Nutrição e Crescimento Bacteriano Prof. Adjunto Ary Fernandes Junior Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências UNESP Tel. 14 3880.0412/0413 ary@ibb.unesp.br
Características básicas das bactérias 10 horas 1 bilhão de células Estudos de Biologia Celular
95% do peso seco da célula
Visão geral do metabolismo celular Crescimento bacteriano + Motilidade, Luminescência, etc
Nutrição: Fornecimento de substâncias nutritivas para o crescimento bacteriano (Energia e Matéria Plástica) Cultura: Propagação do microrganismo em condições adequadas (Exigências Nutricionais e Ambientais)
FATORES NUTRITIVOS (in vitro = in vivo) Fatores de Crescimento N H K Na Ca Mg Fastidiosos Co Zn Mo Se etc Ex: Haemophilus influenzae Hemina (fator X), NAD + (fator V) OBS. Não existe um meio de cultura universal
Classificação dos Meios de Cultura (Substâncias nutritivas Sintéticos e Complexos)
Classificação dos Meios de Cultura (Estado fisico) Agar Líquido (Turvação do meio) Sólido (1,5 a 2,0%) (Colônias) Semi-Sólido (0,5%) (Movimento)
Classificação dos Meios de Cultura (Poder Seletivo e Diferencial) Agar Sangue (Enriquecidos) Agar Chocolate Lowenstein - Jensen
Classificação dos Meios de Cultura (Poder Seletivo e Diferencial) (Seletivos) (Agar MacConkey)
Classificação dos Meios de Cultura (Poder Seletivo e Diferencial) (Seletivos) (MAS Manitol Salt Agar) (Meio seletivo para Bacillus cereus)
Classificação dos Meios de Cultura (Poder Seletivo e Diferencial) (Seletivos) Baird Parker Agar Agentes seletivos cloridrato de lítio e o tellurite de potássio A gema de ovo Produção de lecitinase e a atividade da lipase. Colônias preta devido à redução de telurito ; Ação da lecitinase causam zonas claras em torno das respectivas colônias. Zona opaca de precipitação devido à atividade da lipase ( S.aureus ).
Classificação dos Meios de Cultura (Poder Seletivo e Diferencial) (Seletivos) (Eosin Methilen Blue (EMB) Oxoid Chromogenic Listeria Agar (OCLA)
Classificação dos Meios de Cultura (Poder Seletivo e Diferencial) (Diferencial) (Agar Sangue) (Padrão de Hemólise)
Classificação dos Meios de Cultura (Poder Seletivo e Diferencial) (Diferencial) Lactose (-) Lac + Lac - Lactose (-) (Agar MacConkey) (Fermentação da Lactose) (Meio Cromogênico) (E. coli/coliformes em alimentos e água)
Classificação dos Meios de Cultura (Poder Seletivo e Diferencial) (De Enriquecimento) (Meio de Selenito Cistina) (Meio de Tetrationato)
Etapas do preparo de um meio sólido
FATORES NUTRICIONAIS ÁGUA - Solvente; Elevado Calor Específico; Regula Pressão Osmótica; Participação em Reações Químicas, Estrutura de Macromoléculas, etc FONTE DE ENERGIA = Doadores de Hidrogênio *Fotossintetizantes Fototróficas Quimiossintetizantes Quimiotróficas (Quimiolitotróficas e Quimiorganotróficas)
FONTE DE ENERGIA = Doadores de Hidrogênio
RECEPTORES DE HIDROGÊNIOS Respiração aeróbia O 2. Respiração anaeróbia NO 3-, SO 4-, CO 2.. Fermentação Fermentação Lática, Alcoólica, etc.
Respiração anaeróbia receptor inorgânico do O 2 (ex: SO 4 2-, NO 3-, CO 2, S) 4 H 2 + SO 4 2- + H + HS +4 H 2 0 4 H 2 + CO 2 CH 4 + 2 H 2 0 Thiennimitr et al, 2011. Salmonella: the host and its microbiota. Current opinion in Microbiology, v.15, n.02, p.108-114, 2012. Salmonella, the host and its microbiota. S. Typhimurium uses its virulence factors (flagella, T3SS-1 and T3SS-2) to invade the epithelium and survive in mononuclear cells. The ensuing inflammatory response results in the epithelial release of an antimicrobial (lipocalin-2) that sequesters iron chelators (enterobactin) produced by the microbiota, but not an iron chelator (salmochelin) produced by S. Typhimurium. ROS generated by neutrophils migrating into the intestinal lumen oxidize an endogenous sulfur compound (thiosulfate) to generate a respiratory electron acceptor (tetrathionate) that enables S. Typhimurium to edge out the fermenting microbiota, thereby enhancing transmission of the pathogen.
Fermentação Composto orgânico produzido durante o próprio processo fermentativo.
CARBONO (Composição dos Compostos Orgânicos -Compostos orgânicos - Quimio-heterotróficos. -CO 2 (Fotossíntetizantes) - Fotoautotróficos. NITROGÊNIO (Proteínas, Ácidos Nucléicos, Coenzimas) Orgânica - Aminoácidos, Sais Orgânicos de Amônia. Inorgânica - NH 3, NO 3-, N 2
ENXOFRE (Aminoácidos Sulfurados, Vitaminas) -Forma orgânica (Radicais sulfidrilas); -Forma inorgânica ( SO 4 -, H 2 S) -Forma elementar FÓSFORO (ATP, Ácidos Nucléicos, Fosfolipídeos, Coenzimas) -Fosfato inorgânico (PO 4 2- ) ATIVADORES DE ENZIMAS Minerais na forma de sais: -Mg ++ e K + (Ribossomos) -Fe ++ (citocromos e peroxidases) -Ca ++ (Parede celular de Gram positivas e esporulação)
ELEMENTOS TRAÇOS - Cobalto, Zinco (Atividade de Enzimas), Molibdênio FATORES DE CRESCIMENTO - Ex: Vitaminas, Aminoácidos, Bases Nitrogenadas, Ácidos Graxos, etc.
FATORES AMBIENTAIS ph Temperatura Aeração (O 2 ) Osmolaridade
FATORES AMBIENTAIS ph Estrutura e funções das proteínas Maioria na faixa ótima de ph entre 6 e 8. Ex. Thiobacillus - 1 e 2 (Acidófila) Vibrio comma - 10 (Alcalinófila) Obs. Normalmente os meios de cultura são tamponados. Bactérias patogênicas ph ao redor de 7
Valores mínimos, ótimos e máximos de ph durante o cultivo para algumas bactérias Organismo Mínimo Ótimo Máximo Thiobacillus thiooxidans 0,5 2,0-2,8 4,0-6,0 Sulfolobus acidocaldarius 1,0 2,0-3,0 5,0 Bacillus acidocaldarius 2,0 4,0 6,0 Zymomonas lindneri 3,5 5,5-6,0 7,5 Lactobacillus acidophilus 4,0-4,6 5,8-6,6 6,8 Staphylococcus aureus 4,2 7,0-7,5 9,3 Escherichia coli 4,4 6,0-7,0 9,0 Clostridium sporogenes 5,0-5,8 6,0-7,6 8,5-9,0 Erwinia caratovora 5,6 7,1 9,3 Pseudomonas aeruginosa 5,6 6,6-7,0 8,0 Thiobacillus novellus 5,7 7,0 9,0 Streptococcus pneumoniae 6,5 7,8 8,3 Nitrobacter sp 6,6 7,6-8,6 10,0 Acidofílicas Neutrofílicas Alcalinofílicas
Temperatura - Velocidade das reações químicas Concentração elevada de ácidos graxos insaturados garante fluidez da membrana plasmática Patogênicas ao homem e animais) Organização tridimensional das proteínas permite a manutenção da estrutura adequada para sua ação em elevadas temperaturas
Aeração - Metabolismo energético Aeróbio estrito (18-21% ) P. aeruginosa, Mycobacterium Anaeróbio estrito (<0,5%) C.haemolyticum Facultativo (<0.5-21%) Enterobactérias Microaerófilo aeróbio (1-5%) Campylobacter, Neisseria Microaerófilo anaeróbio (Aerotolerante) (2-8%) Bacteroides, Clostridium
Bactérias aeróbias e facultativas O 2 Metabolismo Produtos tóxicos Sistema de desintoxicação Produtos não tóxicos O 2 + 2 e - + 2 H + H 2 O 2 O 2 + e - O - 2 O 2 + H 2 O 2 OH * O - 2 + H 2 O 2 O 2 + OH2- + OH * H 2 O 2 + e - + H + H 2 O + OH * Ação das enzimas superóxido dismutase, catalase e peroxidase. Estas enzimas eliminam radicais tóxicos do oxigênio que são inevitavelmente gerados em sistemas vivos na presença de O 2. A distribuição destas enzimas nas células determina a capacidade destas células existirem na presença de O 2.
Bactérias anaeróbias estritas O 2 Metabolismo Produtos tóxicos O 2 + 2 e - + 2 H + H 2 O 2 Ausência do sistema de desintoxicação Morte bacteriana O 2 + e - O - 2 O 2 + H 2 O 2 OH * O - 2 + H 2 O 2 O 2 + OH2- + OH * Danos ao DNA, destroem componentes lipídicos, inativam enzimas H 2 O 2 + e - + H + H 2 O + OH *
Teste da Catalase Reação positiva produzida por Bacillus sp, Staphylococcus sp; Reação negativa produzida por Clostridium sp, Streptococcus sp.
Método da vela acesa (microaerofilia)
Jarra de anaerobiose (Sistema GasPak) Tampa com anel selador Grampo de rosca Catalisador de paládio em pastilha Envelope contendo bicarbonado de sódio e boroidreto de sódio Indicador de anaerobiose (azul de metileno) Placas de Petri
Câmara de anaerobiose ( Glove Box )
Osmolaridade - Concentração de solutos no meio Disponibilidade de água Controle da Osmolaridade Transporte ativo de K + para interior da célula e eliminação de PUTRESCINA
CRESCIMENTO BACTERIANO Aumento no número de células no meio de cultivo Após inoculação no meio de cultura (= semeadura ) em condições ótimas Meio líquido Turvação do meio de cultivo; Meio Sólido Formação de colônias Concentração Celular = Núm. Cel. / Vol. meio Densidade Celular = Massa Cel./ Vol. meio
Contagem bacteriana (Plaqueamento)
Absorbância = 2 - Log de % de Transmissão
NMP (Número Mais provável) Combinação de tubos positivos Limites com 95% de confiabilidade Índice de NMP/100mL Inferior Superior Volume de inóculo para cada grupo de cinco tubos Tubos de meio nutriente (grupo de cinco tubos Número de tubos positivos por grupo
Fases do crescimento bacteriano Fisiologicamente ativas Progressão geométrica (Crescimento Morte) (Crescimento << Morte) Tempo de geração Formas de involução
Fases do crescimento bacteriano Fase Lag (Fase de Demora) Número de bactéria permanece constante em função do tempo. (Fisiologicamente Ativas) Fase Logarítmica ou Exponencial Progressão Geométrica (Crescimento >> Morte) (células viáveis) Tempo de geração?????????
Fase Estacionária Máxima (Crescimento Morte) Morte?????? (O 2, Nutrientes, ph, Produtos Tóxicos, etc ) Fase de Declínio ou Morte Morte >> Crescimento (Formas de Involução)
Taxa de Crescimento x Tempo de Geração
Semeadura = Inocular (transferir o microrganismo a um meio de cultura)
SEMEADURA POR ESGOTAMENTO SEMEADURA EM QUADRANTES
Semeadura Errada Semeadura Correta
Princípios de Alguns Testes Bioquímicos
Catalase Comum em bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas Staphylococcus, Bacillus (+) e Streptococcus (-) 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2
Oxidase (Citocromo oxidase) Oxidação do Citocromo C pelo O 2 Para fenilenodiamina é oxidado pela enzima adquirindo cor vermelha Neisseria (+), Pseudomonas (+), Enterobactérias (-)
Prova de OF (Oxidação - Fermentação) (Carboidrato Ácido) Azul de Bromotimol: ph Alcalino (Azul), ph Ácido (Amarelo) Glicose Enterobactérias, Staphylococcus (Fermentam), Pseudomonas, Micrococcus (Oxidam)
Fermentação de Açúcares Produção de Ácido ou Ácido mais gás Açúcar a ser estudado + indicador de Andrade (vermelho em ph ácido) Enterobactérias Glicose (Todas), Lactose (Algumas espécies apenas) Glicose Lactose
Família Enterobacteriaceae Lactose Agar MacConkey + Gêneros Escherichia Klebsiella Enterobacter Serratia - Gêneros Shigella Salmonella Proteus Providência Morganella
Vermelho de Metila (VM): Fermentação Mista (Glicose Acidos Orgânicos) Vermelho de Metila em ph ácido ( 4,5) fica Vermelho E.coli (+), Enterobacter (-) 1 2 3
Voges-Proskauer (VP) Fermentação Butilenoglicólica Glicose Acetilmetilcarbinol (= Acetoina) 2,3 butilenoglicol Acetoina + Creatinina composto vermelho E. coli (-), Klebsiella pneumoniae (+), Enterobacter (+)
Triptofano Indol Triptofanase Indol Para Dimetilaminobenzaldeído = Reativo de Kovacs + indol Composto vermelho. E. coli (+), Klebsiella-Enterobacter (-) Não inoculado + -
Citrato de Simnons Citrato de Sódio como única fonte de C Se bactéria usa (Cresce) Alcaliniza o meio Azul (Azul de Bromotimol) Klebsiella - Enterobacter (+), E. coli (-)
Uréia (Urease) Amônia Alcalinização do meio (Vermelho Fenol Vermelho) E. coli (-), K. pneumoniae (+)
Fenil-Alanina Desaminação da Fenil-alanina Ácido Fenilpirúvico Ac. Fenilpirúvico + Cloreto Férrico Hidrazina (Cor verde-garrafa) Característica de todas espécies de Proteus - +
Movimento Crescimento em meio semi-sólido (0,5% de Ágar) Imóvel - Cresce só no local da picada: K. pneumoniae Móvel - Cresce além da picada: E. coli
EPM, MILI Tríplice Açúcar com ferro TSI
Métodos Miniaturizados