MICROSCOPIA CONFOCAL CORNEANA E SUA APLICABILIDADE NO ESTUDO DE PIGMENTOS CORNEANOS DE CÃES Carmel R. Dadalto¹, Shayra P. Bonatelli¹, Maria Jaqueline Mamprim 2, Cláudia V. S. Brandão 2, José JoaquimT. Ranzani 2 1 Doutoranda da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus Botucatu. carmel_dadalto@outlook.com ² Docente adjunto da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus Botucatu 1 INTRODUÇÃO A microscopia confocal de córnea é uma técnica não-invasiva utilizada clinicamente para o estudo da estrutura celular corneana, fornecendo imagens semelhantes as técnicas histoquímicas in vitro que delimitam o epitélio da córnea, a camada de Bowman, o estroma, membrana de Descemet e o endotélio (TAVAKOLI et al., 2008; STROM et al., 2016). Na medicina, já está descrito sua utilização na detecção de condições patológicas, infecciosas, distrofias da córnea, monitoramento das alterações induzidas por lente de contato, avaliação pré e pós cirúrgicas, com interesse especial no estudo da córnea de pacientes diabéticos (TAVAKOLI et al., 2008; KAFARNIK et al., 2007). Porém na veterinária são escassos os estudos que abordam sua utilização clínica. Este trabalho tem por objetivo descrever a formação de imagem da microscopia confocal da córnea em cães, abordando as principais raças acometidas e a provável etiologia dos pigmentos corneanos. 2 DESENVOLVIMENTO DO ASSUNTO 2.1) Princípios ópticos Minsky desenvolveu o microscópio confocal original em 1955 para fotografar células cerebrais e estudar redes neurais no cérebro vivo. Posteriormente, a teoria óptica da microscopia confocal foi mais formalmente desenvolvida e prolongada durante a década de 1980 e década de 1990 (MASTERS; THAER, 1994). Em suma, o princípio básico de um microscópio confocal é que um único ponto de tecido pode ser iluminado por uma fonte de luz pontual e simultaneamente fotografado por uma câmera no mesmo plano, ou seja, é "confocal". Isso produz uma imagem com uma resolução muito alta, mas praticamente não tem campo de visão devido a um único ponto de iluminação e detecção. Para resolver esse problema, o
instrumento ilumina instantaneamente em imagens síncronas, ou seja, escaneia, uma pequena região de tecido com milhares de pequenos pontos de luz que são reconstruídos para criar um campo de visão útil com alta resolução e ampliação (EFRON et al., 2001). O resultado é que os microscópios confocais fornecem em uma face, visão da estrutura que está sendo analisada. Como a córnea é transparente, a luz branca ou, mais recentemente, lasers podem ser utilizados para imagens in vivo, a alta ampliação (nível celular) e alta resolução, proporciona uma profundidade de campo de aproximadamente 10 μm, resolução lateral de1 μm e um campo de visão de 300 μm 220 μm (TAVAKOLI et al., 2008). 2.2) Sistemas de imagem confocal da córnea No momento, existem vários microscópios de imagem confocal que estão comercialmente disponíveis e o dispositivo clínico mais recente é um microscópio confocal córneo a laser. A vantagem primária da microscopia confocal de varredura a laser é a capacidade de produzir em série imagens de camadas finas da córnea. De acordo com isso, a profundidade de foco para o TSCM (microscópio confocal de varredura em tandem) é de 7-9 μm, e em sistemas de varredura de fenda é de 26 μm, enquanto é de 5-7 μm usando o microscópio confocal a laser (TAVAKOLI et al., 2008). Ao examinar a conjuntiva e o limbo corneoescleral, a principal limitação do microscópio confocal in-vivo de luz branca deve-se ao espalhamento da luz. No entanto, a tecnologia de varredura a laser combinada com o microscópio do Módulo Córnea de Rostock (RCM) parece ser menos afetada por espalhamento de dispersão, permitindo imagens precisas da córnea e da conjuntiva (TAVAKOLI et al., 2008). A conjuntiva, córnea periférica e limbo são, portanto, melhor examinadas na superfície e em profundidade média usando este método do que com um microscópio confocal padrão. 2.3) Colaboração do paciente X Qualidade de imagem A utilização de anestesia local ou geral ainda permanece controversa. Vallone et al. (2017) utilizaram somente contenção manual e anestesia tópica. Entretanto Kafarnik et al. (2007) descrevem como necessária a utilização de anestesia geral em quase todos os animais em razão de que pequenos movimentos oculares podem obliquar as imagens e tornar as mensurações imprecisas. Ainda, uma distância segura deve ser mantida do
epitélio corneal evitando excessivas compressões que possam levar a falsas imagens de cicatrizes ou vasos sanguíneos ou ainda provocar erosões focais (KAFARNIK et al., 2007). 2.4) Uso da Microscopia confocal in vivo para análise de pigmentos da córnea O pigmento corneano superficial (SCP) foi descrito em 1924 por Nicholas como uma condição degenerativa ou inflamatória da córnea, caracterizada como um depósito acastanhado a negro e observou que essa condição de ceratite pigmentar podia ser secundário às condições inflamatórias da superfície ocular, porém na maioria dos casos era uma condição primária. Na literatura veterinária poucos são os estudos realizados para elucidar a etiologia ou susceptibilidade da SCP em diferentes raças (VALLONE et al.,2017). Estudos anteriores descrevem a deposição de melanina epitelial na córnea, simultânea a presença de vasos sanguíneos e células inflamatórias, porém essa descrição foi apenas por microscopia confocal e não correlacionou com as alterações oculares presentes (VALLONE et al., 2017). Atualmente foi identificado o pigmento corneano em Pugs obtendo alta prevalência dessa alteração na raça, aproximadamente 70-82%, porém também identificaram comorbidades como distúrbios do sistema lacrimal e alterações em pálpebras (KREENY et al., 2015). Houve uma correlação positiva em cães com cerato conjuntivite seca (KCS) e o desenvolvimento da SCP, mas a ausência de KCS não descartou a presença do pigmento corneano em muitos cães do estudo (KREENY et al., 2015). Labelle et al. (2013) não observou associações significativas entre a presença de pigmentos corneanos e conformação da pálpebra ou ceratoconjuntivite seca, no entanto a gravidade da pigmentação foi significativamente correlacionada com o sexo, características do filme lacrimal e cor da pelagem. A detecção da ceratite pigmentar foi menos frequente nas fêmeas castradas, enquanto que a severidade da lesão foi maior nos machos, sugerindo influênica hormonal na etiologia da lesão (LABELLE et al., 2013). Correlacionando à cor da pelagem Pugs marrons tem tendência a desenvolver a SCP em grau moderado, enquanto Pugs pretos tem predisposição a apresentar a doença em grau mais discreto, ainda graus mais severos da SCP estão relacionados com resultados mais baixos dos testes de filme lacrimal (LABELLE et al., 2013). Excluindo
fatores de risco inflamatórios como alterações dos anexos oculares e anormalidades do filme lacrimal, pode-se sugerir que a SCP se desenvolve devido a alterações hereditérias epiteliais, distrofia pigmentar específica da raça ou ceratopatia pigmentar (LABELLE et al., 2013). Os cães braquicefálicos como Pugs, Lhasa Apso, Shih Tzu, Boston Terrier apresentam suscetibilidade a desenvolver SCP sem alterações clínicas e estímulos identificáveis, dessa forma a microscopia confocal tem capacidade de evidenciar a lesão antes mesmo da manifestação clínica (LABELLE et al., 2013; VALLONE et al., 2017). Vallone et al. (2017) avaliaram cães braquicefálicos e observaram que na presença de SCP nestas raças demonstravam, ao estudo de microscopia confocal corneana, presença de melanina corneana associada a patologia inflamatória reforçando o uso do termo ceratite pigmentar para descrever essa alteração. Em estudos com cobaias induzindo úlceras de córnea, observou-se a presença histológica de vascularização corneana precedendo a migração do pigmento, sugerindo que os fatores tróficos de vascularização podem ser semelhantes ao de migração do pigmento (VALLONE et al., 2017). A deficiência de células estaminais do limbo pode ser considerada um possível mecanismo da ceratite pigmentar, pois esta deficiência pode acarretar em vascularização corneana e invasão celular do cálice conjuntival, conhecida na medicina como conjunctivalization, descrito como presença de células caliciformes no epitélio da córnea (LEDBETTER et al.,2013). Porém, em cães foi observada uma expansão do epitélio basal, migração centrípeta de pigmento, vascularização e presença de leucócitos na córnea uma vez identificado deficiência das células estaminais (VALLONE et al., 2017). Outra aplicação da microscopia confocal da córnea é a avaliação do nervo corneano, sendo possível visualizar os troncos nervosos do estroma corneal, os plexos nervosos subepitelias e basais e quantificar o comprimento das fibras nervosas (KAFARNIK et al., 2008). Na medicina já foram descritas alterações significativas do feixe de fibras nervosas da córnea em pacientes com retinopatia diabética (KAFARNIK et al., 2008).
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS A microscopia confocal in vivo é uma técnica não invasiva que adquire imagens corneanas em tempo real com magnificação e resolução comparável à rotina histológica, permitindo avaliar todas as camadas da córnea. A SCP pode ser resultado de uma resposta inflamatória local não específica secundário a mecanismos abrasivos, imunomediados, trauma e desordens do filme lacrimal, entretanto sua etiologia permanece incerta, podendo estar relacionada com fatores genéticos, cor de pelagem, sexo e status reprodutivo. A microscopia confocal se mostra bastante sensível na identificação das lesões na SCP, podendo inclusive evidenciá-las antes da manifestação clínica. 4 REFERÊNCIAS EFRON, N.; PEREZ-GOMES, I.; MUTALIB, H.A.; HOLLINGSWORTH, J. Confocal microscopy of the normal human cornea. Contact Lens and Anterior Eye. v.24, pp. 16-23, 2001. KAFARNIK, C.; FRITSCHE, J.; REESE, S. Corneal innervation in mesocephalic and brachycephalic dogs and cats: assement using in vivo confocal microscopy. Veterinary Ophthalmology. v.11, n.6, pp. 363-367, 2008. LABELLE, A.L.; DRESSER, C.B.; HAMOR, R.E. Characteristics of prevalence of, and rick factores for corneal pigmentation (pigmentary keratopathy) in Pugs. Journal od the American Veterinary Medical Association. v.243, pp.667-674, 2013. LEDBETTER, E.C.; MARFURT, C.F.; DUBIELZING, R.R. Metaherpetic corneal disease in a dog associated with partial limbal steam cell deficiency and neurotrophic keratitis. Veterinary Ophtahlmology. v.16, pp. 282-288, 2013. MASTERS, B.R.; THAER, A. Real- time scanning slit confocal microscopy of the in vivo human cornea. Applied Optics. v.33, pp. 695-701, 1994. MASTROPASQUA, L.; NUBILE M. Basic principles of confocal microscopy of the cornea. Slack Incorporated, USA: 2002. pp. 1-5. REICHARD, M.; HOVAKIMYAN, M.; WREE, A.; MEYER-LINDENBERG, A.; NOLTE, I.; JUNGHANS C.; GUTHOFF, R.; STACHS, O. Comparative in Vivo confocal microscopical study of the cornea anatomy of different laboratory animals. Current Eye Research. v.35, n.12, pp 1072-1080, 2010. TAVAKOLI, M.; HOSSAIN, P.; MALIK, R. Clinical applications of corneal confocal microscopy. Clin Ophthalmol. v.2, n.2, pp. 435-445, 2008. VALLONE, L.V.; ENDERS, A.M.; MOHAMMED, H.O.; LEDBETTER, E.C. In vivo confocal microscopy of brachycephalic dogs with and without superficial corneal pigment. Veterinary Ophtalmology. v.20, pp.294-303, 2017.