alternativa em relação ao tratamento químico tradicional, diminuindo a quantidade de fungicidas utilizados no tratamento de frutos na póscolheita. Desta maneira, objetivou-se estudar o biocontrole de Aspergillus ochraceus e Penicillium expansum (fungos filamentosos) pela levedura antagonista Hansenula wingei (AM2-2 ). A levedura H. wingei mostrou-se killer positiva perante as leveduras sensíveis Candida glabrata NCYC 366 (K3), C. albicans 12A (K8) and Pichia kluyveri (CAY-15). No antifungigrama em meio líquido (caldo MPL) o sobrenadante do cultivo de H. wingei (AM2-2 ) (25 C/96 horas) inibiu 100% da germinação de esporos e do desenvolvimento de hifas de P. expansum. Com a utilização da mesma levedura contra o fungo A. ochraceus observou-se uma inibição no desenvolvimento de hifas de 59,26% (25 C/120 horas) e inibição na germinação de esporos de 90,92% (25 C/72 horas). A diferença entre os sobrenadantes obtidos do cultivo da levedura isoladamente e em interação com o fungo teste foi significativa (P < 0,05) na maioria dos ensaios. Quando da utilização das frações filtradas para a realização do antifungigrama em meio líquido observou-se 75,02% de inibição do desenvolvimento de hifas (membrana de 10kDa) e 90% de inibição da germinação de esporos (membrana de 5kDa) de A. ochraceus, sugerindo que possivelmente os compostos antifúngicos com maior ação sobre este fungo apresentam peso molar entre 3 e 10kDa. Já em relação ao desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de P. expansum observou-se inibição total (100%) com a utilização de todas as frações, sugerindo-se assim que o composto antifúngico de maior ação para P. expansum tenha peso molecular inferior a 3kDa. De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que a aplicação de leveduras antagonistas constitui ferramenta promissora no controle biológico de P. expansum e A. ochraceus em pós-colheita de frutas. Palavras-chave: Biocontrole; Frutas; Levedura; Massa molar. 7

8 ABSTRACT SIMER, Patricia. Effect of ultrafiltradas fractions growing of Hansenula wingei in the control of Penicillium expansum and Apergillus ochraceus Monography (College of Food Technology). Federal Technological University of Paraná. Francisco Beltrão. The Brazil ranks among the four largest producers of fruit, along with China, India and USA. However, the competitiveness of Brazilian fresh fruit in the international market is very vulnerable. This is due to their susceptibility to fungal infection in the field, as well as attack during storage, resulting in significant economic losses. Allied to consumer interest in natural products and healthier is needed more attention on the quality of fresh fruit to be exported due to prolonged exposure to conditions conducive to proliferation of spoilage fungi / mycotoxigenic. So biocontrol using antagonistic yeasts with emphasis on killer strains, due to the low possibility of toxic residues, shown as a relevant alternative to the traditional chemical treatment, decreasing the amount of fungicides used in the treatment of post-harvest fruit. Thus, the objective was to study the biocontrol of Aspergillus ochraceus and Penicillium expansum (filamentous fungi) by antagonistic yeast Hansenula wingei (AM2-2). Yeast H. wingei showed positive killer against sensitive yeasts Candida glabrata NCYC 366 (K3), Candida albicans 12A (K8) and Pichia kluyveri (CAY-15). In vitro antifungal susceptibility in liquid (broth MPL) the culture supernatant of H. wingei (AM2-2) (25 C for 96 hours) 100% inhibited spore germination and hyphal development of P. expansum. With the use of the same yeast against the fungus A. ochraceus observed a reduction in the development of hyphae of 59.26% (25 C/120 hours) and inhibition of spore germination of 90.92% (25 C/72 hours). The difference in the supernatants obtained from the yeast culture alone and in interaction with the test fungus was significant (P <0.05) in most experiments. When using the fractions filtered to carry out the in vitro antifungal susceptibility liquid medium was observed 75.02% inhibition of the development of hyphae (10kDa membrane) and 90% inhibition of spore germination (5kDa membrane) A. ochraceus, possibly suggesting that the antifungal compounds with higher activity on this fungus have molecular weight between 3 and 10kDa. In relation to the development of hyphae and spores germination of P. expansum total inhibition was observed (100%) with the use of all fractions, thus suggesting that the antifungal compound of greater activity for P. expansum has a molecular weight below 3kDa. According to the obtained results, it is concluded that the application of antagonistic yeast is a promising tool for the biological control of P. expansum and A. ochraceus in postharvest fruit. Key words: Biocontrol, fruits, yeast, Molar mass. 8

9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - a) deterioração em uvas por Aspergillus sp.; b) imagem de microscópio óptico de Aspergillus ochraceus; c) colônia típica de A. ochraceus. Fonte: NIHS (2012) Figura 2 - a) deterioração em maçã por Penicillium expansum; b) imagem de P. expansum por microscópio óptico; c) colônia típica de P. expansum. Fonte: AGES (2012) Figura 3 - Exemplos de células de leveduras e sua reprodução por brotamento originando novas células. Fonte: NIHS (2012) Figura 4 - Efeito inibitório do cultivo de H. wingei (AM2-2) e da interação H. wingei/p. expansum no desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de P. expansum (10 5 esporos), após 12 horas/25 C Figura 5 - Efeito inibitório do cultivo de H. wingei (AM2-2) e da interação H.wingei/A. ochraceus no desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de A. ochraceus (10 5 esporos), após 12 horas/25 C Figura 6 - Efeito inibitório do sobrenadante de H. wingei (AM2-2) (S + A) e das frações filtradas (F + A) sobre o desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de A. ochraceus (10 5 esporos), após 12 horas/25 C

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Fungos e deterioração em frutas Tabela 2 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H. wingei e da interação levedura/p. expansum Tabela 3 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H. wingei (AM2-2 ) e da interação levedura/a. ochraceus Tabela 4 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H. wingei (AM2-2 ) e filtrados obtidos a partir do extrato bruto, contra A. ochraceus Tabela 5 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H. wingei (AM2-2 ) e filtrados obtidos a partir do extrato bruto, contra P. expansum

11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos REVISÃO DE LITERATURA PRODUÇÃO E COMERCIALIZAÇÃO DE FRUTAS FRESCAS DETERIORAÇÃO DE FRUTAS PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS CONTROLE DE FUNGOS Controle biológico ATIVIDADE KILLER MATERIAL E MÉTODOS Fungo teste Análise do Potencial Killer Cura da levedura Killer Obtenção do extrato bruto Antifungigrama em Meio Líquido Purificação parcial de composto antifúngico RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS

12 1 INTRODUÇÃO No Brasil, a agricultura apresenta-se como uma das bases mais potentes de economia com fornecimento contínuo garantido de cereais, hortaliças, oleaginosas, frutas e derivados processados (COELHO; HOFFMANN; HIROOKA, 2003). A exportação brasileira de frutas frescas vem aumentando no decorrer dos últimos anos, sua produtividade supera os 41 milhões de toneladas, classificando o país entre os quatro maiores produtores mundiais juntamente com China, Índia e EUA. As frutas mais produzidas e exportadas são basicamente melão, manga, maça e banana (IBRAF, 2012; FAO, 2012). Entretanto, aproximadamente 30% do total de frutas frescas produzidas no Brasil nunca chegam ao consumidor final devido a grande susceptibilidade das mesmas à infecção fúngica (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Sendo que, de modo geral a infecção fúngica geralmente está correlacionada a fatores ambientais como temperatura e umidade e a danos mecânicos ocorridos durante colheita, transporte e estocagem (SILVEIRA et al., 2005). Dentre os deteriorantes mais comumente encontrados em frutas frescas estão os fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. As espécies de Penicillium principalmente são as mais importantes deterioradoras de frutas in natura, além de produção de micotoxinas (BATISTA; FREITAS, 2000), que são substâncias nocivas à saúde humana e animal. Porém para a realização do controle destes fungos utilizam-se fungicidas, de modo a aumentar ainda mais a quantidade de químicos presentes no organismo humano. Certas espécies de leveduras apresentam habilidade de produção de compostos antimicrobianos, como por exemplo, a toxina killer, que tem ação sobre outras espécies de leveduras, fungos filamentosos e bactérias podendo causar a morte dos mesmos (ROSA, 2009). Assim uma alternativa ao tradicional tratamento químico (utilização de fungicidas) pós-colheita de doenças em frutos, destaca-se o controle biológico com a utilização de leveduras antagonistas, principalmente as das linhagens killer, devido a sua baixa possibilidade de resíduos tóxicos e mostrando-se inócua perante processos fermentativos (COELHO et al., 2011). Assim de acordo com o pressuposto, este trabalho objetivou avaliar a inibição de Aspergillus ochraceus e Penicillium expansum por toxina killer produzida pela levedura H. wingei (AM2-2 ), bem como realizar ultrafiltração com o intuito de se purificar parcialmente 12

13 substâncias killer de amplo espectro de ação para aplicação no controle biológico de pragas e doenças que diminuem a qualidade de frutas na pós-colheita. 13

14 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Avaliar a inibição do crescimento dos bolores deteriorantes Aspergillus ochraceus e Penicillium expansum por frações ultrafiltradas obtidas do cultivo de Hansenula wingei (AM2-2 ). 2.2 Objetivos específicos - Determinar se há expressão de caráter killer pela levedura Hansenula wingei (AM2-2 ). - Avaliar possível diminuição de produção da toxina killer após realização de tratamento térmico. - Avaliar o antagonismo da levedura killer no desenvolvimento dos bolores P. expansum e A. ochraceus, por meio de análise microscópica, observando-se a atuação sobre o desenvolvimento de hifas e sobre a porcentagem de germinação de esporos. - Purificar parcialmente o composto antifúngico com maior potencial antagônico, pela levedura, por meio de etapas de ultrafiltração. 14

15 3 REVISÃO DE LITERATURA 3.1 PRODUÇÃO E COMERCIALIZAÇÃO DE FRUTAS FRESCAS Observando-se as condições climáticas e extensão territorial, grandemente favorável, o Brasil apresenta condições ótimas de modo a se tornar um dos maiores polos produtivos para o mercado mundial de frutas, se beneficiando da onda naturalista que vem sendo observada no mundo todo (NACHREINER; SANTOS; BOTEON, 2003). A exportação brasileira de frutas frescas vem aumentando no decorrer dos últimos anos, sua produtividade supera os 42,6 milhões de toneladas (2010) em uma área de 2,2 milhões de hectares, classificando o país em 3 lugar na produção mundial, perdendo para 1 China e 2 Índia e seguido pelos Estados Unidos (BRAZILIAN FRUIT, 2012), como pode-se observar no Gráfico 1. As frutas mais produzidas e exportadas são basicamente melão, manga, maça e banana (IBRAF, 2012; FAO, 2012). Gráfico 1: Produção mundial de frutas no ano de Fonte: FAO (2012) modificado. Porém, da produção brasileira de frutas, apenas uma pequena parcela é exportada, sendo a grande parte ainda destinada ao mercado interno. Estima-se que do total produzido, 15

16 53% destina-se ao mercado interno in natura, 46% a indústria processadora e apenas uma pequena parcela é destinada à exportação, menos de 2% do total de frutas frescas produzidas, mesmo assim, a cadeia produtiva das frutas é considerada um dos setores do agronegócio nacional com maior potencial (INTEC, 2005; IBGE, 2012). As frutas frescas tiveram aumento na exportação no decorrer dos anos, porém após um pico de exportação em 2007 com 918 mil toneladas, observou-se um queda constante chegando em 2010 a 759 mil toneladas exportadas, diminuição em 3 anos de 17% das exportações (IBRAF, 2012; IBGE, 2012). A exportação de frutas brasileiras apresenta fatores limitantes de competitividade relacionados à qualidade, como preços praticados, condições de armazenamento, falta de organização dos produtores, falta de apoio do governo e alta perecibilidade. Outro fator determinante é a variação de ano para ano do volume de frutas exportadas, implicando em baixa confiabilidade na exportação brasileira em relação à regularidade de fornecimento frente a importadores estrangeiros (LACERDA; LACERDA; ASSIS, 2004) e a ausência de suprimentos regulares, consistentes e de boa qualidade, o que ainda dificulta o desenvolvimento a longo prazo da indústria de frutas (INTEC, 2005). 3.2 DETERIORAÇÃO DE FRUTAS Aproximadamente 30% da produção de frutas nunca chegam ao consumidor final, devido a perdas no campo e pós-colheita, sendo que para algumas em especial como, por exemplo, a banana e morango os valores são ainda mais relevantes atingindo 38 e 40% respectivamente (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Frutas são produtos considerados altamente perecíveis, principalmente pós-colheita onde são susceptíveis a doenças de ordem microbiológica (CHAN; TIAN, 2005). Estas doenças estão ligadas ao fato de que após a colheita diferente dos produtos de origem animal, as frutas e hortaliças continuam vivas, mantendo seus processos biológicos vitais ativos (CASA et al., 2006). Os países em desenvolvimento são fortemente afetados, com grandes perdas devido a instalações, armazenamento e transporte inadequados (EL GHAOUTH; WILSON; WISNIEWSKI, 2004). A deterioração das frutas tem seu início durante a colheita, assim quanto mais cuidados forem tomados perante os procedimentos, menor será o processo de deterioração nas etapas seguintes. Devido à composição nutricional das frutas estas são 16

17 capazes de sustentar o desenvolvimento de bactérias, bolores e leveduras, contudo, o seu ph desfavorece o crescimento bacteriano, de modo que sua ampla faixa de ph facilita o crescimento de bolores e leveduras propiciando que estes atuem realizando alterações em frutas (PARIZ, 2011). Consideráveis perdas nos cultivos de importância econômica são resultado da vulnerabilidade das frutas à infecção fúngica geralmente ligada a fatores ambientais como temperatura e umidade e a danos mecânicos ocorridos durante colheita, transporte e estocagem (FAZIO, 2009). Os gêneros com espécies produtoras de patulina e ocratoxina A demonstram certa tendência a preferir substratos constituintes de frutas frescas (MOAKE; PADILLA-ZAKOUR; WOROBO, 2005), como se observa na tabela 1. Tabela 1 - Fungos e deterioração em frutas. Gênero Alternaria spp Aspergillus spp Botrytis spp Colletotrichum spp Fusarium spp Penicillium spp Rhyzopus spp Fonte: Evangelista (2008) modificado. Alterações em frutas Putrefação mofosa negra em figo, uva, banana, maçã e tâmara. Podridão negra em frutas cítricas. Putrefação cinzenta em grande parte das frutas. Putrefação antrocnósica em frutas cítricas, banana e abacate. Podridão marrom em cítricos e abacaxis, além de alteração peduncular. Podridão azul e verde em cítricos, e azul em maçã, uva, pera e banana. Além de causar podridão marrom em abacaxi. Putrefação mole em vários tipos de frutas. 3.3 PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS As micotoxinas, origem das palavras gregas mikes e toxina que significam respectivamente fungo e veneno, são compostos produzidos quando a fase de crescimento atinge a sua fase final e durante a fase estacionária do bolor ( CASTILHO et al., 2007). Uma grande variedade de fungos produz metabólitos secundários, podendo apresentar potencial toxigênico (produção de micotoxinas) tendo representatividade na contaminação de alimentos de consumo humano e animal (CELLI, 2006) como forma direta ou indireta, através de tecidos de animais, leite e ovos (UEKANE; BANDEIRA; SILVA, 17

18 2010), vindo a causar desde uma simples náusea, alucinações, dermatites, carcinomas ou até mesmo a morte (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2008). As micotoxinas também podem causar a neoplasia maligna, por serem elementos carcinogênicos (ASTOVIZA; SUÁREZ, 2005). A contaminação dos alimentos por micotoxinas resulta, geralmente, da infecção do alimento por fungos toxigênicos durante fases distintas da produção como o cultivo, colheita, armazenamento, transporte e processamento desses alimentos (ASAE, 2009) bem como, sempre que condições básicas favoráveis de umidade, temperatura e ph, estiverem presentes (NUNES, 2008). Mas, é importante se observar que nem todas as cepas de uma mesma espécie são toxigênicas, ou seja, a presença de microrganismos patogênicos representa uma possibilidade de contaminação, não confirmando a presença efetiva de micotoxinas (DUARTE, 2010). Os gêneros mais importantes de fungos micotoxigênicos são Aspergillus, Penicillium e Fusarium, com contaminação de alimentos em várias etapas da cadeia alimentar (BRYDEN, 2007). Fatores como a umidade, temperatura, co-cultura, disponibilidade de nutrientes e a atmosfera de crescimento, podem ser considerados como os principais fatores relacionados ao aparecimento de toxinas fúngicas em alimentos, sendo necessária a adoção de medidas que zelem pela manutenção desses fatores, impedindo a presença dessas toxinas garantindo um aproveitamento melhor desses alimentos (BAPTISTA; HORII; BAPTISTA, 2004). Mais de 300 substâncias já foram identificadas como micotoxinas, seu estudo tem elevada importância devido à gravidade das doenças causadas, caracterizando-se assim como um problema de saúde pública (PERREIRA; SANTOS, 2011). Há uma variada gama de micotoxinas, mas apenas algumas são mais frequentes e de importância à segurança alimentar como, por exemplo, as aflatoxinas, a ocratoxina A, tricotecenos, patulina, zearalenona e as fumonisinas (ASAE, 2009). A gravidade dos efeitos gerados pelas micotoxinas é dependente da sua toxicidade, grau e tempo de exposição, idade e do estado nutricional do indivíduo, entre outros fatores (NOGUEIRA; OLIVEIRA, 2006). Devido a grande variedade de fungos no meio ambiente, as micotoxinas podem ser consideradas como contaminantes inevitáveis de alimentos e rações assim, portanto, necessitando-se de medidas eficazes no estabelecimento de níveis razoáveis de ingestão para se garantir a manutenção da saúde pública (XU et al., 2006). O substrato não é o que determina singularmente o desenvolvimento satisfatório de um determinado grupo fúngico e consequente produção de micotoxinas, mas também há 18

19 relação com as características da espécie predominante (COELHO, 2005). Sendo assim, maior ênfase é dada aos gêneros Aspergillus (Figura 1) e Penicillium (Figura 2) devido a sua preferência na participação da deterioração e consequente produção de micotoxinas em frutas. a b c Figura 1 - a) deterioração em uvas por Aspergillus sp.; b) imagem de microscópio óptico de Aspergillus ochraceus; c) colônia típica de A. ochraceus. Fonte: NIHS (2012). a b c Figura 2 - a) deterioração em maçã por P. expansum; b) imagem de P. expansum por microscópio óptico; c) colônia típica de P. expansum. Fonte: AGES (2012). 3.4 CONTROLE DE FUNGOS Buscando-se a redução das podridões pós-colheita, várias tecnologias têm sido utilizadas como, por exemplo, controle químico (inibidores de amadurecimento, fungicidas sistêmicos e protetores), controle biológico (antagonistas), controle físico (tratamento térmico, 19

20 radiação, atmosfera controlada e modificada) e indução de resistência (elicitores bióticos e abióticos) (SILVEIRA et al., 2005). Visando assim um planejamento mais sustentável do sistema agroindustrial, diminuindo impactos ao meio ambiente. O uso de fungicidas sintéticos ainda é um dos controladores pós-colheita mais utilizados em frutas (CASTORIA et al., 2001). Entretanto, o uso indiscriminado dos mesmos vem acarretando um aumento da resistência microbiana ao tratamento, bem como, riscos a saúde humana e ecossistema (SUGAR; SPOTTS, 1999; KORSTEN; BEZUIDENHOUT; KOTZE, 1988). Assim, para a obtenção de um produto com o mínimo possível de contaminantes, bem como o acúmulo dessas substâncias tóxicas no ambiente (CAMILO et al., 2000; SILVEIRA et al., 2005), tem-se iniciado a aplicação do controle biológico, com ênfase em pesquisas relacionadas ao antagonismo de leveduras killer, buscando-se a solução para este problema sem perdas de qualidade do produto final (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002). As leveduras (figura 3) são fungos unicelulares não-filamentosos, apresentados caracteristicamente sob formas esféricas ou ovais, com reprodução assexuada por brotamento ou fissão e formação de colônias com aspectos pastosos ou cremosos (ICB/UFMG, 2012). Elas preferem para sua sobrevivência substratos açucarados e ricos em água como os frutos, por exemplo, também em sucos de frutos danificados, podendo também se desenvolver em condições extremas (BECZE, 1955). Figura 3 - Exemplos de células leveduras e sua reprodução por brotamento originando novas células. Fonte: NIHS (2012) Controle biológico Atualmente, produtores e pesquisadores se deparam com o desafio da substituição do uso de produtos químicos por produtos alternativos de controle, substâncias estas livres de 20

21 resíduos tóxicos ou através da tecnologia do biocontrole (ROSA, 2009), ou seja, utilização de agentes naturais para controlar pragas ou patologias de plantas (BLEVE et al., 2006). O controle biológico tem elevada importância devido ao seu significativo potencial, tanto em termos de questões ambientais e econômicas, quanto para incorporação de sistemas de produção orgânicos e convencionais de frutas (BHARAT, 2011). Segundo Cook e Baker (1983) controle biológico é definido como a redução da soma de inóculo ou atividades determinantes da doença provocada por um patógeno, realizada por um ou mais organismos que não o homem. Em geral, o controle biológico mostra-se como uma forma de combate as doenças, tanto no campo como também na pós-colheita, substituindo ou com ação conjunta aos agroquímicos, tornando a produção de alimentos mais sustentável e ecológica (ROSA, 2009). A utilização de organismos no controle de outros que estejam causando danos a culturas diferenciadas, seja por antibiose, predação, indução a resistência, competição por nutrientes, é denominado controle biológico (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002; ARAÚJO, 2007). Métodos de controle biológico constituem, quando comparados aos químicos tradicionais, alternativas viáveis de aplicação pós-colheita principalmente por não deixarem resíduos tóxicos no alimento (WILSON; WISNIEWSKI, 1994). De acordo com Wilson e Wisniewski (1994), o método de utilização pós-colheita de leveduras antagonistas é o melhor e mais prático no controle biológico em frutas e vegetais. Para Janisiewicz e Korsten (2002), as condições de meio que favorecem tanto o agente patogênico, quanto o agente com potencial antagonista, devem ser as mesmas ou muito semelhantes para a obtenção de um controle eficaz. A utilização de leveduras antagonistas tem sido muito estudada para aplicação no controle biológico em frutos, devido às características adequadas das mesmas para este papel (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002), já que em sua maioria apresentam requisitos nutricionais simples, podendo colonizar superfícies secas por períodos elevados de tempo, sendo relevantes na seleção de novos controladores (CHANCHAICHAOVIVAT et al., 2007; EL- TARABILY; SIVASITHAMPARAM, 2006). Já é possível encontrar no mercado a presença de biopesticidas, composto por microrganismos antagonistas ativos, mesmo que o maior uso desta tecnologia ainda se concentre em laboratórios de pesquisas (ROSA, 2009). Um destes mecanismos de controle biológico é o BIOSAVE (Ecoscience, Worcester, MA), à base de estirpes de Pseudomonas syringae, (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002; CONWAY et al., 2004), utilizado no controle 21

22 de P. expansum e Botrytis cinerea com aplicação em maçãs e peras armazenadas (SUGAR; SPOTTS, 1999; KINAY; YILDIZ, 2008). Há também um fungicida israelense, o ASPIRE (Ecogen, Langhorne, PA), com base na estirpe I-182 de Candida oleophila, registrado no controle pós-colheita de P. expansum em peras e maçãs (SUGAR; SPOTTS, 1999; BENBOW; SUGAR, 1999; KINAY; YILDIZ, 2008). Há alguns anos houve o desenvolvimento de um novo produto, o YIELD PLUS (Ancor Yest, Cape Town, Solth Africa) constituído de Cryptococcus albidus e com utilização no controle pós-colheita de maçãs (SUGAR; SPOTTS, 1999; KINAY; YILDIZ, 2008). Resultados como os citados, vêm reforçando o biocontrole como método alternativo ao tradicional tratamento químico, necessitando-se apenas melhoria e redução de custos para melhor viabilidade (TAVARES, 1996). Chanchaichaovivat e Ruenwongs (2008) na utilização de 4 leveduras antagonistas isoladas de frutas e verduras tailandesas obtiveram inibição do crescimento de Colletotrichum capsici de 66 a 93%. Scherm et al. (2003) em trabalho visando a inibição de P. expansum em maçãs por cepas da levedura Candida guillermondii obteve 100% de eficácia, na aplicação da levedura sozinha ou mesmo na presença de aditivos. Santos, Sanchez e Marquina (2004) relataram a inibição de Botrytis cinerea por Pichia membranifaciens utilizando-se tanto células íntegras (diâmetro de inibição de 32 mm), com a toxina killer pura. Entretanto, Zhang et al. (2005) não obtiveram resultados satisfatórios quando da utilização do sobrenadante cultivo de Cryptococcus laurenti, no controle de B. cinerea, embora obtivesse o controle total ao utilizar suspensão de células íntegras, constatando-se ação por competição de nutrientes. Na Argentina Robiglio et al. (2011) em estudo buscando a redução pós-colheita de P. expansum e Botrytis cinerea em pêras armazenadas à frio, apresentaram maior eficácia no controle biológico utilizando as leveduras Aureobasidium pullulans e Rhodotorula mucilaginosa do que uma levedura comercial. Vários mecanismos têm sido relatados como operadores do biocontrole, incluindo antibiose (JANISIEWICZ; ROITMAN, 1988), resistência induzida (EL-GHAOUTH; WILSON; WISNIEWSKI, 1998), parasitismo (WINIEWSKI et al., 1991), bem como competição por espaço e nutrientes (WILSON; WISNIEWSKI, 1989). O modo de ação de influência que microrganismos antagonistas exercem na presença de patógenos ainda não está bem esclarecido (SHARMA; SINGH; SINGH, 2009), isto 22

23 decorre, devido às poucas tentativas de trabalhos que tentem explicar estes mecanismos para melhorar o controle na pós-colheita (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002). Um método alternativo para redução da quantidade de inoculo utilizado para o controle de fungos deteriorantes é a integração da atividade antimicrobiana de antagonistas com cálcio, análogos de açúcar e compostos nitrogenados, desenvolvendo-se assim novos produtos para a proteção de frutos (EL GHAOUTH et al., 2001). Zhang et al. (2005) após estudo relataram que obtiveram maior eficiência com aplicação de Cryptococcus laurentii contra fungo deteriorante de peras, B. cinerea quando em associação com 2% de CaCl 2, após 7 dias de incubação a 25ºC. Em testes realizados por Droby et al. (1997) observou-se a inibição significativa de Penicillium digitatum em uvas quando da aplicação da interação de Pichia guilliermondii e cloreto de cálcio. Wan e Tian (2005) mostraram efetividade na redução de P. expansum e Alternária alternata no controle pós-colheita de peras, com a utilização do aditivo molibdato de amônio (NH 4 Mo) juntamente com a levedura antagonista Rhodotorula glutinis. Na utilização do biocontrolador, Candida sp em suspensão com sorbato de potássio, Karabulut, Lurie e Droby (2001), obtiveram considerável controle do decaimento de qualidade de doces de cerejas. Controle efetivo também foi obtido por Janisiewicz et al. (2003), quando da combinação de M. pulcherrima T5-A2 com aquecimento dos frutos (38ºC por 4 dias) contra Colletotrichum acutatum e P. expansum em maçãs. Em estudo realizado por Calegari, et al (2012) com a utilização das leveduras H. wingei e S. cerevisiae PF2 3 aplicadas em sinergismo com o fungicida Tecto em baixa dosagem em maçãs, foram eficientes no controle in vivo de P. expansum, indicando a possibilidade de aplicação no controle pós-colheita. Oliveira et al. (2011) obteve 100% de positividade para o fator killer quando do isolamento de 24 leveduras a partir de morango tradicional e orgânico contra ao menos uma das leveduras sensíveis padrão utilizadas. Estudos realizados por Coelho (2005) e Coelho et al. (2011) mostraram a inibição de 58,15% da germinação de esporos de Penicillium expansum com sobrenadante do cultivo de Candida guilliermondii obtido após 72 horas a 25 o C, enquanto que Pichia ohmeri (25 o C/48 horas) inibiu o desenvolvimento de hifas do mesmo fungo em 64,37%, ambos associados ao fator killer. Walker et al. (1995) observaram que leveduras killer mostraram grande potencial de inibição do crescimento micelial de Heterobasidion annosum, Rhizoctonia solani, Fusarium equiseti, entre outros fungos filamentosos patogênicos. 23

24 Em trabalho realizado por Portes (2011) de 41 leveduras isoladas, 24 (58,5%) apresentaram inibição contra P. expansum, 25 (61,0%) contra A. ochraceus A152 e 25 (61,0%) contra F. verticillióides 103F em antifungigrama em meio sólido. Sendo que no antifungigrama em meio líquido, a cepa PF4 13, identificada como Kluyveromyces sp., controlou significativamente tanto a germinação de esporos como o desenvolvimento de hifas de P. expansum e A. ochraceus, quando comparado ao controle, com inibição da germinação dos esporos de P. expansum e A. ochraceus de 93,33 e 86,44% respectivamente (96horas/25 C). A constatação da letalidade do fator killer por certas leveduras contra fungos filamentosos tem ampliado ainda mais, no biocontrole de bolores deteriorantes em alimentos e fitopatógenos, as perspectivas de aplicação (JACOBS; VAN VUOREN, 1991). Em suma, o emprego de procedimentos, para uma prevenção precoce da proliferação/invasão de agentes deteriorantes/micotoxigênicos, na superfície das frutas não afetando assim suas características internas bem como sua qualidade nutricional, seria de grande valia para a saúde humana (COELHO; HOFFMANN; HIROOKA, 2003). Antagonistas, sejam integrados através de misturas de leveduras, integração do controle químico/biológico ou integração do controle físico/biológico podem melhorar a eficácia do controle (ARAÙJO, 2007), de modo a tornar ainda mais promissora a utilização dos mesmos. 3.5 ATIVIDADE KILLER Alguns microrganismos antagonistas podem produzir substâncias com capacidade de inibição do crescimento e multiplicação de outros microrganismos denominando-se assim um mecanismo de antagonismo (ROMEIRO, 2007), como por exemplo, a toxina killer que tem ação sobre outras espécies de leveduras, bolores e bactérias podendo levar as outras a morte (ROSA, 2009). Estas substâncias, denominadas metabólitos secundários, são produzidas pelos fungos durante o abrandamento de seu crescimento (MAIN, 2000), ou fase estacionária de crescimento. Segundo Sallen et al. (2010) mais de 300 metabólitos antimicrobianos naturais tem sido relatados, sendo que dentre eles estão os carotenoides e polipeptídeos, geralmente isolados de plantas e microrganismos, os quais apresentam ampla atividade antimicrobiana 24

25 (SENTER, 2010). O uso destas substâncias antimicrobianas, isoladas de alguns microrganismos, se aplica não somente no tratamento humano (penicilina entre outros), mas também podem ser empregadas no combate de algumas pragas, que causam milhões em danos na agricultura, consumindo parte considerável do total produzido no mundo todo (OLIVEIRA, 2009). A capacidade de produção de toxina killer foi descrita pela primeira vez em linhagens de Saccharomyces cerevisiae, em que cepas de S. cerevisiae foram classificadas em três fenótipos: killer, sensível e neutra. Quando as células killer e sensíveis cresciam em um mesmo meio de cultura, certa quantidade das células de leveduras sensíveis era destruída, sendo que as células neutras não matavam células sensíveis e não eram mortas por células killers (BRITES, 2003). Observou-se então que o efeito killer era causado por uma proteína extracelular que se apresentava sensível ao calor e ação de proteases, além de depender de condições de ph e oxigênio (WOODS; BEVAN, 1968; VAZ et al., 2002). O fenômeno killer é amplamente difundido entre muitos gêneros de leveduras, como Sacchamomyces, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Williopsis, Zygosacchoromyces, Hansenula, Kloeckera, Metschnikowia, Rhodothorula, Schwanniomyces, Torulopsis, Trichosporon, Ustilago e Zigowillopsis (MORACE et al., 1984; CHEN et al., 2000; FAZIO, 2009). Muitas toxinas produzidas por leveduras são glicoproteínas formadoras de prótons capazes de originar canais iônicos, causando desestabilização do potencial eletroquímico da membrana podendo causar morte celular (MARTINAC et al., 1990, GOLUBEV, 1998). As toxinas killer são compostas de um peptídeo tóxico, produzido em nível extracelular, com capacidade de inibição de crescimento outros microrganismos (COELHO et al., 2009; SENTER, 2010). Algumas linhagens de leveduras killer matam outras leveduras sensíveis a ela, através da secreção de uma toxina de caráter protéico (ROSA, 2009). As toxinas killer em sua maioria possuem massa molar que varia de 18 a 300 kda, dependendo da espécie de levedura correspondente (SOARES e SATO, 2000). Mesmo com a investigação extensiva da atividade killer em leveduras desde 1963, quando foi descoberta por Bevan e Makower (BEVAN; MAKOWER, 1963), pouco se sabe ainda sobre seu mecanismo de ação (RADLER et al., 1993). Evidências indicam que há uma atuação na membrana de células sensíveis, diminuindo o ph intracelular com consequente extravasamento de íons potássio e ATP (MARTINAC et al., 1990). Sua ação também pode estar baseada em diferentes modos como hidrólise, inibição de síntese da β1-3 glucana, 25

26 principal componente da parede celular, ou até mesmo causando a saída de íons pelo rompimento da membrana plasmática (KAGAN, 1983). A inibição da síntese da β1-3 glucana foi descrita por Rosa (2009), em que na composição da parede celular, de 80 a 90% são carboidratos, estando entre eles a quitina e a β-1,3-glucana bem como algumas proteínas e lipídios, possibilitando assim que o organismo antagonista, produtor de enzimas como quitinase e β-1,3-glucanase, torne-se capaz de atuar inibindo e controlando o desenvolvimento fúngico. Masih e Paul (2002) observaram a produção da enzima β-1,3-glucanase pela levedura Pichia membranifaciens, com ação sobre o fungo B. cinerea, e notaram que a enzima causou coagulação e rompimento citoplasmático das hifas fúngicas. 26

27 4 MATERIAL E MÉTODOS A levedura H. wingei (AM2-2 ), previamente isolada de 15 amostras de milho em trabalho realizado por Gasperini (2011) a partir de uma cooperativa do município de Francisco Beltrão PR foi analisada em relação à presença de fator killer, resistência do fator ao tratamento térmico e inibição por produção de compostos extracelulares bioativos em relação a P. expansum e A. ochraceus. O antifungigrama em meio líquido foi realizado por se tratar de um teste sensível, tornando possível uma quantificação na germinação de esporos e no desenvolvimento das hifas fúngicas (JANISIEWICZ; TWORKOSKI; SHARER, 2000). 4.1 Fungo teste Os micélios fúngicos de Penicillium expansum n. 2 e Aspergillus ochraceus, foram isolados a partir de maçã e frutos de café respectivamente no laboratório de Microbiologia do Departamento de Tecnologia de Alimentos da UEL (Universidade Estadual de Londrina), sendo provenientes de cultura monospórica (NELSON; TOUSSON; MARASAS, 1983), consistiram de cepas básicas utilizadas frente ao efeito de antagonistas, quanto a inibição de crescimento. Os fungos foram mantidos em Ágar Batata Dextrose - BDA inclinado a 4 o C na ausência de luz, e o inoculo padronizado com auxílio de câmara de Newbauer (10 5 esporos/ml) para os testes subsequentes. 4.2 Análise do Potencial Killer A levedura promissora no controle biológico de Penicillium expansum e Aspergillus ochraceus foi caraterizada quanto ao fator killer. A levedura sensível, foi previamente suspensa em 3 ml de solução salina a 0,85% e padronizada na Escala n. o 1 de McFarland (3,0 27

28 x 10 6 células), e então plaqueada por profundidade em placas de Petri contendo 20 ml de ágar Sabouraud adicionado de 0,003% de azul de metileno (POLONELLI et al., 1983). Após a solidificação do ágar, foi inoculada uma alçada de leveduras teste, previamente cultivadas em tubos de Ensaio com ágar Sabouraud glicose, formando pequenos pontos (2,0 mm de diâmetro) na superfície do meio. A leitura foi realizada após incubação a 20 o C por 72 horas, a presença de fator killer se representou pela formação do halo de inibição em torno das leveduras teste (WALKER et al., 1995). O controle positivo utilizado como cultura padrão consistiu de Saccharomyces cerevisiae NCYC-738 e as padrões sensíveis utilizadas para a caracterização do fator killer consistiram de Candida glabrata NCYC-366, C. glabrata NCYC-388, Candida albicans- 12A, Pichia kluyveri CAY-15 e Saccharomyces cerevisiae NCYC Cura da levedura Killer A cura da levedura foi realizada com o intuito de associar o caráter killer quanto a possibilidade da perda de atividade antagônica, ou seja, indicando se a toxina killer é codificada por genes plasmidiais ou cromossomais, conforme descrito por Petering et al. (1991). O processo de cura consistiu no pré-cultivo da levedura a 25 o C overnight em meio YPD Yeast Peptone Dextrose (extrato de levedura 1,0%, peptona bacteriológica 2,0%, glicose 2,0%, ágar 2,0%) com posterior padronização na escala n. o 1 de McFarland, procedendo-se diluições decimais seriadas de 10-1 até Então uma alíquota de 0,1 ml (aproximadamente 3,0 x 10 2 células) foi semeada na superfície de placas contendo meio YPD, seguido de incubação sob tratamento térmico de 37 e 40 o C por 48 horas. Após a realização da cura as cepas termorresistentes foram novamente submetidas ao teste killer e ao antifungigrama em meio líquido, para observar se a levedura manteve suas propriedades inibitórias. 28

29 4.4 Obtenção do extrato bruto Para o pré-inóculo, uma alçada de levedura foi transferida para Erlenmeyer com 25 ml de Caldo Meio Para Levedura (Caldo MPL - glicose 2%, extrato de levedura 0,5%, cloreto de sódio 1%, sulfato de amônio 0,5% e fosfato de sódio monobásico 0,23%) e incubado a 25ºC por 24 horas. O inóculo foi preparado baseando-se na escala de McFarland para bactérias (INSTITUTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS-ITAL, 1995) adaptada para leveduras, recalculando-se para obter os valores de 3 x 10 7 (escala nº 1) a 3 x 10 8 leveduras/ml (escala nº 10), considerando que o tamanho de uma levedura equivale a 10 vezes ao bacteriano (LEVY, 2003). A seguir 3,0 x 10 6 células de leveduras (100 L) foram inoculadas em 5 Erlenmeyers contendo 50 ml de Caldo MPL e em 5 Erlenmeyers contendo 50 ml do mesmo caldo com 10 5 esporos de P. expansum e em 5 Erlenmeyers contendo 50 ml do mesmo caldo com 10 5 esporos de A. ochraceus. Após 24, 48, 72, 96 e 120 horas a 25ºC, os cultivos foram centrifugados (6.500 x g/15 min., 10ºC) e o extrato bruto obtido. 4.5 Antifungigrama em Meio Líquido O antifungigrama em meio líquido foi baseado essencialmente nas metodologias descritas por Janisiewicz, Tworkoski e Sharer (2000) e Chen et al. (1999), seguido de análise microscópica. O extrato bruto filtrado (membrana Millipore 0,20 μm) foi inoculado em volume igual (1,0 ml) de Caldo MPL previamente inoculado com 10 5 esporos de fungo teste. Os tubos de Ensaio foram incubados a 25 o C e analisados em microscópio após 12 horas, determinando-se a germinação dos esporos e tamanho das hifas. Paralelamente preparou-se o controle (branco), inoculando-se 10 5 esporos de fungo em tubos de ensaio contendo 1,0 ml de Caldo MPL e 1,0 ml de água destilada estéril. 29

30 Hansenula wingei (AM2-2 ) Ativação Caldo MPL/25 C/24 h. Escala McFarland nº L (3,0 x 10 6 células) 50 ml Caldo MPL + P. expansum (10 5 esporos) 50 ml Caldo MPL (Controle) 50 ml Caldo MPL + A. ochraceus (10 5 esporos) 25 C 24, 48, 72, 96, 120 horas 6500 x g/15 min., 10 C Filtração (Micropore 0,22 m) 1,0 ml sobrenadante + 1,0 ml MPL esporos P. expansum 25 C/12 horas 1,0 ml sobrenadante + 1,0 ml MPL esporos P. expansum 25 C/12 horas MICROSCOPIA Germinação esporos (%) 100 células Comprimento de Hifas ( m) 40 células Fluxograma 1 - Quantificação de atividade fúngica por meio da porcentagem de germinação de esporos e comprimento de hifas de A. ochraceus e P. expansum em relação ao sobrenadante de levedura. Fonte: Coelho modificado (2005). 30

31 Os resultados foram obtidos perfazendo-se três repetições cada, constituída de quatro dados para a porcentagem de esporos germinados e 40 para a determinação do tamanho de hifas. A determinação do comprimento das hifas foi realizada por meio da medida de 40 hifas selecionadas ao acaso, e a média aritmética utilizada para a comparação. A porcentagem de germinação dos esporos foi baseada na contagem de 100 células, incluindo-se os esporos germinados e os não germinados. Os dados da atividade antifúngica exercida pelas leveduras antagonistas sobre a germinação de esporos e o desenvolvimento de hifas de P. expansum e A. ochraceus foram analisados pelo programa ANOVA/MANOVA (STATISTICA 5.0, 1995) mediante teste de Tukey (P < 0,05). 4.6 Purificação parcial de composto antifúngico A substância inibitória, produzida pela levedura potencialmente antagônica, foi extraída a partir do sobrenadante dos cultivos da levedura. Para tanto o mesmo foi submetido a etapas de ultrafiltração como descrito por Coelho (2005) utilizando-se membranas de exclusão molecular de 30, 10, 5 e 3 kda (celulose, Millipore ) e as frações ultrafiltradas submetidas ao ensaio antifúngico em meio líquido conforme item 4.5, sendo que as mesmas foram codificadas conforme Fluxograma 2. Os dados da atividade antifúngica das frações ultrafiltradas sobre a germinação de esporos e o desenvolvimento de hifas de P. expansum e A. ochraceus foram analisados pelo programa ANOVA/MANOVA (STATISTICA 5.0, 1995) mediante teste de Tukey (P < 0,05). 31

32 Hansenula wingei (AM2-2 ) Ativação Caldo MPL/25 C/24 h. Escala McFarland nº L (3,0 x 10 6 células) 10 Erlenmeyer com 50 ml de Caldo MPL Total de 1000mL de cultivo Incubação 25 C/96horas 6500 x g/15 min., 10 C Filtração (Micropore 0,22 m) Ultrafiltração 10 C Membrana de 30kDa FRAÇÃO I congelamento e acondicionamento 30 ml Ultrafiltração 10 C Membrana de 10kDa FRAÇÃO II congelamento e acondicionamento 30 ml Ultrafiltração 10 C Membrana de 5kDa FRAÇÃO III congelamento e acondicionamento 30 ml Ultrafiltração 10 C Membrana de 3kDa FRAÇÃO IV congelamento e acondicionamento 30 ml Fluxograma 2 Purificação parcial do composto antifúngico da levedura para posteriores análises. 32

33 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO A obtenção da levedura H. wingei (AM2-2 ) deu-se através de trabalhos previamente desenvolvidos no grupo de pesquisa, sendo que a mesma foi isolada, a partir de amostras de milho adquiridas no município de Francisco Beltrão PR, por Gasperini (2011). Cepas de leveduras são classificadas como killer, quando o inóculo é cercado por uma zona clara, na qual não se observa crescimento das cepas sensíveis, delimitado por uma zona de células mortas que pode ser percebido quando na presença de azul de metileno. Quando submetida à análise de potencial killer a levedura H. wingei (AM2-2 ) mostrou-se positiva perante as leveduras sensíveis Candida glabrata NCYC 366 (K3), C. albicans 12A (K8) e Pichia kluyveri (CAY-15), com formação de zona mais clara somente após 120 horas. Quando leveduras atuam contra mais de uma levedura sensível, sugere-se produção de toxina killer com amplo espectro de ação, ou então produção de mais de uma toxina killer, a exemplo de toxinas K1, K2 e K28 produzidas por Saccharomyces cerevisiae (SCHMITT, BREINING, 2002). O fator killer é um elemento geralmente pertencente à categoria de substâncias oriundas de expressão com característica plasmidial, assim podendo ser susceptível a perda de atividade produtora, pela ação do calor, ou mudança das propriedades do meio (GASPERINI, 2011). Após aumento de temperatura de incubação (25 C para 40 C) a levedura H. wingei (AM2-2 ) continuou produzindo zona mais clara contra as sensíveis Candida glabrata NCYC 366 (K3), C. albicans 12A (K8) e Pichia kluyveri (CAY-15) demonstrando que a mesma não perdeu sua capacidade de produzir substâncias killer mesmo após a realização do tratamento térmico. As tabelas 2 e 3 apresentam as médias gerais dos resultados de três repetições, do antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo de H. wingei (AM2-2 ) contra a germinação de esporos e desenvolvimento de hifas dos fungos teste A. ochraceus e P. expansum. Em adição, cultivou-se H. wingei (AM2-2 ) com interação com P. expansum e A. ochraceus, e os sobrenadantes obtidos foram inoculados novamente com o fungo, visando estimular uma maior produção de substância antagônica, associada a um processo induzido. 33

34 Tabela 2 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H. wingei (AM2-2 ) e da interação levedura/p. expansum. Hansenula wingei (AM2-2 ) X P. expansum Incubação Comprimento de hifas ( m) Germinação de esporos (%) (horas) Controle Sobrenadante levedura Sobrenadante Levedura/P. expansum Controle Sobrenadante levedura Sobrenadante Levedura/P. expansum 24 92,54 25,71 ac* 54,61 24,94 da 63,64 23,90 bb 46,67 9,35 aa 38,00 14,64 ba 41,17 11,89 da 48 93,23 31,22 ab 48,21 19,87 ca 48,79 21,90 aa 49,33 6,62 ac 6,33 2,34 aa 25,50 2,43 bcb ,11 44,02 bc 37,82 13,70 ba 51,41 17,43 ab 45,50 13,11 ac 1,50 1,22 aa 26,33 4,93 cb 96 92,20 26,42 ac 0,00 0,00 aa 47,41 15,91 ab 52,17 7,19 ac 0,00 0,00 aa 14,67 6,74 abb ,88 28,76 abc 41,93 16,32 ba 48,90 17,57 ab 47,33 9,44 ab 2,33 1,36 aa 6,83 1,47 aa Ensaio realizado em caldo MPL incubado a 25ºC/12 horas; cada valor corresponde à média dos valores de 120 dados para crescimento de hifas (triplicata, 40 dados por repetição) e 6 dados para germinação de esporos (triplicata, 2 dados por repetição). *Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem significativamente pelo teste de Tukey (P > 0,05). Tabela 3 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H. wingei (AM2-2 ) e da interação levedura/a. ochraceus. Hansenula wingei (AM2-2 ) X A. ochraceus Incubação Comprimento de hifas ( m) Germinação de esporos (%) (horas) Controle Sobrenadante levedura Sobrenadante Levedura/A. ochraceus Controle Sobrenadante levedura Sobrenadante Levedura/A. ochraceus 24 85,56 25,30 ab* 71,64 26,75 ca 80,54 27,16 cb 48,17 11,42 aa 43,33 16,03 ba 41,5 18,55 bca 48 95,29 23,09 bc 58,73 21,27 ba 70,49 27,44 bb 51,67 5,43 ab 37,50 5,79 ba 39,17 8,13 bca ,80 26,61 cc 67,29 22,34 ca 75,06 25,38 bcb 57,00 9,36 ab 5,17 3,25 aa 50,83 1,94 cb 96 96,66 25,44 bc 43,99 15,38 aa 73,46 17,75 bcb 48,33 3,78 ac 16,50 3,15 aa 29,67 5,05 bb ,15 24,95 bcb 39,99 12,76 aa 40,33 13,45 aa 50,50 2,74 ab 14,00 2,00 aa 12,00 5,73 aa Ensaio realizado em caldo MPL incubado a 25ºC/12 horas; cada valor corresponde à média dos valores de 120 dados para crescimento de hifas (triplicata, 40 dados por repetição) e 6 dados para germinação de esporos (triplicata, 4 dados por repetição). *Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem significativamente pelo teste de Tukey (P > 0,05). No ensaio realizado contra P. expansum em relação à inibição do desenvolvimento de hifas, houve uma diferença significativa (P < 0,05) entre o tratamento com sobrenadante da levedura e controle em todos os tempos (24-120h) de incubação, apresentando inicialmente (24h) 40,98% de inibição do desenvolvimento de hifas em relação ao controle, com aumento considerável ao longo dos tempos chegando a inibição máxima de incubação em 96h (inibição de 100% do desenvolvimento de hifas), sendo que em 120h houve uma expressiva queda para o nível de 58,53% (Figura 4). 34

35 Figura 4 - Efeito inibitório do cultivo de H. wingei (L + P) e da interação H. wingei (AM2-2 )/P. expansum (LP + P) no desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de P. expansum (10 5 esporos), após 12 horas/25 C. A utilização do cultivo da levedura na interação com os fungos visando indução a um estímulo adicional à antibiose se mostrou ineficaz, de modo que ambos os sobrenadantes apresentaram atividades similares ou mesmo inferiores, confirmando que a produção de substâncias antagônicas não é estimulada pela presença do fungo teste, conforme relatado por Coelho et al. (2009). A inibição da germinação de esporos e a inibição do desenvolvimento de hifas, na maioria dos tempos de cultivo, se mostraram significativamente maior quando da utilização do sobrenadante obtido exclusivamente do cultivo de H. wingei (AM2-2 ) (P < 0,05, tabela 2), sugerindo que a presença do fungo teste e produção de metabólitos do mesmo, interferiram sobre a ação desempenhada pela substância antagônica produzida pela levedura (MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2003). O cultivo da interação levedura/p. expansum, diferiu significativamente (P < 0,05) do cultivo de sobrenadante de levedura na maioria dos tempos (24, 72, 96 e 120h); por outro lado, não houve diferença significativa entre os dois tratamentos no cultivo de 48h (P > 0,05) (tabela 2). O ensaio do sobrenadante de levedura/p. expansum também diferiu significativamente do controle em relação ao desenvolvimento de hifas em todos os tempos (24-120h), porém apresentando inibição inferior em todos os tempos levando-se em conta o sobrenadante de levedura. O melhor tempo de inibição da interação levedura/p. expansum apresentou-se em 72h (52,88%) para o desenvolvimento de hifas. Em relação à germinação de esporos de P. expansum em relação ao sobrenadante da levedura, observou-se que inicialmente (24h - 17,87% de inibição da geminação) a inibição foi menos eficaz não apresentando diferença significativa em relação ao controle. Porém, a 35

36 partir do cultivo de 48h houve diferença significativa, apresentando aumento considerável da inibição (87,17%), chegando às 96h com 100% de inibição da germinação de esporos, mostrando total eficácia, com uma pequena queda posterior em 120h chegando a 95,08% de inibição da germinação de esporos. Testes de antifungigrama em meio líquido realizados por Janisiewicz, Tworkoski e Sharer (2000) com leveduras do gênero Aureobasidium spp. incubados a 25ºC/24 horas, inibiram a germinação dos esporos de P. expansum em 98%. O cultivo da interação levedura/p. expansum em relação ao cultivo do sobrenadante da levedura apresentou valores inferiores de inibição da germinação de esporos. No entanto obteve-se diferença significativa (P < 0,05) apenas nos tempos de 48, 72 e 96h, com maior porcentagem de inibição em 120h (84,85%) (figura 4). Já no ensaio realizado contra A. ochraceus os resultados apresentaram-se um pouco inferiores, tanto em relação à germinação de esporos quanto, em relação à inibição do desenvolvimento de hifas, comparando-se com os resultados obtidos contra P. expansum. O sobrenadante de levedura obtido contra A. ochraceus apresentou diferença significativa (P < 0,05) em relação ao controle em todos os tempos (24-120h) (figura 5), apresentando-se inibição inicial (24h) de 16,26%, com breve aumento em 48h (38,36%) vindo a culminar em um pico de 59,26% (120h). Os tempos de 96 e 120h não apresentaram diferença significativa, com 54,49 e 59,26% de inibição do desenvolvimento de hifas de A. ochraceus. Figura 5. Efeito inibitório do cultivo de H. wingei (AM2-2 ) (L + A) e da interação H.wingei (AM2-2 )/A. ochraceus (LA + A) no desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de A. ochraceus (10 5 esporos), após 12 horas/25 C. Quando se observou a interação levedura/a. ochraceus presenciou-se diferença significativa entre os tratamentos (cultivo da levedura e interação levedura/bolor) nos tempos de 24-96h, não observando-se diferença apenas em 120h (figura 5). Tal fato evidenciou, de 36

37 modo geral que a interação levedura/fungo teve ação inferior ao tratamento com o extrato bruto obtido do cultivo da levedura isoladamente, tanto o desenvolvimento de hifas, quanto a germinação de esporos. Observando-se a inibição da germinação de esporos de A. ochraceus com a utilização do cultivo do sobrenadante de levedura, não se observou diferença significativa apenas no cultivo de 24h. Houve um aumento da inibição culminado em 72h, um pico de 90,92% da germinação de esporos, com uma posterior pequena queda (96h-65,86%; 120h-72,27%) (figura 5), sendo que a mesma não foi significativa em teste Tukey (P > 0,05). O cultivo da interação levedura/a. ochraceus diferiu significativamente do tratamento do cultivo da levedura isoladamente apenas nos períodos de 72 e 96h, apresentando valores inferiores de inibição da germinação de esporos. Tendo-se assim o pico de inibição em 120h com 58,91% de inibição da germinação com a utilização da interação levedura/bolor (figura 5). De acordo com os resultados obtidos, selecionou-se o cultivo isolado de H. wingei (AM2-2 ) (25 C/96 horas) para a etapa de ultrafiltração, com vistas da utilização das frações parcialmente purificadas no controle de A. ochraceus e P. expansum, que além de inibir a germinação dos esporos e retardar o crescimento de hifas de P. expansum e A. ochraceus, não conteriam metabólitos dos fungos testes, como a patulina e a ocratoxina, micotoxinas geralmente encontradas em frutas, e estudadas por diversos autores devido aos riscos à saúde causados pelas mesmas a humanos e animais (MOAKE, PADILLA-ZAKOUR, WOROBO, 2005). As tabelas 4 e 5 apresentam as médias gerais dos resultados de três repetições, do antifungigrama em meio líquido com as frações ultrafiltradas do sobrenadante do cultivo de H. wingei (AM2-2 ) contra a germinação de esporos e desenvolvimento de hifas dos fungos teste A. ochraceus e P. expansum. A atividade antifúngica com as frações II e III apresentaram maior eficácia para A. ochraceus no desenvolvimento de hifas e germinação de esporos, com diminuição da atividade na fração IV (figura 6). Tal fato sugere que os compostos anti-aspergillus ochraceus possivelmente apresentem massa molar entre 3 e 10kDa. 37

38 Tabela 4 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H. wingei (AM2-2 ) e filtrados obtidos a partir do extrato bruto, contra A. ochraceus. DESENVOLVIMENTO DE HIFAS DE A. ochraceus Tratamentos FRAÇÃO I FRAÇÃO II FRAÇÃO III FRAÇÃO IV Controle de Aspegillus 112,76 19,87 ca* 109,79 22,12 ca 112,19 18,35 ca 112,54 18,21 ca Sobrenadante + Aspergillus 63,18 15,01 ba 59,52 19,34 ba 59,07 14,95 ba 61,15 19,51 ba Filtrado + Aspergillus 35,30 15,73 ab 27,42 7,19 aa 32,56 6,20 ab 47,18 17,19 ac GERMINAÇÃO DE ESPOROS DE A. ochraceus Controle de Aspegillus 77,17 2,48 ca 75,33 2,42 ca 75,00 1,41 ca 75,67 1,87 ca Sobrenadante + Aspergillus 46,83 1,60 ba 48,67 1,96 ba 47,83 1,21 ba 48,67 2,04 ba Filtrado + Aspergillus 19,00 1,41 ac 11,00 2,61 ab 7,50 0,75 aa 28,00 1,41 ad * Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem significativamente pelo teste de Tukey (P > 0,05). Tabela 5 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H. wingei (AM2-2 ) e filtrados obtidos a partir do extrato bruto, contra P. expansum. DESENVOLVIMENTO DE HIFAS DE P. expansum Tratamentos FRAÇÃO I FRAÇÃO II FRAÇÃO III FRAÇÃO IV Controle de Penicillium 96,31 17,83 ca* 98,83 15,83 ca 98,60 19,26 ca 94,60 16,25 ca Sobrenadante + Penicillium 0,00 0,00 ba 0,00 0,00 ba 0,00 0,00 ba 0,00 0,00 ba Filtrado + Penicillium 0,00 0,00 aa 0,00 0,00 aa 0,00 0,00 aa 0,00 0,00 aa GERMINAÇÃO DE ESPOROS DE P. expansum Controle de Penicillium 58,83 2,87 ba 57,5 1,17 ba 62,17 1,47 ba 60,67 1,41 ba Sobrenadante + Penicillium 0,00 0,00 aa 0,00 0,00 aa 0,00 0,00 aa 0,00 0,00 aa Filtrado + Penicillium 0,00 0,00 aa 0,00 0,00 aa 0,00 0,00 aa 0,00 0,00 aa * Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem significativamente pelo teste de Tukey (P > 0,05). Inicialmente (fração I) evidenciou-se que a ação antifúngica sobre o desenvolvimento de hifas (A. ochraceus) do filtrado em relação ao extrato bruto aumentou de 43,96% para 68,69%, culminando em uma inibição de 75,02% (fração II) e vindo a diminuir sua ação inibitória com a utilização das frações III e IV. Como se observou, a maior inibição do desenvolvimento de hifas de A. ochraceus ocorreu quando da utilização da fração II (75,02%) (figura 6). A fração I poderia ter a presença de substâncias interferentes no meio que impediram uma boa atuação, sendo parcialmente eliminadas após a passagem pela membrana de 10 kda. Tal fato explica a melhor ação desta fração, quando comparada com a anterior. 38

39 Já na inibição da germinação de esporos observou-se maior inibição com a utilização da fração III (90%), sugerindo-se assim que possivelmente o composto antifúngico de maior ação contra A. ochraceus tem massa molar inferior a 10kDa e superior a 3Kda. Porém, como constata-se que a inibição a partir da fração IV não foi suspensa, sugere-se a presença de outros compostos antifúngicos com massas molares menores, de maneira que os filtrados da membrana utilizada posteriormente continuariam inibindo tanto a germinação de esporos, quanto o desenvolvimento de hifas de A. ochraceus, mesmo que com menos eficácia (Figura 6). S + A S + A Figura 6 - Efeito inibitório do sobrenadante de H. wingei (AM2-2 ) (S + A) e das frações filtradas (F + A) sobre o desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de A. ochraceus (10 5 esporos), após 12 horas/25 C. Observou-se que a inibição, tanto para o desenvolvimento de hifas quanto para a germinação de esporos de A. ochraceus, pelo sobrenadante da levedura quando da utilização como controle para a realização do teste com as frações ultrafiltradas, apresentou uma pequena queda, que poderia ser explicado pelas ações repetidas de congelamento e descongelamento do extrato bruto durante a realização dos experimentos com as frações ultrafiltradas. Quando observa-se o resultados obtidos com o Penicillium, nota-se que mesmo após a realização das ultrafiltrações o fungo continuou a ser inibido totalmente (100% de inibição), tanto para a germinação de esporos quanto para o desenvolvimento de hifas, como ocorreu com o extrato bruto da levedura (25 C/96h). Sugere-se assim que isto pode ter ocorrido devido a grande sensibilidade do P. expansum o fator killer, bem como devido a possível presença de um ou mais compostos antifúngicos com massa molar inferior a 3kDa, além do composto que teve grande ação sobre o A. ochraceus, necessitando-se de estudos posteriores para uma maior análise. 39