Introdução à Fluorescência. 1ª aula

Transcrição

1 Introdução à Fluorescência 1ª aula 1

2 Técnicas espectroscópicas Interação da radiação eletromagnética com a matéria Absorção Absorção/Emissão Em biomoléculas: estrutura e dinâmica função

3 Luminescência Emissão de fótons de estados eletrônicos excitados UV e visível fluorescência singleto singleto 10-8 s fosforescência tripleto singleto s Cromóforos - moléculas que absorvem luz Fluoróforos - moléculas que fluorescem Geralmente possuem elétrons delocalizados/duplas ligações/anéis

4 Estado Singleto: S = 0 Estado Tripleto: S = 1 Diagrama de Jablonski S 2 conversão interna (~10-12 s) S 1 ( fluor ~ 10-9 s) cruzamento inter-sistema bsorção (10-15 s) fluorescência k NR T 0 ( fosf ~ 10-3 s) fosforescência S 0

5 Fluorescência sulfato de quinina, fluoresceína, rodamina, brometo de etídio luz branca luz UV espectros de emissão

6 Fluorescência: primeiras observações 1565 infusão da madeira Lignum Nephriticum (N. Monardes) Herschel 1845 observação de fluorescência em uma solução de quinino água tônica (Wikipedia)

7 Fluorescência: primeira observação rigorosa Stokes (1852) Quinino Absorve luz no ultra-violeta: abs = 350 nm Emite no visível: em = 450 nm

8 Fluorescência Deslocamento espectral Anisotropia de fluorescência Intensidade de fluorescência Tempos de vida de fluorescência Tempos de correlação rotacional Efeitos de solventes Supressão de fluorescência Transferência de energia Excitação multi-fótons Microscopia de fluorescência Correlação de fluorescência Detecção de Molécula Única...

9 Energia Excitado Princípio de Franck-Condon abs em Fundamental Todas as transições eletrônicas ocorrem sem que as posições dos núcleos se alterem: transições verticais absorção emissão absorção emissão Coordenada 9

10 Fluoróforos naturais (Lakowicz, 1999)

11 Fluoróforos naturais em Proteínas Green Fluorescent Protein (GFP) Água-viva bioluminescente Aequorea victoria. Cromóforo formado espontaneamente por enovelamento da cadeia polipeptídica, e ciclização (Ser-65, Tyr-66, Gly-67) Inserção do gen para GFP em células e uso da proteína como sonda. 11

12 Interação da radiação eletromagnética com a matéria modelo semi-clássico radiação: onda EM matéria: estados quantizados de energia 12

13 Fluorímetro de estado estacionário amostra lâmpada monocromador de excitação monocromador de emissão cm -1 ) fotomultiplicadora Intensidade Normalizada água DLPC 20 o C Água DLPC 20 o C H 3 C H 3 C Prodan N nm) C O 13

14 Grande sensibilidade da fluorescência ao meio onde encontra-se o fluoróforo absorção Prodan emissão Absorbância Normalizada 1.0 Água Metanol Acetonitrila 0.8 Diclorometano Clorofórmio 0.6 Ciclohexano Intensidade Normalizada cm -1 ) Água Metanol Acetonitrila Diclorometano Clorofórmio Ciclohexano nm) nm) Nome Fórmula e m (D) n r (g/cm 3 ) Df * Ciclohexano C 6 H ~ Clorofórmimo CHCl Diclorometano CH 2 Cl Acenonitrila C 2 H 3 N Df e 1 2e 1 2 n 2n Metanol CH 3 OH Água H 2 O

15 Grande sensibilidade da fluorescência ao meio onde encontra-se o fluoróforo Longo tempo de vida do estado excitado ( ~ 10-9 s) o espectro de fluorescência é muito mais sensível ao meio do que o espectro de absorção (Lakowicz, 1999)

16 Por que estudar o efeito do solvente? Auxiliar o estudo da estrutura do fluoróforo no estado fundamental e excitado Conhecer o microambiente onde se encontra o fluoróforo - Trp em uma proteína: exposto ao meio aquoso ou no seu interior? - penetração de moléculas na membrana lipídica Modelo de Lippert - fluoróforo esférico - solvente meio contínuo - não são consideradas interações moleculares específicas 2 e 1 n 1 ( m ha 2e 1 2n abs em ) ( m ) 3 2 Usa o modelo de Clausius- Mosotti para molécula esférica (r = a), polar, em dielétrico: e = polarizabilidade eletrônica e molecular n = polarizabilidade eletrônica

17 Explicação no quadro: modelo de Lippert 17

18 Bibliografia Physics of Atoms and Molecules B.H. Bransden, C.J. Joachain Principles of Fluorescence Spectroscopy J.R. Lakowicz Molecular Fluorescence: Principles and Applications B. Valeur -. Série dos livros de Topics in Fluorescence Spectroscopy Ed. J.R. Lakowicz 18