UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS FCAV CAMPUS DE JABOTICABAL Antígenos Recombinantes e suas aplicações em Imunologia Bióloga Mariana Monezi Borzi Doutoranda em Microbiologia Agropecuária Prof. Helio José Montassier
Novo Dogma Central da Biologia Molecular
Replicação Cópia das sequencias de nucleotídeos de uma molécula de DNAfd parental em duas moléculas filhas de DNAfd Semi-conservativa Fita molde Fita nova
Transcrição É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA de fita dupla (gene) Informação genética DNA Núcleo mrna Citoplasma
Tradução Consiste na transformação da mensagem contida no mrna, via trna, na sequência de aminoácidos que constituem a proteína Expressão gênica
Proteína Polímero de aminoácidos de massa molecular acima de 10 KDa, com cada aminoácido unido ao seu vizinho por um tipo específico de ligação covalente.
Sequencia linear dos resíduos de aminoácidos (Ligações peptídicas) Padrões estruturais: conformação helicoidal ou lado a lado (Pontes de hidrogênio) Arranjo 3D (Pontes de hidrogênio, Forças de Van der Wall, Interações iônicas) Arranjo entre cadeias/subunidades (Ligações dissulfeto)
Antígenos: substâncias (moléculas) estranhas ao SI que são reconhecidas por receptores específicos em linfócitos B e T e também por anticorpos. Antígenos recombinantes: proteínas específicas do agente infeccioso, produzidas artificialmente a partir da clonagem gênica - Proteínas recombinantes - Proteínas heterólogas
Tecnologia do DNA recombinante Produção em larga escala de proteínas recombinantes a partir da expressão de uma molécula de DNA recombinante em um sistema de expressão adequado. DNA recombinante: sequencia de DNA artificial que resulta da combinação de diferentes sequencias de DNAs
Clonagem gênica: isolamento, amplificação e purificação de um ou mais genes a partir do material genético de um dado organismo. Estudos bioquímicos Análises estruturais Dificuldades de obtenção Produção de Anticorpos Imunodiagnóstico
Células hospedeiras: Leveduras, Células de insetos, Células de mamíferos, Células bacterianas Taxa de crescimento celular; Complexidade do meio de cultura; Custo do meio de cultura; Nível de expressão; Capacidade de expressão extracelular. Capacidade de produzir as modificações póstraducionais: - enrolamento correto; - formação das pontes dissulfeto; - glicosilação; - fosforilação; - acetilação.
Escherichia coli Crescimento rápido Pouco espaço físico Genética bem compreendida Aceita material genético estranho
Vetores de expressão Vetor: molécula de DNA usada como um veículo para carregar sequências de DNA estrangeiras dentro de uma célula hospedeira. Plasmídeos: Mais simples Circulares Independentes do cromossomo bacteriano Gene resistência a antibiótico
Expressão de proteína recombinante em E. coli: 3 etapas - Clonagem Gênica - Indução da Expressão - Análise da Expressão
E T A P A 1 Vetor de expressão Preparo do inserto- gene Reação de ligação Transformação de E. coli competente amp Plaqueamento e seleção dos clones recombinantes Extração do DNAp e Plasmídeo recombinante Sequenciamento
ETAPA 2 Tampão de lise Sonicação Purificação
E T A P A 3 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE) Quanto menor for o peso molecular da proteína mais facilmente ela migrará pelos poros do gel de poliacrilamida em relação às outras Após a corrida as proteínas poderão ser visualizadas com a aplicação do corante Coomassie Blue
Preparo da amostra: dodecil-sulfato de sódio e β-mercapto-etanol Confere carga negativa Separa as cadeias
260 kda 72 kda 52 kda 42 kda 10 kda Caracterização por SDS-PAGE da Nucleoprotéina recombinante do Vírus da Influenza Aviária expressa em E. coli.
Western blotting E T A P A 3 Técnica bioquímica utilizada para determinar a quantidade relativa e o peso molecular de uma proteína dentro de uma mistura de proteínas ou outras moléculas. Uso de anticorpos específicos Detecção de antígenos proteicos
1 2 3 260 kda 72 kda 52 kda 42 kda Caracterização por Western Blotting da Proteína NP recombinante do VIA expressa em E. coli após purificação em resina de níquel-agarose.
Análise (mapeamento) dos epítopos Epítopo linear ou contínuo
Epítopo conformacional ou descontínuo
Imunodiagnóstico Sorologia - detecção de Acs contra antígenos virais e bacterianos específicos Clonagem e expressão da NP do VIA Testes de ELISA 121 soros testados Positivos Acs presentes no soro reagiam com a NP recombinante Negativos não ocorria reação
ELISA indireto
Vacinas de DNA Apresentam sequencias do material genético do agente infeccioso que codificam antígenos Clonagem do gene em vetor de expressão (propagação) Administração ao indivíduo (transfecção) Células produzem a própria proteína (antígeno) Resposta imunológica com memória
Vacinas de DNA Indução da imunidade protetora em camundongos contra o câncer e algumas doenças auto imunes. Em humanos: Pesquisas direcionadas contra a AIDS, malária, tuberculose, dengue, hepatite, raiva, leptospirose, teníase etc.
Vai depender... Seleção do gene alvo Construção do vetor de expressão Frequência e via de administração Idade, saúde e espécie
Vantagens Produção em larga escala menos custo Mais fácil o controle de qualidade Estáveis a Tº ambiente Podem ser liofilizadas Sem necessidade de refrigeração fácil comercialização, transporte, distribuição em regiões de difícil acesso
OBRIGADA! mmborzi@gmail.com