ANÁLISE MORFOMÉTRICA DOS LINFOMAS DIFUSOS DE GRANDES CÉLULAS-B REVISTOS PELA CLASSIFICAÇÃO REAL 143 RESUMO HAROLDO GARCIA DE FIGUEIREDO (*) SERGIO ZUCOLOTO (**) LUCIANO RESENDE FERREIRA (***) Seis parâmetros morfométricos (área nuclear, área nucleolar, excentricidade nucleolar relativa, número de nucléolos por núcleo, índice de contorno nuclear e porcentagem de imunoblastos) foram analisados em 25 casos de LDGC-B, após reinclusão do material em metacrilato para cortes de alta resolução. Cinco subgrupos distintos foram identificados morfometricamente. A identificação de subgrupos através da morfometria interativa pode permitir maior reprodutibilidade diagnóstica destes tumores. Todos os parâmetros morfométricos analisados mostraram-se úteis nas etapas discriminatórias do presente estudo. DESCRITORES: Linfomas não-hodgkin, morfometria, hematopatologia SUMMARY MORPHOMETRIC ANALYSIS OF DIFFUSE LARGE B-CELL LYMPHOMA REVISED BY REAL CLASSIFICATION Diffuse large B-cell lymphoma ( B-DLCL ) are a heterogeneous group of tumours. The identification of subgroups using morphometric parameters may allow a better reproductibility in the diagnosis of these tumours. The purpose of this study is to identify subgroups of diffuse large B-cell lymphoma ( B-DLCL ), classified by REAL classification ( Revised European-American Classification of Lymphoid Neoplasms ), using morphometric criteria. Six morphometric parameters (nuclear area, nucleolar area, relative nuclear eccentricity, number of nucleoli per nuclear cross section, nuclear contour index and percentage of morphometrically defined immunoblasts ) were studied in 25 cases of B-DLCL using a resin reembedding technique ( glycolmethacrylate ). Five distinct subgroups were morphometrically recognized and all the morphometric parameters seem to be useful in the present study. KEY WORDS: Non-Hodgkin s lymphoma, morphometry, hematopathology 1.INTRODUÇÃO O agrupamento dos linfomas centroblásticos e B-imunoblásticos em uma única categoria na classificação REAL (Harris et al.,1994) com o nome de linfomas difusos de grandes células-b (LDGC-B), veio instigar novas pesquisas buscando identificar subgrupos através de métodos mais reprodutíveis. Diversos trabalhos científicos anteriores têm mostrado que subgrupos destes tumores têm comportamento biológico diferentes (Strauchen et al., 1978; Brittinger et al.,1984) e tal agrupamento ocorreu justamente pela dificuldade de se obter um consenso diagnóstico entre diversos patologistas experientes, quando as lâminas destes tumores foram reavaliadas subjetivamente (apenas através da interpretação ótica individual) num importante encontro internacional de hematopatologistas (Harris et al., 1994). O uso da morfometria interativa e de cortes de alta resolução (inclusão em metacrilato,por exemplo) (Abreu et al., 1993; Velde et al.,1997)vieram apresentar uma alternativa consistente na avaliação de parâmetros discriminatórios nestes tumores. Os estudos morfométricos anteriores esbarraram em duas dificuldades básicas: a primeira decorrente do grande número de classificações até então existentes ( Lennert et al.,1988 e 1992; INC, 1982), tornando os trabalhos pouco comparáveis entre si e a segunda decorrente da subclassificação já existente, forçando os trabalhos morfométricos a justificar diagnósticos préestabelecidos (Ball et al.,1985; Valk et al.,1982, 1983, 1984). O agrupamento destes tumores na classificação REAL veio dar mais autonomia e independência na análise morfométrica destas neoplasias, valorizando os parâmetros morfométricos mais discriminantes. * Médico Professor de Patologia (UNIFENAS). C.P. 23, CEP 37130-000, Alfenas-MG ** Médico Professor de Patologia (USP-Ribeirão Preto) *** Professor de Patologia Oral (UNIFENAS)C.P. 23, CEP 37130-000, Alfenas-MG
144 H. G.de FIGUEIREDO et. al. 2. MATERIAL E MÉTODOS Os LNH difusos de grandes células imunofenótipo B foram recuperados do arquivo do Serviço de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (Universidade de São Paulo) nos anos de 1994 a 1996. Seguindo os critérios adotados na classificação REAL (Harris et al., 1994), os casos foram revistos imunohistoquimicamente para células-b (CD20), células-t (CD45RO) e para células CD30+, sendo posteriormente analisados morfometricamente. Para tal, os blocos originais foram coletados, reemblocados pela infiltração com monômero de glicolmetacrilato e embebidos em Technovit 7200 (Kulzer GmbH, Germany) para a obtenção de microscopia de alta resolução. Estes cortes foram feitos à espessura de 2,5 µm, cortados em um micrótomo Sorvall JB4-A e corados pelos método de Giemsa (Velde et al., 1997; Abreu et al., 1993). As células neoplásicas foram escolhidas aleatoriamente em 10 campos de grande aumento sequenciais, tomando-se o cuidado de excluir a medida de células inflamatórias não-neoplásicas infiltrantes do tumor e de células endoteliais. Cerca de 100 células neoplásicas / caso foram avaliadas, sendo previamente estudada a média geral acumulada em uma biópsia, mostrando que este número de células era estatisticamente significativo para os parâmetros analisados (p< 0.05). Foram calculados morfometricamente a área nuclear (A), o índice de contorno nuclear (ICN), o número de nucléolos por núcleo (N/N), a área nucleolar (a), a excentricidade nucleolar relativa (ENR) e a porcentagem de imunoblastos (%IB). Para o presente trabalho definiu-se como nucléolo todo agrupamento cromatínico 0.7µm 2 e como imunoblasto toda célula tumoral com área nuclear 28µm 2, 1 nucléolo e excentricidade nuclear 0.5. O número relativo de imunoblastos foi expresso em relação às outras células neoplásicas. Em todos os parâmetros foram calculados a média, o desvio-padrão, o erro-padrão médio e o coeficiente de variação. A excentricidade nucleolar relativa (ENR) foi obtida por meio de coordenadas cartesianas do centro de gravidade nuclear e nucleolar. Obteve-se assim a excentricidade nucleolar absoluta, que nada mais é do que a distância em µm entre o centro do núcleo e o centro do nucléolo examinado. A partir da área nuclear obtida e preconizando a célula estudada como um círculo, chegamos a um valor do raio médio celular (r), através da fórmula área= πr 2. Dividindo o valor da excentricidade nucleolar absoluta pelo raio médio, chegou-se à excentricidade nucleolar relativa(enr), que é um índice independente do tamanho celular e cujo valor oscila entre 0 e 1, conforme o nucléolo esteja mais próximo do centro nuclear (próximo de 0) ou esteja próximo da membrana nuclear (próximo de 1). Neste trabalho, as células com área nuclear 28µm 2 e apenas um nucléolo foram classificadas como imunoblastos, desde que tivessem um nucléolo predominantemente central (ENR 0.5). O índice de contorno nuclear (ICN) foi calculado através da relação entre perímetro/raiz quadrada da área, onde um círculo perfeito possui um ICN=3,54 e estruturas elípticas ou irregulares tendem a apresentar valores cada vez maiores, conforme o seu grau de circularidade seja menos perfeito. Tanto a ENR como o ICN são parâmetros morfométricos independentes do tamanho nuclear ou nucleolar. Para o estudo morfométrico foi utilizado o sistema analisador de imagens Kontron (KS 300). As imagens foram obtidas com uma câmara de vídeo colorida da marca JVC, modelo TK-1070U acoplada a um microscópio binocular Carl Zeiss, sendo este sistema conectado a um computador IBM- PC compatível com microprocessador Intel Pentium 100. Os dados coletados foram analisados estatísticamente procurando determinar diferenças significativas entre as variáveis independentes (6 variáveis numéricas neste estudo) de maneira a subclassificar estes tumores através de um algorítmo baseado numa hierarquia da análise morfométrica (Marchevsky, 1986 e 1987). Foi feito uma matriz de correlação entre as variáveis, buscando o melhor coeficiente de correlação (r) de Pearson, bem como o grau de significância (p) entre os valores encontrados. A seguir cada variável foi agrupada em quartís (0, 25, 50, 75 e 100 percentís), sendo comparada com as demais através da análise de variância (ANOVA) entre as mesmas. Utilizou-se então o teste de múltipla comparação de Newman-Keuls entre as variáveis, para identificar subgrupos distintos (com um nível de significância de 0,05). Finalmente, procurou-se estabelecer um algorítmo para a subclassificação morfométrica destes tumores. 3.RESULTADOS E DISCUSSÃO Os dados obtidos da análise morfométrica estão contidos na tabela a seguir (tabela 1). As variáveis que melhor mostraram correlação foram ENRxIB ( r=-0,72 e p=0,00 ). Na análise comparativa dos quartís de ENR, identificou-se dois grupos distintos de %IB ( F=9,61 e p appx =0,000 ).
ANÁLISE MORFOMÉTRICA DOS LINFOMAS DIFUSOS DE GRANDES... 145 Tabela 1. Parâmetros estatísticos dos dados obtidos na análise morfométrica ( sd * = desvio-padrão; sem* = erro-padrão da média ). a variável média min max sd * sem ** A 47,89 29,8 73,41 11,4 2,28 a 2,34 1,34 4,24 0,83 0,16 ICN 4,6 4,2 5,2 0,27 0,05 ENR 0,56 0,49 0,66 0,05 0,01 N/N 1,64 1,23 2,4 0,27 0,05 b Tais subgrupos (IB1 e IB2) mostraram respectivamente a média da porcentagem de imunoblastos igual a 25,75 (sd=6,55) e igual a 15,14 (sd=3,48). O mesmo procedimento anterior foi novamente repetido em cada um dos dois subgrupos, dividindo cada um deles em quartís e procedendo a análise da variância entre os parâmetros. No subgrupo IB1 (n=14) encontrou-se significativa correlação entre área nucleolar e área nuclear (r=0.87 e p=0.00). Novamente foram identificados dois subgrupos com áreas nucleares distintas, derivados da análise dos quartís de área nucleolar (F=9,35 e appx p=0,003), que foram denominados IB1-A1 e IB1-A2 (IB1-A1 com área nuclear média = 37,84; sd=5,86 e IB1-A2 com área nuclear média=51,11 e sd=5,44). Realizaram-se os mesmos procedimentos anteriores nos subgrupos IB1-A1 e IB1-A2, que mostraram significativo índice de correlação entre área nuclear e ICN em IB1-A1 (r=0,82 e p=0,02) e também importante correlação entre IB e N/N em IB1-A2 (r=-0,77 e p=0,04). Observe que em todas as etapas, a matriz de correlação orienta quais as variáveis mais discriminantes na aplicação da ANOVA nas mesmas. Cada um destes grupos subterminais (IB1-A1 e IB1-A2) continham 7 casos clínicos. Para continuar a investigação optou-se por dividi-los em percentiles maiores, uma vez que a amostragem era pequena para a divisão em quartís. Assim utilizou-se um teste de student-t para identificar quais as variáveis discriminantes. Em IB1-A1, encontraram-se grupos distintos de ICN (IB1-A1-ICN1 e IB1-A1-ICN2) e em IB1-A2 grupos distintos de %IB (IB1-A2-IB1 e IB1-A2-IB2), a partir da análise dos percentiles do número de nucléolos por núcleo (N/N). No grupo IB2, não se encontraram variáveis estatisticamente discriminantes, ficando os casos (n=11 ) agrupados neste subgrupo. c d Figura 1. a, Caso agrupado no subgrupo IB1-A1- ICN1. b, Caso agrupado em IB1-A1-ICN2. c, Caso agrupado em IB1-A2-IB1. d, Caso agrupado em IB1-A2-IB2.
146 H. G.de FIGUEIREDO et. al. Os casos agrupados em IB1-A2 são aqueles que mostraram maior número de imunoblastos. Interessante observar que o grupo IB1-A2 foi discriminado de IB1-A1 através da área nuclear e não através da porcentagem de imunoblastos (observe que o grupo IB1-A2 possui maior área nuclear que IB1- A1)(Figura 1). Esta seqüência de parâmetros discriminatórios é um bom exemplo das diferenças entre avaliação subjetiva e avaliação morfométrica. Na separação do grupo IB1-A2 em IB1-A2-IB1 e IB1- A2-IB2, a diferença de %IB nos subgrupos pode ser notada (Figura 1), com prevalência de IB em IB1-A2- IB1, porém com áreas nucleares semelhantes nestes subgrupos. O ICN foi o parâmetro discriminante no grupo IB1-A1, separando-o em IB1-A1-ICN1 e IB1- A1-ICN2. O grupo que mostrou maior irregularidade nuclear foi IB1-A1-ICN2, embora não haja diferenças importantes quanto às áreas nucleares destes subgrupos. É importante também notar que o parâmetro discriminante inicial foi a %IB, dividindo e f Assim, células que certamente seriam identificadas microscopicamente como imunoblastos, muitas vezes apresentam um pequeno nucléolo, adjacente à membrana nuclear, ou ainda, possuem apenas um nucléolo porém com uma excentridade discretamente maior que 0,5. Portanto, estas células não são consideradas morfometricamente como imunoblastos. Por outro lado, células de contorno irregular, nucléolo pequeno, e de características tintoriais pouco sugestivas de imunoblasto (sobretudo as células de área nuclear próxima ao limite mínimo de 28 µm 2 ) podem preencher os critérios aceitáveis morfometricamente e talvez não sejam consideradas microscopicamente como imunoblastos. O subgrupo IB2 mostrou os valores mais altos de ENR (m=0,61 e sd=0,02) e conseqüentemente valores mais baixos de %IB (m= 15,14 e sd=3,48). Este subgrupo corresponde, pelo menos em parte, aos linfomas classificados subjetivamente como centroblásticos, uma vez que correspondem à parcela da amostragem com menor número de imunoblastos e maior excentricidade nucleolar (Figura 2). É interessante também observar a intensa anaplasia celular encontrada no subgrupo IB2, embora o critério discriminante tenha sido a %IB. A análise morfométrica dos LBGC-B, segundo a classificação REAL, mostra que a morfometria interativa pode definir subgrupos distintos, através de índices e medidas que certamente extrapolam a capacidade de observação subjetiva e que podem permitir maior reprodutibilidade diagnóstica. Nas figuras a seguir tem-se o resumo das variáveis discriminantes e dependentes (Figura 3) na seqüencia diagnóstica morfométrica. Na Figura 4 são mostrados os valores morfométricos discriminantes, procurando estabelecer um algorítmo através da morfometria, estabelecendo subgrupos morfometricamente identificáveis. Este estudo não tem e nem poderia ter como objetivo substituir nenhuma classificação existente sobre o tão complexo grupo de tumores que constituem os linfomas não-hodgkin, mas tão somente sugerir que IB1-A1-ICN1 (n=4) IB1-A1 (n=7) área nuclear Figura 2. e, f, Subgrupo IB2. Observe o acentuado polimorfismo nuclear e a baixa porcentagem de imunoblastos. a amostra geral em IB1 e IB2, critério este já utilizado em classificações subjetivas anteriores (Lennert et al.,1988,1992; INC,1982). Cabe aqui destacar que o conceito subjetivo de imunoblasto não corresponde exatamente ao conceito analisado morfometricamente. LDGB-B (n=25) IB1 (n=14) enr IB2 (n=11) área nucleolar IB1-A2 (n=7) IB1-A1-ICN2 (n=3) IB1-A2-IB1 (n=4) n/n IB1-A2-IB2 (n=3) Figura 3. Resumo das variáveis discriminantes, das variáveis dependentes e dos subgrupos encontrados.
ANÁLISE MORFOMÉTRICA DOS LINFOMAS DIFUSOS DE GRANDES... 147 15,14 +/- 3,48 área nuclear > 28 µm 2 ICN = 4,39 +/- 0,16 área nuclear = 37,84 +/- 5,86 ICN = 4,75 +/- 0,16 25,75 +/- 6,55 área nuclear = 51,11 +/- 5,44 24,41+/- 5,00 33,12+/- 3,53 Figura 4. Algorítmo classificatório dos LDGC-B. a análise morfométrica dos linfomas difusos de grandes células pode estabelecer subgrupos morfometricamente distintos através de parâmetros objetivos. Como estes tumores apresentam uma boa resposta à poliquimioterapia intensiva, apesar do alto grau de malignidade (Lennert et al.,1992), a subclassificação objetiva pode permitir comparação mais consistente entre resposta terapêutica e subgrupos morfológicos. Enquanto não surge um recurso mais eficiente, seja ele de ordem imunológica ou de ordem biomolecular, a morfometria parece ser a ferramenta mais útil como método complementar ao diagnóstico dos linfomas difusos de grandes células. Agradecimentos Ao Prof. Dr. Álvaro Garcia Neto da Faculdade de Física e Química da USP (São Carlos) pelo auxílio em computação e estatística e à Mônica Abreu pelas excelentes lâminas em metacrilato. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABREU MA, BAROZA LGV, ROSSI MA. Toluidine blue-basic fuchsin stain for glycolmethacrylate embedded tissue. J Histotech v.16, p.139-140, 1993. BRITTINGER G, BARTELS H< COMMON H et al. Clinical and prognost relevance of the Kiel Classification of non-hodgkin lymphomas: Results of a prospective multicenter study by the Kiel lymphoma study group. Hematol Oncol v.2, p.269, 1984. HARRIS L N, JAFFE S E, STEIN H, BANKS P M et al. A revised European-American classification of lymphoid neoplasms: A proposal from the international lymphoma study group. Blood v.84, p.1361-1392, 1994. LENNERT K, HUI P K, FELLER A C. High grade non- Hodgkin s lymphoma of B-cell type. Histopathology v.12, p.127-143, 1988. LENNERT, K.; HUI, P.K.; FELLER, A. C. Histopathology of non-hodgkin s Lymphomas(Based on the Updated Kiel Classification). Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992. BALL, P.J.; VAN DER VALK, P.; KURVER, P.H.J.; LINDEMAN, J.; MEIJEIR, C.J.L.M. Large cell lymphoma: II. Differential diagnosis of centroblastic and B-immunoblastic subtypes by morphometry on cytologic preparations. Cancer v.55, p.486-492, 1985. MARCHEVSKY, A.M.; KLAPPER, E.; GIL, J. Computarized classification of nuclear profiles in non-hodgkin s lymphomas. Am J Clin Pathol v.87, p.561-568, 1987. MARCHEVSKY, A.M.; GIL, J.; SILAGE, D. Computerized interactive morphometry as a pottentially useful tool for the classification of Non-Hodgkin s lymphoma. Cancer v.57, p.1544-1549, 1986. National Cancer Institute Sponsored study of classifications of Non-Hodgkin s lymphomas. The non-hodgkin s lymphoma pathological classification project: summary and description of a Working Formulation of clinical usage. Cancer v.49, p.2112-2135, 1982. STRAUCHEN, J.A.; YOUNG, R.C., DE VITA, V.T.; ANDERSON, T.; FANTONE, J.C.; BERARD, C.W. Clinical relevance of the histopathological subclassification of diffuse histiocytic lymphoma. N Engl JMed v.299, p.1382-1387, 1978. VELDE JM BURKHARDT R, KLEIVERDA K. Methyl-metacrylate as an embeding medium in histopathology. Histopathology,v.1, p.319-330, 1997. VAN DER VALK, P.; HERMANS, J.; BRAND, R;. CORNELISSE, C.J.; SPAANDER, P.J.; MEIJER, C.J.L.M. Morphometric caracterization of diffuse large-cell ( histiocytic) lymphomas. Am J Pathol v.107, p.327-335, 1982. VAN DER VALK P.; MOSCH A.; KURVER, P.H.J.; CORNELISSE, C.J.; SPAANDER, P.J.; MEIJER,C.J.L.M.Morphometric characterisation of 52 B-cell non-hodgkin s lymphomas. J Clin Pathol v.36, p.289-297, 1983. VAN DER VALK, P.; BALL, P.J.; MOSCH, A.; MEIJER, C.J.L.M. Large cell lymphomas: I. Differential diagnosis of centroblastic and B- immunoblastic subtypes by morphometry on histological preparations. Cancer v.54, p.2082-2087, 1984.