Técnicas Físicas aplicadas ao Estudo de Sistemas Biologicamente Relevantes Leandro R. S. Barosa M. Teresa Lamy Thais A. Enoki Curso de Verão IFUSP 011 1
Introdução à Fluorescência M. Teresa Lamy Grupo de Biofísica IFUSP Curso de Verão IFUSP 011
Técnicas espectroscópicas Interação da radiação eletromagnética com a matéria Asorção Asorção/Emissão Espalhamento Em iomoléculas: estrutura e dinâmica função
Luminescência Emissão de fótons de estados eletrônicos excitados UV e visível fluorescência singleto singleto 10-8 s fosforescência tripleto singleto 10-3 - 10 0 s Cromóforos - moléculas que asorvem luz Fluoróforos - moléculas que fluorescem Geralmente possuem elétrons delocalizados/duplas ligações/anéis
Diagrama de Jalonski S conversão interna (~10-1 s) S 1 ( fluor ~ 10-9 s) cruzamento inter-sistema sorção (10-15 s) fluorescência k R T 0 (fosf ~ 10-3 s) fosforescência S 0
Fluorescência sulfato de quinina, fluoresceína, rodamina, rometo de etídio luz ranca luz UV espectros de emissão
Fluorescência: primeiras oservações 1565 infusão da madeira Lignum ephriticum (. Monardes) Herschel 1845 oservação de fluorescência em uma solução de quinino água tônica (Wikipedia)
Fluorescência: primeira oservação rigorosa Stokes (185) Quinino Asorve luz no ultra-violeta: as = 350 nm Emite no visível: em = 450 nm
Energia Excitado as em Fundamental Coordenada 9
Fluoróforos naturais (Lakowicz, 1999)
Fluoróforos naturais em Proteínas Green Fluorescent Protein (GFP) Água-viva ioluminescente Aequorea victoria. Cromóforo formado espontaneamente por enovelamento da cadeia polipeptídica, e ciclização (Ser-65, Tyr-66, Gly-67) Inserção do gen para GFP em células e uso da proteína como sonda. 11
Interação da radiação eletromagnética com a matéria modelo semi-clássico radiação: onda EM matéria: estados quantizados de energia 1
Interação de partícula com carga q e massa m com EM B xa A E t gauge de.a Coulom, no vácuo 0 0 Η Η' 1 m p qa para um átomo hidrogenoide 1 m e i ea Ze 4 o r onda plana monocromática A(w, r, t) Ao(w) cos(k.r wt w) E(w, r, t) wao(w) sin(k.r wt w) B(w, r, t) Ao (w)(kx)sin(k.r wt w) i(k.r wtw) A(w, r, t) A (w) [e cc] o Η para campos fracos, desprezando termos em A Ze e i A. m 4 r m e o e H o H perturção
- Sistema de dois níveis - Teoria de Perturção em 1a ordem - Em t = 0, sistema no estado a a P P a taxa de asorção de radiação asorção W w a a W a Regra de uro de Fermi dpa ea o( w dt m E Ea W emissão estimulada a ) e ik.r. I( w) a densidade de energia o w A o ( w) W 4 e I( w ik.r e. m c 4 o w ) a
Aproximação de dipolo elétrico k. r A( w, r,t) 1 k e e r ik. r ik.r A 1 r e. a o ik. r ( w) e i. im. a. 1 r (i) [r, H 1 a (i) (Ea E p imw r i(k.rwtw) 1 r r 1 p o ] ) p r a a r r a W W 4 e I( w c 4 o e r 4 3c a e 4 o ). er I( w ) r r momento de dipolo elétrico de transição para EM não polarizada W B B B I( w r coeficientes de Einstein para asorção e emissão estimulada de radiação B a ) a
I o di(y) I(y) Espectroscopia óptica de asorção y concentração de moléculas I t Asorância = dy I y C'dy o e 'Cy I log I I t característica da molécula Lei de Lamert-Beer o t A yc taxa com que a energia é removida da radiação (asorvida) di( ) ahb dt a (Ea e di( ) dt di( ) I( ) C W a a E a I( ) )/ kt hb h c B r a I( ) a hb dy medidas de modelos a a 0 W I( )
Espectroscopia óptica de emissão Coeficiente de Einstein para a emissão espontânea W B B 4 3c I( w ) e 4o r Se existissem somente B a e B, no equilírio termodinâmico: a B a I() = B I() Taxa de transição induzida por unidade de densidade de radiação incidente A emissão espontânea pode ser deduzida da QED, ou da elegante discussão feita for Einstein em 1916 B a B A a a = mas, a e (E a E ) / kt e h / kt Postulou, portanto, a existência de A, independente de I(), tal que: A d dt a B a I() = B I() + A fluorescência
a 1 B A I( ) Espectroscopia óptica de emissão Considerando que as moléculas estão em equilírio com a radiação à temperatura T: I() = distriuição de Planck para o corpo negro a 1 A B e h / kt 8h 3 1 c 3 e h / kt A B 8h 3 A k R c 3 lemrando: A B r r d dt a r
Intensidade ormalizada Fluorímetro de estado estacionário amostra lâmpada monocromador de excitação monocromador de emissão 6.7 5.0 3.5. cm -1 ) 1.0 0.0 19.1 18. 17.4 16.7 16.0 15.4 fotomultiplicadora 1.0 0.8 água DLPC 0 o C Água DLPC 0 o C 0.6 Prodan 0.4 0. H 3 C H 3 C 0.0 375 400 45 450 475 500 55 550 575 600 65 650 nm) C 19
Asorância ormalizada Intensidade ormalizada Grande sensiilidade da fluorescência ao meio onde encontra-se o fluoróforo asorção Prodan emissão 1.0 Água Metanol Acetonitrila 0.8 Diclorometano Clorofórmio 0.6 Ciclohexano 1.0 0.8 0.6 6.7 5.0 3.5. cm -1 ) 1.0 0.0 19.1 18. 17.4 16.7 16.0 15.4 Água Metanol Acetonitrila Diclorometano Clorofórmio Ciclohexano 0.4 0.4 0. 0. 0.0 300 310 30 330 340 350 360 370 380 390 400 410 40 430 440 450 nm) 0.0 375 400 45 450 475 500 55 550 575 600 65 650 nm) ome Fórmula m(d) n (g/cm 3 ) f * Ciclohexano C 6 H 1.0 ~0 1.43 0.779 0.00 Clorofórmimo CHCl 3 4.8 1.0 1.45 1.10 0.15 Diclorometano CH Cl 8.9 1.6 1.4 1.330 0. Acenonitrila C H 3 36.6 3.9 1.34 0.786 0.30 f 1 n 1 n 1 1 Metanol CH 3 H 33.0 1.7 1.33 0.790 0.31 Água H 78.9.7 1.00 1.000 0.3
Grande sensiilidade da fluorescência ao meio onde encontra-se o fluoróforo Longo tempo de vida do estado excitado ( ~ 10-9 s) o espectro de fluorescência é muito mais sensível ao meio do que o espectro de asorção (Lakowicz, 1999)
Por que estudar o efeito do solvente? Auxiliar o estudo da estrutura do fluoróforo no estado fundamental e excitado Conhecer o microamiente onde se encontra o fluoróforo - Trp em uma proteína: exposto ao meio aquoso ou no seu interior? - penetração de moléculas na memrana lipídica Modelo de Lippert - fluoróforo esférico - solvente meio contínuo - não são consideradas interações moleculares específicas 1 n 1 ( m ha 1 n 1 as em ) ( m ) 3 Usa o modelo de Clausius- Mosotti para molécula esférica (r = a), polar, em dielétrico: = polarizailidade eletrônica e molecular n = polarizailidade eletrônica
Modelos de memranas iológicas vesículas unilamelares vesículas multilamelares
Sondas fluorescentes incorporam-se à icamada lipídica Estudo das interações: peptídeo/memrana proteína/memrana fármacos/memrana DA/memrana
normalized fluorescence intensity Fluoróforo em memranas lipídicas (Vequi-Suplicy, Benatti, Lamy, JF 006) H 3 C Laurdan H 3 C exc = 340 nm C 1.0 30 o C 70 o C 0.8 50 o C DPPG 0.6 60 o C 40 o C P P H H H H P P T m (CH (CH 3 ) + 3 3 ) + 3.. 0.4 DMPG DMPG 0. 0.0 400 40 440 460 480 500 50 540 560 580 5-PCSL 5-PCSL (nm) T m ~ 41 o C H H 1- SASL 1- SASL
I em (normalized) I em (normalized) Estudo da interação peptídeo/memrana H H CH CH CH C 3 C C C C H H H H H H CH C C H H CH 3 S CH CH H C C H C CH C H C H C H H CH CH C H C C H H H C H CH H CH CH CH CH H C C H H C H H C H C H C H H3 CH CH CH CH C C H C H -MSH H C CH 3 3 CH C C C H H H Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val 1,0 a) Aqueous solution 357 nm 34 nm exc = 96 nm 1,0 ) DMPG dispersion 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0, 0, 0,0 0,0 300 330 360 390 40 450 300 330 360 390 40 450 (nm) (Fernandez et al., 003) (nm)
Anisotropia de fluorescência Asorção de foton: momento de dipolo é criado no fluoróforo (momento de dipolo de transição) Z X Radiação polarizada I Momento de Dipolo de Asorção I Y e Momento de Dipolo de Emissão r a er
Campo Elétrico da luz incidente Excitação é foto-seletiva não ocorre asorção e dipolo elétrico de asorção a r er a asorção máxima asorção cos A
Anisotropia de fluorescência (experimento) anisotropia experimental A A I I // // I I vv vv I I GI GI vh vh Sensiilidade do detector à polarização G I I hv hh
Anisotropia de fluorescência Se a molécula está parada: A 0 5 3cos 1 Ao anisotropia fundamental Momento de Dipolo de Asorção Momento de Dipolo de Emissão
Anisotropia de fluorescência Se a molécula gira durante o tempo de vida do estado excitado: Fornece informações acerca da moilidade da molécula no meio.
Despolarização da emissão: mede movimento do fluoróforo Fluoróforo pode girar durante o tempo de vida do estado excitado Dipolo de emissão t = 0 Dipolo de asorção Dipolo de emissão t > 0 Emissão: tem componente perpendicular à asorção anisotropia A I I // // I I
anisotropy Anisotropia de fluorescência Laurdan em icamadas lipídicas T m Em =480 nm 0.8 0.4 0.0 DLPC DPPG DPPG T m ~ 41 o C 0.16 0.1 0.08 DLPG T m ~ 0 o C 0.04 10 0 30 40 50 60 70 Temperature ( o C)
Contagens Fluorímetro com resolução temporal Semiespelho amostra Laser pulsado monocromador fotomultiplicadora fotomultiplicadora partida Conversor tempoamplitude chegada 10000 1000 a a - KKA-0 - RKK3-0 c - RKK3-30 100 c 10 1 0 0 40 60 80 100 tempo (ns) 34
contagens Fluorímetro com resolução temporal Cinética do decaimento do estado excitado 10000 1000 100 10 I(t) : função de decaimento, após excitação por um pulso de luz 1 0 500 1000 1500 000 tempo (ns) 35
Counts Fluorescência resolvida no tempo - k R decaimento radiativo - k CI conversão interna - k is cruzamento intersistemas - k q (Q) supressão (quenching)... outros processos 10 4 10 3 10 10 1 10 0 -MSH in water 0 10 0 30 40 50 Time (ns) a k R k R (t) (0) e t / exp A k R exp 1/ k T d dt k R k CI k IS k q I ( t) e t exp k T
Contagens Fluorescência resolvida no tempo Decaimentos complexos: multiexponencial 10000 t t 1 1 I( t) A e e... 1000 100 10 0 0 40 60 80 100 Tempo (ns) Critério de ajuste:
Counts Interação Trp/memrana tamém pode ser monitorada pelo aumento do tempo de vida do estado excitado do fluoróforo 10 4 10 3 fluorescência resolvida no tempo -MSH Maior taxa de desexcitação não radiativa do fluoróforo (conversão interna, k CI ) por interação com moléculas de H 1 (ns) (ns) 3 (ns) 10 10 1 in water in DMPG em H 3.68.8 0.54 em DMPG 5.34.45 0.6 10 0 exp 0 10 0 30 40 50 I k T Time (ns) ( t ) i i e t 1/ k k k k k T R ι CI IS q Em DMPG, maior exp e maior rendimento quântico F = I em /I as = k R /k T = exp / R
Supressão de Fluorescência Supressão Estática Formação de complexos não fluorescentes Supressão Dinâmica (ou colisional) Colisões durante o tempo de vida do estado excitado F Q F Q F Q F Q Mede acessiilidade/distância do fluoróforo às moléculas supressoras F
Supressão Colisional Fluoróforo excitado interage (curto alcance) com átomo ou molécula supressora F* F Q Aumenta taxa de transições não-radiativas para o estado fundamental. Diminui intensidade Diminui tempo de vida 40
Supressão Colisional F* Intensidade: F o = k R / (k R + k R ) Tempo de vida: o = 1/ (k R + k R ) F* F Q Intensidade: F = k R / (k R + k R +k q [Q]) Tempo de vida: = 1/ (k R + k R +k q [Q]) Stern-Volmer F k 0 o q 1 [ Q ] F k k R R 41
Emission Intensity Counts Supressão Colisional 500 10000 000 1000 1500 100 1000 500 10 0 80 30 360 400 440 Wavelenght (nm) F 0 1 K [ Q SV ] F 1 0 10 0 30 40 50 Time / ns 0 1 K [ Q d ] K SV K d k R k q k R k q o 4
43 ) )( ( 10 4 3 0 q f q f D D R R k ] [ 1 0 Q K d o q R R q d k k k k K Supressão Colisional Processo difusão Taxa de colisões o d q o K k k
Supressão Colisional 5 4 3 - MSH em agregados micelares 6 1 ( CH )n Supressão por alquilpiridinio CH 3 n = 1,,3,5,8 e 9 -MSH k q (10 8 M -1 s -1 ) EP + HP + DP + tampão 117 88 50 SDS 7. 5 8.3 5.1 SDS-PE 4.1 8.4 4.6 LUTRL 1.3 1.7 1. agregados: menor difusão da sonda e do supressor (A.P.Romani and A.S.Ito, Biophys Chem 009) 44
... Fluorescência Deslocamento espectral Anisotropia de fluorescência Intensidade de fluorescência Tempos de vida de fluorescência Tempos de correlação rotacional Efeitos de solventes Supressão de fluorescência Transferência de energia Excitação multi-fótons Microscopia de fluorescência Correlação de fluorescência Detecção de Molécula Única
Agradecimentos especiais: Amando S. Ito (FFCL-RP-USP) Cássia Marquezin (IF-UFG) Cintia C. Vequi-Suplicy (IFUSP) 46
Biliografia Physics of Atoms and Molecules B.H. Bransden, C.J. Joachain Principles of Fluorescence Spectroscopy J.R. Lakowicz Molecular Fluorescence: Principles and Applications B. Valeur -. Série dos livros de Topics in Fluorescence Spectroscopy Ed. J.R. Lakowicz 47