FATORES HOMÓLOGOS AOS FATORES DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICOS SÃO EXPRESSOS EM FOLÍCULOS ANTRAIS E CORPOS LÚTEOS BOVINOS ISABELA BAZZO DA COSTA

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA-FMVZ FATORES HOMÓLOGOS AOS FATORES DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICOS SÃO EXPRESSOS EM FOLÍCULOS ANTRAIS E CORPOS LÚTEOS BOVINOS ISABELA BAZZO DA COSTA BOTUCATU SP 2008

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA-FMVZ FATORES HOMÓLOGOS AOS FATORES DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICOS SÃO EXPRESSOS EM FOLÍCULOS ANTRAIS E CORPOS LÚTEOS BOVINOS ISABELA BAZZO DA COSTA Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Medicina Veterinária, Área de Reprodução Animal. Orientador: Prof. Dr. José Buratini Jr. BOTUCATU SP 2008

3 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus Costa, Isabela Bazzo da. Fatores homólogos aos fatores de crescimento fibroblásticos são expressos em folículos antrais e corpos lúteos bovinos / Isabela Bazzo da Costa. Botucatu [s.n.], Tese (doutorado) Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, Orientador: José Buratini Junior Assunto CAPES: Bovino - Reprodução 2. Expressão gênica CDD Palavras-chave: Bovino; Corpo lúteo; Expressão gênica; Fatores homólogos aos fatores de crescimento fibroblásticos; Folículos antrais

4 É melhor atirar-se na luta em busca de dias melhores mesmo correndo o risco de perder tudo, do que permanecer estático e igual aos pobres de espírito, que não lutam, mas também não vencem. Não sentem a dor da derrota, mas não tem a glória de ressurgir dos escombros. Esses pobres de espírito ao final da jornada na terra não agradecem a Deus por ter vivido, mas se desculpam entre eles por haver simplesmente passado pela vida. Bob Marley

5 A toda minha família, em especial à minha mami, que me incentivou a começar e, ao José Victor, meu filho amado, que não me deixou parar. Dedico.

6 AGRADECIMENTOS Primeiramente à Deus, quem tornou todas as minhas realizações possíveis, quem colocou em meu caminho somente obstáculos transponíveis e quem garantiu momentos inesquecíveis de alegria ao lado de pessoas maravilhosas que acompanharam a minha trajetória; Ao meu filho José Victor, por ser assim... do jeitinho que eu pedi para Deus. Te amo muito!!! Aos meus pais, Ana e José, exemplos de caráter e dedicação, que possuem como meta principal de suas vidas a formação de suas filhas, e em nossas conquistas, a principal recompensa; A minha querida avó Maria, que de algum lugar hoje e sempre, reza e sorri para mim. Saudades!!! Aos meus irmãos João Batista, Rosana e Cristiane, amigos de todas as horas, que mesmo longe, sempre estiveram presentes; Ao meu sobrinho Luquinhas, por fazer a minha vida mais feliz; Aos meus cunhados Afonso e Fabiano por todo o apoio e carinho que sempre me dedicaram;

7 Ao meu orientador Prof. Dr. José Buratini Jr. pela contribuição no meu crescimento profissional e científico e, fundamentalmente pela paciência para a realização desse trabalho. Obrigada por me ajudar a escrever parte da minha vida... À minha irmãzinha Ines por todo incentivo, amizade e companheirismo; Aos meus amigos queridos de Lab Bura, Anthony, Mari e Diego; sem os quais este trabalho seria impossível, minha eterna gratidão. Vocês são muito especiais!!! Às minhas amigas Paula e Rúbia, por serem tão queridas e pela valiosa ajuda no laboratório; Aos meus amigos de república, Juliana, Amanda, Liguito, Carol, Nana e Jean por me acolherem não só na casa, mas também no coração. A todos os meus amigos pessoais, por torcerem por mim; Ao Dr. Christopher A. Price da Universidade de Montreal pela amizade, consideração, auxílio e ensinamentos transmitidos durante o desenvolvimento do projeto de pesquisa. Muito obrigada também a toda sua equipe por cuidarem de mim durante minha estada em seu laboratório; Ao Prof. Dr. Ciro Moraes Barros e toda sua equipe, do Departamento de Farmacologia (Unesp-Botucatu), pela amizade, consideração, colaboração e por permitir o nosso acesso constante ao seu laboratório.

8 À Profª. Drª. Renee Laufer Amorim, do Departamento de Patologia da FMVZ - UNESP Botucatu, pelo imensurável auxílio na realização da imunohistoquímica, parte do meu experimento de doutorado; Ao Prof. Dr. José Fernando Garcia UNESP Araçatuba, pela realização do seqüenciamento dos genes estudados; Aos professores e amigos do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - FMVZ - UNESP - Botucatu, pelos agradáveis momentos de convivência, por tornar o aprendizado mais divertido e pela amizade e respeito demonstrados. Aos professores e amigos do Departamento de Fisiologia do Instituto de Biociências - UNESP - Botucatu, pela amizade e colaboração; Aos professores e amigos do Departamento de Farmacologia do Instituto de Biociências - UNESP - Botucatu, pela amizade e apoio durante o desenvolvimento do projeto de pesquisa; Aos funcionários do Departamento de Fisiologia, do Departamento de Física e Biofísica e do Departamento de Farmacologia, em especial, Janete, Cris, Paulão, Luís e Luciana (Instituto de Biociências - UNESP - Botucatu), pela amizade e apoio; À Denise, Maria e José Roberto da pós-graduação, pelas inúmeras vezes que me ajudaram e pela atenção dedicada no dia-a-dia a todos os pós-graduandos;

9 Aos proprietários e funcionários do Frigorífico Frigol de Lençois Paulista-SP, pelo apoio à pesquisa, pelo carinho e compreensão que sempre tiveram com os alunos do Prof. Dr. José Buratini Júnior; Ao Prof. Dr. Vilceu Bordighon e sua equipe por toda atenção que em deram durante minha estada em seu laboratório. Aos membros da minha banca de defesa, Sony Dimas Bicudo, Valério Portela, Roberto Sartori, Marcelo Nogueira e suplentes pela disponibilidade e sugestões. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa no meu doutorado. Aos que aqui não foram mencionados, mas que de alguma forma me ajudaram na realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.

10 SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Desenvolvimento Folicular Desenvolvimento Luteínico O sistema FGF Papel dos FGFs e seus receptores no desenvolvimento folicular antral FGFs e seus receptores no desenvolvimento luteínico Fatores de crescimento homólogos aos FGFs OBJETIVOS E HIPÓTESES MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Obtenção dos folículos antrais e corpos lúteos Extração de RNA total Radioimunoensaio RT-PCR em tempo real...24

11 Protocolo DNAse I Reação de Transcrição reversa (RT) Validação da PCR em tempo real Cultivo de células da granulosa FSH e IGF Investigação da expressão protéica por imunohistoquímica Análise dos dados RESULTADOS 5.1. Expressão do RNAm do FHF Expressão do RNAm do FHF Expressão do RNAm do FHF Expressão do RNAm do FHF Expressão do RNAm dos FHFs no desenvolvimento do corpo lúteo Expressão protéica do FHF DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS...29

12 COSTA, I.B. FATORES HOMÓLOGOS AOS FATORES DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICOS SÃO EXPRESSOS EM FOLÍCULOS ANTRAIS E CORPOS LÚTEOS BOVINOS. Botucatu, Tese (Doutorado em Reprodução Animal) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FMVZ, Universidade Estadual Paulista - UNESP. RESUMO Vários membros da família dos fatores de crescimento fibroblásticos (FGFs) estão envolvidos na regulação da função ovariana. No entanto, uma pequena subfamília dos FGFs conhecida como Fatores Homólogos aos Fatores de Crescimento Fibroblásticos (FHFs) as quais são proteínas não secretadas, estão altamente expressas no desenvolvimento e maturação do sistema nervoso. Sabe-se que nos neurônios os FHFs se ligam a proteínas mediadoras da cascata MAP quinase e a canais de sódio voltagemdependentes, mas suas funções fisiológicas precisam ser melhor elucidadas. Ainda não foi investigada a expressão dos FHFs em tecidos reprodutivos bovinos. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão do RNAm dos FHFs (FHF-1 a 4) e da proteína do FHF-2, em células da granulosa (CG), células da teca (CT) e corpos lúteos (CL) bovinos, e ainda determinar se a expressão do RNAm dos FHFs em CG cultivadas é regulada na presença de FSH e IGF-1. Para tanto, CG, CT e CL foram obtidos de ovários de abatedouro para a extração do RNA total. Dez CL de cada estágio (estágio 1: corpo hemorrágico; estágio 2: CL em desenvolvimento; estágio 3: CL maduro; estágio 4: CL em regressão) foram selecionados para a extração do RNA total. CG e CT foram dissecadas individualmente de folículos antrais >5mm e submetidas ao protocolo de extração de RNA total. Os folículos foram agrupados de acordo com o diâmetro (pequeno: 5-7mm; médio: 8-10mm; grande: >10mm) e estágio de desenvolvimento (saudáveis: >1; transicional: 0,01-1; atrésicos: <0,01). As concentrações de estradiol e progesterona foram mensuradas no fluido folicular por RIA. Para investigar a regulação da expressão do RNAm dos FHFs pelo FSH e IGF-1, CG de folículos de 2 a 5mm foram cultivadas em meio suplementado com FSH (0, 0,1, 1, 10 ou 100ng/ml) ou IGF-1 (0, 5, 10, 50 ou 100 ng/ml). A expressão do RNAm dos FHFs foi examinada por RT- PCR em tempo real utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos e como controles endógenos GAPDH para CG, CYC-A para CT e CL e H2A para CG cultivadas. A presença da proteína (FHF-2) foi investigada por imunohistoquímica

13 utilizando anticorpos comerciais. Os dados foram analisados por ANOVA e quando houve efeito os grupos foram comparados pelo teste de Tukey Krammer. A expressão do RNAm do FHF-1 não foi variável em CT, mas sim na interação entre os grupos de diâmetro e desenvolvimento folicular em CG, sendo a maior expressão conforme o folículo cresceu e se diferenciou. Ainda foi observado aumento na expressão do FHF-1 em CG cultivadas com FSH. A expressão do FHF-2 diminuiu de acordo com o estágio de desenvolvimento folicular tanto em CT quanto em CG, sendo maior em folículos atrésicos grandes. Não houve expressão em CG cultivadas. A expressão do RNAm do FHF-3 foi menor em CT de folículos médios quando analisado o estágio de desenvolvimento e aumentou com o diâmetro em folículos saudáveis nas CG. Em CG cultivadas com FSH, a expressão do FHF-3 foi menor no tratamento de 0.1ng/ml. A expressão do FHF-4 foi detectada sem alterações em CT e em CG cultivadas com IGF- 1, e diminuiu em CG de acordo com o estágio de desenvolvimento folicular. A expressão dos FHFs foi estável ao longo do desenvolvimento do CL, exceto para o FHF-1, que demonstrou maior expressão no estágio 1 em relação ao estágio 3. A análise imunohistoquímica confirmou a presença da proteína (FHF-2) nos tipos celulares em que o RNAm foi detectado. Os presentes dados mostram que há diferentes padrões de expressão entre os FHFs em folículos antrais e corpos lúteos bovinos, sendo que o FHF- 1 foi regulado em folículos saudáveis grandes e o único que variou ao longo do desenvolvimento luteínico, bem como o FHF-2 e 4 em atrésicos. Além disso, os mecanismos de controle de expressão para todos os FHFs em folículos antrais e corpos lúteos bovinos também parecem variar. Em conclusão, estas informações sugerem papéis diferentes dos FHFs na regulação do desenvolvimento folicular e luteínico, bem como na atresia em bovinos. Palavras chave: Bovino; Corpo Lúteo; Expressão gênica; Fatores Homólogos aos Fatores de Crescimento Fibroblásticos; Folículos antrais.

14 COSTA, I.B. FIBROBLAST HOMOLOGOUS FACTORS ARE EXPRESS IN BOVINE ANTRAL FOLLICLES AND CORPORA LUTEA. Botucatu, Thesis (PhD in Animal Reproduction) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FMVZ, Universidade Estadual Paulista - UNESP. ABSTRACT Several members of the fibroblast growth factor (FGF) family are involved in the regulation of ovarian function. However, the small FGF subfamily encodes nonsecreted proteins otherwise known as FGF homologous factors (FHF) that are mostly expressed in the developing and mature nervous system. It is known that within neurons, FHFs bind to MAPK scaffold proteins and to voltage-gated sodium channels, but their physiological functions need to be elucidated. FHFs have not been investigated in bovine reproductive tissues. The small FGF subfamily that encodes non-secreted proteins otherwise known as FGF homologous factors (FHFs) has not been investigated in bovine reproductive tissues. The aims of this study were to assess FHFs (1-4) mrna and protein (FHF-2) expression in granulosa (GC), theca cells (TC) and corpora lutea (CL) from bovine ovaries and to determine if expression in GC is regulated by FSH and IGF-1. Antral follicles and corpora lutea were dissected from bovine ovaries obtained at a local abattoir for total RNA extraction. Ten CL from each of four developmental stages (stage 1, corpus hemorragicum; 2, developing CL; 3, mature CL; and 4, regressing CL) were selected for RNA extraction. TC and GC cells were dissected from individual antral follicles larger than 5mm and submitted to total RNA extraction. Follicles were grouped according to size (small: 5-7mm; medium: 8-10mm; large: bigger than 10mm) and health status based on the ratio between concentrations of estradiol and progesterone measured by RIA in the follicular fluid (healthy: higher than 1; transitional: ; atretic: lower than 0.01). To investigate regulation of FHFs mrna by FSH and IGF-1, GC from small follicles (2-5 mm) were placed into serumfree medium supplemented with insulin and bovine FSH (0, 0.1, 1, 10 or 100 ng/ml) or IGF-1 (0, 5, 10, 50 or 100 ng/ml). FHFs gene expression was examined by semiquantitative real time RT-PCR using bovine-specific primers and GAPDH, cyclophilin A and histone H2a as endogenous controls for GC, TC and CL, and cultured GC, respectively. FHF-1 mrna was detected without changes in TC, but increased

15 with health status and size in GC. Culture data revealed that FHF-1 expression is upregulated by FSH but not by IGF-1. FHF-2 mrna expression decreased with health status in both GC and TC, where it was highest in large atretic follicles, and was not significantly altered by FSH or IGF-1 in cultured GC. In TC, FHF-3 mrna expression decreased with health status in medium follicles and increased with size in healthy follicles, whereas it increased with size in GC. FSH had a biphasic effect on FHF-3 expression that was lower at the 0.1 ng/ml dose in cultured GC. Lastly, FHF-4 mrna expression did not vary in TC, but decreased with health status in GC. IGF-1 but not FSH decreased FHF-4 mrna levels in cultured GC. FHFs expression did not vary with development stage, except for FHF-1, that was higher in stage 1 than in stage 3. Immunohistochemical analysis revealed the presence of the FHF-2 protein in bovine GC, TC and in small and large luteal cells. In conclusion, the expression patterns differ between FHFs during antral follicle development. Whilst FHF-1 is upregulated in healthier and larger follicles, FHF-2 and FHF-4 are enhanced in atretic follicles. Moreover, the controlling mechanisms of mrna expression also seem to vary between FHFs in GC. Key words: Gene expression; fibroblast homologous factors (FHFs); Antral follicles, Corpora lutea; Bovine.

16 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representação das subfamílias dos FGFs. Destaque à subfamília FGF-11, constituída pelo FGF-11, 12, 13 e 14 (FHF-3, 1, 2 e 4, respectivamente). Adaptado de Ornitz & Itoh (2004)...17 Figura 2. Demonstração das regiões de similaridade entre as duas isoformas dos FHFs e entre os FGFs. Adaptada de Goldfarb (2005)...18 Figura 3. Morfologia externa e interna de CL bovinos nos quatro estágios de desenvolvimento luteínico. Estágio 1 (A e B); estágio 2 (C e D); estágio 3 (E e F) e estágio 4 (G e H)...26 Figura 4. Modelo matemático da expressão relativa por PCR em tempo real. A razão de um gene alvo é expressa em uma amostra em relação à amostra controle e à expressão do gene endógeno. E target é a eficiência do transcrito do gene alvo; E ref é a eficiência do transcrito do gene referência; ΔCP target é desvio de CP do controle amostra do gene alvo transcrito; ΔCP ref é desvio de CP do controle amostra do gene referência transcrito...31 Figura 5. Resultados da amplificação por PCR em tempo real do FHF-1 em folículos antrais (A e B: curvas de amplificação do FHF-1 em CT e CG, respectivamente)...34 Figura 6. Expressão do RNAm do FHF-1 em CT (A) e CG (B) nos diferentes estádios do desenvolvimento folicular. Valores entre parênteses representam o número de amostras...35

17 Figura 7. Expressão do RNAm do FHF-1 em CT (A) e CG (B) de acordo com o diâmetro folicular. Valores entre parênteses representam o número de amostras...35 Figura 8. Efeitos do FSH e do IGF-1 sobre a expressão gênica do FHF-1 em células da granulosa bovina cultivadas (n= 3)...36 Figura 9. Resultados da amplificação por PCR em tempo real do FHF-2 em folículos antrais (A e B: curvas de amplificação do FHF-2 em CT e CG, respectivamente)...36 Figura 10. Expressão do RNAm do FHF-2 em CT (A) e CG (B) nos diferentes estádios do desenvolvimento folicular. Valores entre parênteses representam o número de amostras...37 Figura 11. Expressão do RNAm do FHF-2 em CT (A) e CG (B) de acordo com o diâmetro folicular. Valores entre parênteses representam o número de amostras...38 Figura 12. Regulação da expressão gênica do FHF-2 pelo FSH e IGF-1 em células da granulosa bovina cultivadas (n= 3)...38 Figura 13. Resultados da amplificação por PCR em tempo real do FHF-3 em folículos antrais (A e B: curvas de amplificação do FHF-3 em CT e CG, respectivamente)...39 Figura 14. Expressão do RNAm do FHF-3 em CT (A) e CG (B) nos diferentes estádios do desenvolvimento folicular. Valores entre parênteses representam o número de amostras...40

18 Figura 15. Expressão do RNAm do FHF-3 em CT (A) e CG (B) de acordo com o diâmetro folicular. Valores entre parênteses representam o número de amostras...40 Figura 16. Regulação da expressão gênica do FHF-3 pelo FSH e IGF-1 em células da granulosa bovina cultivadas (n= 3)...41 Figura 17. Resultados da amplificação por PCR em tempo real do FHF-4 em folículos antrais (A e B: curvas de amplificação do FHF-4 em CT e CG, respectivamente)...41 Figura 18. Expressão do RNAm do FHF-4 em CT (A) e CG (B) nos diferentes estádios do desenvolvimento folicular. Valores entre parênteses representam o número de amostras...42 Figura 19. Expressão do RNAm do FHF-4 em CT (A) e CG (B) de acordo com o diâmetro folicular. Valores entre parênteses representam o número de amostras...43 Figura 20. Regulação da expressão gênica do FHF-4 pelo FSH e IGF-1 em células da granulosa bovina cultivadas (n= 3)...43 Figura 21. Expressão do RNAm do FHF-1, 2, 3 e 4 em diferentes estádios do desenvolvimento luteínico...44 Figura 22. Imunolocalização do FHF-2 no ovário bovino. A proteína do FHF-2 foi detectada em células da granulosa (CG; quadro A), células da teca (CT; quadro A) e

19 corpo lúteo (CL; quadro C). O controle negativo para FHF-2 está representado no quadro B...45

20 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados na PCR em tempo real para amplificação do GAPDH, CYC-A, H2A, FHF-1, FHF-2, FHF-3 e FHF Tabela 2. Valores de eficiência de amplificação dos genes-alvo nos tecidos analisados...30 Tabela 3. Expressão relativa do RNAm do FHF-1 (média ± EPM) em CT. Valores entre parênteses representam o número de amostras...34 Tabela 4. Expressão relativa do RNAm do FHF-1 (média ± EPM) em CG. Valores entre parênteses representam o número de amostras...35 Tabela 5. Expressão relativa do RNAm do FHF-2 (média ± EPM) em CT. Valores entre parênteses representam o número de amostras...37 Tabela 6. Expressão relativa do RNAm do FHF-2 (média ± EPM) em CG. Valores entre parênteses representam o número de amostras...37 Tabela 7. Expressão relativa do RNAm do FHF-3 (média ± EPM) em CT. Valores entre parênteses representam o número de amostras...39 Tabela 8. Expressão relativa do RNAm do FHF-3 (média ± EPM) em CG. Valores entre parênteses representam o número de amostras...40

21 Tabela 9. Expressão relativa do RNAm do FHF-4 (média ± EPM) em CT. Valores entre parênteses representam o número de amostras...42 Tabela 10. Expressão relativa do RNAm do FHF-4 (média ± EPM) em CG. Valores entre parênteses representam o número de amostras...42

22 1. INTRODUÇÃO O ovário é um órgão em constante transformação que apresenta continuamente crescimento e regressão de folículos e corpos lúteos. Os mecanismos controladores do desenvolvimento folicular e luteínico ainda não foram completamente esclarecidos, mas sabe-se que além da ação endócrina fundamental das gonadotrofinas, fatores de crescimento produzidos localmente têm importante função no controle parácrino e autócrino do desenvolvimento folicular e luteínico, dentre eles os fatores de crescimento fibroblásticos (MCNATTY et al., 1999; WEBB et al., 2003). Sendo assim, uma compreensão mais ampla da fisiologia ovariana, requer informações sobre quais fatores de crescimento estão envolvidos e que funções desempenham. Avanços nos conhecimentos sobre a fisiologia folicular e luteínica são necessários para o progresso das biotécnicas da reprodução que otimizam a exploração do potencial genético de fêmeas superiores e de espécies ameaçadas de extinção. Sendo assim, o progresso da fisiologia ovariana pode beneficiar tanto a produção de alimentos de origem animal quanto à preservação da biodiversidade. Os fatores de crescimento fibroblásticos constituem uma família de proteínas composta por 25 membros (FGF1-25; KATOH & KATOH, 2005), que participam dos processos celulares de proliferação, diferenciação e angiogênese, mediante a ativação de receptores de alta afinidade codificados por quatro genes distintos (FGFR1-4; SLEEMAN et al., 2001). Diversos estudos indicam a participação do FGF-1, 2, 7, 8 e 10 no controle da foliculogênese em bovinos (PARROTT et al., 1994; MCNATTY et al., 1999; BERISHA et al., 2004; BURATINI et al., 2005). Além disso, a expressão do RNAm de alguns FGFs e seus receptores também foi detectada em corpos lúteos (CL) bovinos, indicando sua participação no controle do desenvolvimento luteínico (BERISHA et al., 2004; CASTILHO et al., 2008 ; GUERRA et al., 2008). Recentemente, um grupo de proteínas semelhantes estruturalmente aos FGFs foi descrito e denominado de fatores homólogos aos fatores de crescimento fibroblásticos (FHFs). Contudo, acredita-se que essas proteínas tenham características funcionais distintas das dos FGFs, pois elas não são secretadas e, portanto, devem desempenhar

23 funções intracelulares ainda pouco conhecidas. Os FHFs são expressos principalmente no sistema nervoso, onde parecem ser fundamentais para o seu desenvolvimento (HARTUNG, 1997). Em tecidos reprodutivos, sua expressão já foi detectada em testículos murinos e humanos, bem como em tumores ovarianos (GREENE, 1998; YAMAMOTO et al., 2000; GOLDFARB, 2007). Contudo, ainda não se sabe se estes fatores estão expressos e desempenham funções controladoras da atividade ovariana fisiológica. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi investigar a expressão dos FHFs ao longo do desenvolvimento folicular antral e luteínico de bovinos.

24 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Desenvolvimento Folicular O desenvolvimento folicular é um processo contínuo que envolve a formação, ativação, crescimento e maturação dos folículos indo desde a formação do folículo primordial até o momento em que ocorre a ovulação (MONNIAUX et al., 1997; VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). A duração desse processo varia de acordo com a espécie e é superior à duração do ciclo estral (MONNIAUX et al., 1997). Em fêmeas mamíferas, o desenvolvimento folicular se inicia ainda na vida fetal quando as células germinativas, oriundas do saco vitelínico, migram para a crista genital, perdem motilidade e sofrem extensiva proliferação celular e redistribuição de organelas citoplasmáticas, diferenciando-se em oogônias (SADEU et al., 2006). A população de oogônias cresce por divisões mitóticas até que, a partir do início da meiose, essas células recebem a denominação de oócitos primários (PICTON, 2001). Estes oócitos primários são rodeados por uma estreita camada de células da granulosa constituindo os folículos primordiais (FORTUNE, 2003). Uma vez estabelecida a população de folículos primordiais, de forma gradual e contínua, alguns destes folículos deixam o grupo dos quiescentes e começam a se desenvolver, assumindo, seqüencialmente, as condições de folículos primários e secundários (fase pré-antral) e terciários (fase antral; VAN DER HURK et al., 1997). Os fatores e mecanismos responsáveis pela ativação dos folículos primordiais, bem como os mecanismos envolvidos na variação do período de início do desenvolvimento folicular ainda não foram esclarecidos, representando uma das maiores questões relacionadas com a fisiologia ovariana (FORTUNE et al., 2000). Entretanto, estudos indicam que o desenvolvimento folicular pré-antral independe de estímulo gonadotrófico agudo (MCNATTY et al., 2006), mesmo estando expressos nestes folículos os receptores para FSH (FSHR; BAO & GARVERICK, 1998).

25 Por outro lado, são muitos os peptídeos intraovarianos apontados como reguladores do desenvolvimento folicular na fase pré-antral e início da fase antral, dentre eles o KL ( kit ligand ), fatores de crescimento transformantes β (TGF-β), fator de crescimento diferencial 9 (GDF-9), as proteínas morfogenéticas ósseas (BMP), a ativina, a inibina, fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF) e suas proteínas ligantes (IGFBP), fatores de crescimento epidermal (EGF) e fatores de crescimento fibroblásticos (FGFs; FINDLAY, 1994; VAN DER HURK et al., 1997; MONNIAUX et al., 1997ab; BURATINI et al., 2005a; WEBB et al., 2006). Distintamente, a regulação do desenvolvimento folicular antral depende da ação das gonadotrofinas (FSH e LH) em combinação com hormônios esteróides ovarianos (estradiol e progesterona) e fatores ovarianos de ação autócrina e parácrina (FORTUNE, 1994; GONG et al., 1996; WEBB et al., 2006). Acredita-se que estes fatores de ação local mediem e modulem a ação das gonadotrofinas (MONNIAUX et al., 1997; CAMPBELL et al., 1999). Os folículos antrais se caracterizam pelo aparecimento de cavidades preenchidas de secreção líquida, denominadas antro folicular (CALLEJAS, 2001). À medida que o folículo se desenvolve, as células da granulosa dividem-se em dois sub-tipos morfológica e funcionalmente distintos: as células da granulosa do cumulus, de contato íntimo com o oócito, formando o complexo cumulus-oócito (CCO); e as células da granulosa murais, que estão alinhadas na parede folicular formando um epitélio estratificado com a membrana basal (GILCHRIST et al., 2004). Externamente ainda existem duas camadas de células da teca, a interna e a externa, com atividade transcricional e esteroidogênica distinta da das células da granulosa (FIGUEIREDO et al., 1995; LATHAM et al., 1999). O desenvolvimento dos folículos antrais se dá em ondas foliculares. A emergência das ondas foliculares é desencadeada por um aumento nas concentrações plasmáticas de FSH, constituindo o recrutamento folicular, entendido como o crescimento sincronizado de folículos antrais jovens (FORTUNE, 1994; ADAMS et al., 2008). Em espécies monovulatórias como a bovina, apenas um folículo é selecionado e passa a exercer dominância sobre os demais que compõem a onda folicular (GINTHER et al., 1996). Através da secreção de estradiol e inibina, o folículo dominante causa

26 redução dos níveis circulantes de FSH, que se tornam insuficientes para a manutenção do crescimento dos folículos subordinados (GINTHER et al., 1996). A maioria dos folículos recrutados interrompe o seu crescimento durante o declínio das concentrações plasmáticas de FSH (MIHM et al., 2003). Esta fase é definida como desvio folicular, a partir da qual o folículo dominante continua a crescer, enquanto que os folículos subordinados iniciam o processo de atresia (FORTUNE et al., 1991; GINTHER et al., 2001). A atresia é um processo fisiológico degenerativo ou apoptótico que compromete a maioria dos folículos ovarianos, aproximadamente 99,9%, a chegarem ao estádio préovulatório (revisado por ADAMS et al., 2008). A progressão da apoptose ocorre dependentemente de uma regulação cooperativa de diferentes fatores endócrinos, parácrinos e autócrinos (HSU & HSUEH, 2000). Dentre os fatores de sobrevivência folicular incluem-se, as gonadotrofinas (FSH e LH), o estradiol e fatores de crescimento como o IGF-1 e o FGF-2 (AMSTERDAN et al., 2003; QUIRK et al., 2004). O envolvimento do sistema composto pelos fatores de crescimento semelhante à insulina (IGF) também foi citado como fatores essenciais na seleção do folículo dominante (PORETSKY et al., 1999; FORTUNE et al., 2001 e GINTHER et al., 2001). Os membros deste sistema já caracterizados nos folículos bovinos incluem os dois tipos de peptídeos (IGF-I e IGF-II), dois receptores (tipo 1 e tipo 2), seis proteínas específicas de ligação aos IGFs (IGFBP-1 a 6), além da proteína plasmática associada à gestação-a (PAPP-A; SPICER & ECHTERNKAMP 1995; RIVERA et al., 2001; MAZERBOURG et al., 2001). Embora a concentração de IGF total não tenha se mostrado diferente no fluido folicular de folículos dominantes em relação a folículos subordinados (DE LA SOTA et al., 1996), a concentração de IGF-1 livre foi maior no fluido folicular do maior folículo comparado ao segundo maior da mesma onda, antes mesmo da observação de diferenças na concentração de estradiol ou no diâmetro (BEG et al., 2002; GINTHER et al., 2004), sugerindo uma associação entre o IGF no fluido folicular e a seleção do folículo dominante em bovinos (PORETSKY et al., 1999; FORTUNE et al., 2001 e GINTHER et al., 2001). Já as IGFBPs estão presentes em maior concentração no fluido

27 folicular de folículos subordinados em relação ao folículo dominante (ECHTERNKAMP et al., 1994; DE LA SOTA et al., 1996; STEWART et al., 1996; MIHM et al., 2000; AUSTIN et al., 2001; BEG et al., 2001). Essa família de proteínas liga-se com alta afinidade aos IGF-1 e IGF-2 e impedem a ligação dos IGFs aos seus receptores (IGFR-1 e IGFR-2) regulando assim a biodisponibilidade de IGF (MONGET et al., 1996). A seleção folicular está associada à liberação de IGF-1, devido à degradação da IGFBP-4 e IGFBP-5 pela PAPP-A que é uma enzima específica de degradação destes ligantes bovinos (MAZERBOURG et al., 2001; MIHM et al., 2002; FORTUNE et al., 2004). Enquanto isso, no folículo subordinado a concentração de IGF livre diminui devido a um aumento nas concentrações de IGFBP-4 e 5, restringindo assim a biodisponibilidade de IGF (FORTUNE et al., 2004), sendo essenciais para o desvio e a continuidade do desenvolvimento folicular após a diminuição dos níveis de FSH (MIHM et al., 2002; FORTUNE et al., 2004). Finalmente, se a regressão luteal ocorre ainda durante a fase de crescimento do folículo dominante, a queda dos níveis de progesterona permite o aumento da freqüência dos pulsos de LH, culminando no pico de LH necessário à ovulação e à maturação oocitária com retomada da meiose que havia sido interrompida no início do desenvolvimento folicular. Caso contrário, o folículo dominante regride e deixa de inibir a secreção de FSH, possibilitando a emergência de uma nova onda folicular (MONNIAUX et al., 1997ab) Desenvolvimento Luteínico O desenvolvimento luteínico tem início com a ovulação de um folículo dominante após ter cumprido as fases pré-antral e antral do seu desenvolvimento. Dentre os fatores que regulam este desenvolvimento e a atividade luteínica, destacam-se o hormônio luteinizante (LH) e o hormônio do crescimento (GH), sendo este responsável por estimular a secreção de progesterona e ocitocina (SCHAMS &

28 BERISHA, 2004; SCHAMS, 1994, KOBAYASHI et al., 2001). Um aumento no número e na expressão do RNAm que codifica os receptores para LH foram observados no CL bovino (SPICER et al., 1981; GARVERICK et al., 1995; OKUDA et al., 1999; KOBAYASHI et al., 2001) assim como os receptores para o GH, principalmente nas células grandes que compõem o CL (LUCY et al., 1993; KIRBY et al., 1996; KOELLE et al., 1998). No período que antecede a ovulação, simultaneamente à queda dos níveis circulantes de progesterona, há intensificação da secreção de estradiol pelo folículo dominante, que estimula a produção do hormônio estimulador de gonadotrofinas (GnRH) no hipotálamo, induzindo o pico pré-ovulatório de LH (KARSCH et al., 1979). O pico de LH além de estimular o crescimento e maturação folicular final, induz a ovulação e formação do corpo lúteo, por meio de alterações bioquímicas e morfológicas nas células da teca e da granulosa do folículo pré-ovulatório (SCHAMS & BERISHA, 2004). Durante a ovulação, o oócito e o fluido folicular são liberados do folículo criando uma cavidade para o desenvolvimento do CL, considerado uma glândula endócrina transitória, que tem como produto secretório primário a progesterona. Além de controlar de forma endócrina a secreção do GnRH e gonadotrofinas, a progesterona exerce ação luteotrópica sobre o CL bovino, por estimular a síntese de receptores de LH (JONES et al., 1992; JUENGEL & NISWENDER, 1999; SKARZYNSKI et al., 2001). Com o rompimento do folículo, ocorre quebra da membrana basal e formação de dobras do estrato granuloso que se projetam para o espaço originado pelo esvaziamento folicular e sangramento dos capilares da teca interna para luz folicular, levando à formação do corpo hemorrágico. Logo em seguida, as células da teca interna e externa são completamente incorporadas nos centros das dobras e nas margens do CL e inicia-se a luteinização (SMITH et al., 1994). Histologicamente, o CL é constituído pelas células luteínicas pequenas e as grandes, as quais possuem capacidade esteroidogênica. Ambos os tipos celulares se originam por diferenciação folicular remanescente após a ovulação. Acredita-se que as células luteais grandes e pequenas sejam derivadas das células da granulosa e da

29 teca, respectivamente. Contudo, na formação do CL pode-se observar a presença de células pequenas que se tornam grandes conforme o CL se desenvolve (O SHEA et al., 1980; ALILA et al., 1984; FRITZ & FITZ, 1991). Além disso, o CL também se forma por células endoteliais, fibroblastos, pericitos, células da linhagem sanguínea, bem como células musculares lisas (CHANING, 1986; O SHEA et al., 1989). O CL é formado em poucos dias após a ovulação mediante intensa vascularização, proliferação celular mitótica (KOBAYASHI et al., 2001) e expressiva reorganização e diferenciação celular (GURAYA, 1971). O grau de reorganização tecidual, que inclui migração e mistura de diferentes tipos celulares, varia entre as espécies. Em bovinos, destaca-se a alta migração de células da teca, células da granulosa, células endoteliais e fibroblastos (DHARMARAJAN et al., 1985). A formação de uma extensa rede de capilares é fundamental para a nutrição e manutenção da alta atividade metabólica e secretória dessa glândula transitória. Sendo assim, a angiogênese proporcionada pela proliferação e migração ordenada de células endoteliais merece destaque na formação do CL (REYNOLDS et al., 1992). Acredita-se que a comunicação intercelular também seja importante para a função luteínica, assim como ocorre a interação entre as células da teca e da granulosa no desenvolvimento folicular. De fato, o contato entre células pequenas e grandes aumenta a produção de progesterona em resposta ao LH, refletindo a importância da comunicação intercelular (DEL VECCHIO et al., 1995). Além da produção de progesterona, há evidências da participação de fatores parácrinos, como os fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF) I e II, fator de crescimento transformante α (TGF-α) e principalmente dos fatores de crescimento fibroblásticos FGF-1, FGF-2, FGF-7 e FGF-10 e fatores de crescimento endoteliais vasculares (VEGFs), na migração, proliferação e diferenciação celular, necessária à angiogênese e formação do CL (ZENG et al., 1993; WEZEL et al., 1995; SALLI et al., 1998; ROBINSON et al., 2007; CASTILHO et al., 2008). Os FGFs e os VEGFs, além de terem sido detectados em células luteínicas, já foram demonstrados como fatores indutores da proliferação de células endoteliais (GOSPODAROWICZ et al., 1986; GRAZUL-BISKA et al., 1995; PLENDL et al., 2000; FAVIER et al., 2001). Em especial, o FGF-2 foi descrito como fator

30 angiogênico no CL por estar expresso em altas concentrações nos estádios médios e finais do desenvolvimento luteínico (ROBINSON et al., 2007). Outro possível papel para os fatores de crescimento produzidos localmente no CL seria o de prevenir a ocorrência de morte celular programada, já que muitos deles apresentam atividade anti-apoptótica. Esta hipótese é compatível com os níveis decrescentes de receptores para o bfgf encontrados em células parênquimais luteínicas durante a primeira metade do ciclo estral (REDMER & REYNOLDS, 1996). Apesar de válida, esta hipótese ainda requer maior investigação para ser aceita. O CL se mantém íntegro e ativo até a luteólise, definida como quebra estrutural e funcional do CL, caracterizada pela redução na capacidade de síntese e secreção de progesterona, seguida de perda das células luteínicas (MCGUIRE et al., 1994; KNICKBOCKER et al., 1988). Em bovinos, tal processo é desencadeado pela secreção pulsátil de PGF2α pelo endométrio uterino, estimulado pela ocitocina e estradiol de origem ovariana (ASSELIN et al., 1997). O controle da secreção de PGF2α pela ocitocina se dá pela indução da expressão de cicloxigenase-2, levando ao aumento na amplitude do pulso da produção de PGF2α pelo endométrio (ASSELIN et al., 1997). O estradiol por sua vez, estimula a formação de receptores para ocitocina e para si mesmo no endométrio, modificando o padrão de liberação de PGF2α e desencadeando a luteólise (BEARD & LAMMING, 1994). Outro fator que pode contribuir no processo de luteólise é o óxido nítrico (NO), sendo que ele inibe diretamente a secreção de progesterona nas células luteínicas bovinas (JAROSZEWSKI et al., 2001) e aumenta a ação da PGF2α extragonadal sobre o CL (SKARZYNSKI et al., 2000). Tais achados confirmam o relato de que a perfusão de um inibidor não seletivo da NO sintetase inibiu a produção ovariana de NO e prolongou a duração do ciclo estral em novilhas (JAROSZEWSKI et al., 2000), sugerindo ação parácrina ou autócrina do NO na regulação da luteólise funcional e estrutural (SKARZYNSKI et al., 2002). O destino do CL é alterado caso ocorra fecundação e presença de um concepto na luz uterina capaz de desencadear mecanismo anti-luteolítico pela produção de interferon tau (INF-τ), que reduz a transcrição de receptores de estrógeno e ocitocina no

31 endométrio, impedindo a liberação dos pulsos de PGF2α induzidos pela ocitocina (SPENCER & BAZER, 1996). Nesse caso o CL é mantido e continua a secretar progesterona, o que é fundamental para o estabelecimento e manutenção da gestação na maioria dos mamíferos (AROSH et al., 2004) O sistema FGF Os FGFs compõem uma família de pelo menos 25 membros (FGF 1-25) (KATOH & KATOH, 2005), sendo que 23 FGFs já foram descritos em mamíferos (YAMASHITA et al., 2000). São proteínas com peso molecular entre 17 e 34 KDa, altamente conservadas entre as espécies de vertebrados e compartilham mais de 90% de homologia na seqüência de aminoácidos (ORNITZ & ITOH, 2001). Esses fatores apresentam padrões temporais e espaciais de expressão específicos e estão envolvidos no desenvolvimento embrionário, angiogênese, cicatrização e oncogênese (BASILICO & MOSCATELLI, 1992). Além da habilidade de estimular a proliferação de uma grande variedade de células, os FGFs apresentam potentes atividades neurotróficas e angiogênicas. Eles estão expressos em estádios iniciais e tardios do desenvolvimento e também em tecidos adultos, o que indica que eles desempenham papel importante como fatores de crescimento e diferenciação celular durante toda a vida (IGARASHI et al., 1998). A biodisponibilidade dessas moléculas parece ser regulada por proteínas carreadoras de fatores de crescimento fibroblástico, as FGFBPs, que são responsáveis por liberar os FGFs imobilizados na matriz extracelular (ABUHARBEID et al., 2006). Cinco genes distintos codificam receptores de alta afinidade que interagem com os membros da família FGF (FGFR-1 a 5) (KIM et al., 2001; SLEEMAN et al., 2001). Os FGFR-1 a 4 codificam receptores do tipo tirosina-quinase localizados na membrana plasmática. Arranjos transcricionais alternativos ( alternative splicing ) possibilitam a formação de 3 isoformas (a, b e c) do FGFR-1, FGFR-2 e FGFR-3, que apresentam diferentes graus de afinidade pelos diversos FGFs (ORNITZ et al., 1996).

32 O FGFR-5, descoberto mais recentemente, apresenta dois transcritos alternativos: FGFR-5 e ß (SLEEMAN et al., 2001; KIM et al., 2001). Este receptor não apresenta o domínio tirosina quinase intracelular como os outros FGFR (SLEEMAN et al., 2001), mas há relatos de ligação ao FGF-2 por conservar resíduos de domínios extracelulares importantes para o acoplamento com os ligantes dos FGFs. No entanto, sua função biológica permanece desconhecida (SLEEMAN et al., 2001). Na interação entre o FGF e o FGFR, ocorre dimerização e trans-fosforilação do receptor para que um sinal seja traduzido em uma resposta biológica (JOHNSON & WILLIAMS, 1993). Além da fosforilação da tirosina, outros sinais de transdução, como o recrutamento da proteína quinase ativadora de mitógeno (MAP quinase), estão envolvidos na geração do efeito proliferativo dos FGFs (CREUZET et al. 1995). A interação ligante-receptor é coordenada pela conjugação com heparina ou proteoglicanos (heparan sulfato) conferindo maior estabilidade à ligação e dimerização dos FGFRs. A sinalização intracelular desse complexo (FGF-FGFR-Heparina) é mediada através do recrutamento de proteínas específicas que ativam a via intracelular da MAP quinase (ESWARAKUMAR et al., 2005) Papel dos FGFs e seus receptores no desenvolvimento folicular antral A foliculogênese está incluída dentre os processos fisiológicos dos quais participam os FGFs, sendo o FGF-2 ou bfgf, o membro da família melhor estudado nesse contexto. Fortes evidências indicam a participação do FGF-2 como elemento mediador de interações químicas entre os tipos celulares que compõem os folículos préantrais e antrais (McNATTY et al., 1999; BERISHA et al., 2004). Os dados sobre a expressão gênica e protéica do FGF-2 e a localização de seus receptores por estudos de binding, sugerem as células da teca como principal sítio de produção deste fator e as células da granulosa como alvo de sua ação parácrina (WANDJI et al., 1992; BERISHA et al., 2004). Esta hipótese é reforçada por estudos de cultivo celular onde o FGF-2 induziu a proliferação celular e inibiu a esteroidogênese

33 tanto em células da granulosa (LAVRANOS et al., 1994; VERNON & SPICER, 1994) como em células da teca (NILSSON et al., 2001). Berisha et al. (2004) observaram expressão crescente do RNAm do FGF-2 em células da teca ao longo do desenvolvimento folicular, sugerindo seu envolvimento no controle do crescimento final de folículos pré-ovulatórios via estimulação da angiogênese e proliferação e sobrevivência das células da granulosa. Além do FGF-2, outros FGFs estão envolvidos no controle do desenvolvimento folicular antral, tais como o FGF-1 (BERISHA, et al., 2004), FGF-7(PARROTT et al., 1994; Mc NATTY et al., 1999; BURATINI et al., 2007), FGF-8 (BURATINI et al., 2005ad) e FGF-10 (BURATINI et al., 2007). A expressão do FGF-1, também conhecido como fator de crescimento fibroblástico ácido (afgf), foi detectada predominantemente em células da teca, mas sem sinal da regulação ao longo do desenvolvimento, já que os níveis de RNAm se mostraram constantes. Contrariamente, a proteína foi localizada por imunohistoquímica predominantemente na camada de células da granulosa, onde provavelmente encontrase ligada ao seu receptor (BERISHA et al., 2004). A expressão do FGF-7, também conhecido como fator de crescimento dos queratinócitos (KGF-I), foi detectada no epitélio superficial do ovário bovino (PARROTT et al., 2000) e nas células da teca (PARROTT et al., 1994; PARROTT & SKINNER, 1998ab; BERISHA et al., 2004). O FGF-7 interage com maior afinidade com o FGFR-2b que é expresso exclusivamente por células epiteliais (ORNITZ & ITOH, 2001). Parrot e Skinner (1998a) relataram níveis de expressão do FGF-7 em células da teca diretamente proporcionais ao tamanho dos folículos antrais, o que motivou a sugestão de que as ações do FGF-7 seriam especialmente importantes para a rápida proliferação de células da granulosa em folículos grandes (>10 mm de diâmetro). Porém, em outro estudo, os níveis de expressão do RNAm do FGF-7 não apresentaram variação significativa ao longo do desenvolvimento folicular (BERISHA et al., 2004).

34 Quanto aos efeitos sobre a diferenciação esteroidogênica de células da granulosa cultivadas, a administração de FGF-7 diminuiu a atividade de aromatização induzida pelo FSH e inibiu a capacidade do hcg em induzir a produção de progesterona em células da granulosa cultivadas in vitro (PARROTT & SKINNER, 1998ab). A participação do FGF-8 no controle do desenvolvimento folicular antral bovino também foi sugerida pela detecção da expressão deste gene em oócitos, e em baixo grau em células da granulosa e teca. Quanto aos seus receptores, o FGFR-4 foi detectado exclusivamente em células da teca, sendo que o RT-PCR semiquantitativo revelou diminuição da expressão com o aumento do diâmetro folicular, sugerindo o envolvimento deste receptor na regulação da camada da teca em folículos antrais iniciais. Distintamente, o FGFR-3c mostrou-se expresso tanto em células da teca quanto em células da granulosa, embora evidências de regulação da expressão tenham sido observadas somente nas células da granulosa, onde os níveis de RNAm aumentaram com o diâmetro do folículo e concentração de estradiol no fluido folicular (BURATINI et al., 2005). Outro importante receptor, o FGFR-2c, ativado tanto por FGF-8 quanto por FGF-2, também foi detectado em células da teca e em células da granulosa, porém sem mudanças nos níveis de expressão ao longo do desenvolvimento (BERISHA et al., 2004). O FGF-10, também conhecido como fator de crescimento dos queratinócitos (KGF-II), é bastante semelhante ao FGF-7 tanto no que se refere à estrutura e seqüência do gene, quanto às propriedades funcionais (EMOTO et al., 1997; OHUCHI et al., 2000). Ele foi identificado como um fator de crescimento de origem mesenquimal essencial para a ramificação precoce e a regulação de eventos morfogênicos na formação do pulmão (CHEN et al., 2000). Em folículos antrais bovinos, a expressão do FGF-10 foi detectada em níveis decrescentes em relação às concentrações intrafoliculares de estradiol em células da teca, bem como em oócitos. A maior expressão do FGF-10 em células da teca de folículos menos estrogênicos sugere sua participação na regulação da função das células da granulosa durante a fase inicial do desenvolvimento folicular antral. Em cultivo de

35 células da granulosa, a adição de FGF-10 leva a uma diminuição da produção de estradiol por esse tipo celular, sugerindo sua possível participação na regulação da esteroidogênese (BURATINI et al., 2007). O receptor específico para o FHF-10 é o FGFR-2b. Em concordância com a participação do FGF-7 e FGF-10 no controle do desenvolvimento folicular, a expressão do FGFR-2b foi detectada predominantemente em células da granulosa em níveis diretamente proporcionais às concentrações intrafoliculares de estradiol (BERISHA et al., 2004). Além disso, BURATINI et al. (2005), relataram efeitos opostos do FSH e IGF-I na regulação da expressão gênica do FGFR-2b em células da granulosa bovinas cultivadas. Enquanto o FSH aumentou a expressão gênica do FGFR-2b, o IGF-I diminuiu a expressão FGFs e seus receptores no desenvolvimento luteínico Fortes evidências indicam a participação do FGF-1, FGF-2, FGF-7 e FGF-10 no desenvolvimento e regressão luteal (STIRLING et al., 1991; REDMER & REYNOLDS, 1996; SALLI et al. 1998; NEUVIANS et al. 2004; SCHAMS & BERISHA, 2004; CASTILHO et al., 2008). O primeiro membro dos fatores de crescimento fibroblásticos identificado em CL bovino foi o FGF-2 (SCHAMS et al., 1994; WEZEL et al., 1995). Acredita-se que o FGF-2 seja capaz de regular a angiogênese em bovinos, pois quando o meio condicionado com células luteínicas foi utilizado com o anticorpo anti-fgf-2 proporcionou inibição da proliferação celular das células endoteliais (GRAZUL- BILSKA et al., 1992). Além disso, Robinson et al. (2007) detectaram o FGF-2 em altas concentrações nos estádio médios e finais do desenvolvimento luteínico, confirmando a possível função angiogênica deste fator de crescimento no CL. O FGF-1 (FGF ácido) também foi imunolocalizado no CL, porém em menor quantidade que o FGF-2 (SCHAMS et al., 1994). Sendo assim, o FGF-1 não deve ser um importante fator angiogênico no CL como o FGF-2. Além disso, a atividade

36 angiogênica produzida no CL pode ser parcialmente neutralizada pelo anticorpo anti- FGF-2, mas não pelo anti-fgf-1 (DORAISWAMY et al., 1995a; GRAZUL-BILSKA et al., 1995; RICKE et al.,1995). Outros membros da família FGF detectados no CL bovino são o FGF-7 e o FGF-10, ambos expressos em todas as fases do CL em desenvolvimento, porém, não foi observada regulação da expressão desses genes durante o desenvolvimento luteínico (SALLI et al., 1998; CASTILHO et al., 2008). Os resultados encontrados por Salli et al., (1998) sugerem a participação do FGF-7 na comunicação parácrina luteínica. Outro possível papel para os fatores de crescimento produzidos localmente no CL seria o de prevenir a ocorrência de morte celular programada, já que muitos deles apresentam atividade anti-apoptótica. Esta hipótese é compatível com a expressão decrescente do receptor FGFR-1, encontrado em células parenquimais luteais de ovinos durante a primeira metade do ciclo estral (REDMER e REYNOLDS, 1996). Apesar de válida, esta hipótese ainda requer maior investigação para ser aceita. A expressão gênica do FGF-1 e do FGF-2 também foi detectada em alto grau durante a luteólise funcional, indicando um papel para estes fatores de crescimento na luteólise em bovinos (NEUVIANS et al., 2004; BERISHA & SCHAMS, 2005). Porém, a expressão gênica destes FGFs diminui na luteólise estrutural (NEUVIANS et al., 2004; SCHAMS & BERISHA, 2004). A produção local de PGF 2α deve ser a responsável pela diminuição na expressão do FGF-2 (STIRLING et al., 1991). Além disso, o FGF-2 pode ser estimulado pela Ang II (STIRLING et al., 1990), que é um importante peptídeo na fase inicial da luteólise (SCHAMS et al., 2003; HAYASHI & MIYAMOTO, 1999), e o FGF-2, por sua vez, regula positivamente a produção de ANG II. O FGF-2 também estimula a secreção de prostaglandinas nas células luteínicas bovinas (KOBAYASHI et al., 2001a). Neuvians et al. (2004) relataram aumento da expressão dos FGFRs durante a luteólise de bovinos induzida pela aplicação de PGF2α, sugerindo a participação dos FGFs no controle da luteólise e o possível envolvimento na modulação da reação inflamatória que se estabelece durante a regressão luteal. Porém, Neuvians et al. (2004) não fizeram distinção entre os diferentes tipos de FGFRs.