Fisiologia microbiana Nutrição e crescimento Nutrição microbiana Componentes necessários às células Meios de cultura Condições ambientais Crescimento populacional Velocidade de crescimento Tempo de geração Medidas do crescimento
Introdução Nutrição de microrganismos Nutricionalmente são os mais versáteis e diversificados. Alguns podem viver com poucas substâncias inorgânicas, enquanto outros são tão exigentes quanto o homem. Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório: - Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais. - Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são desconhecidas. Ex: Mycobacterium leprae (causador da hanseníase) precisa de hospedeiro para ser cultivado.
Necessidade de meios de cultura adequados Para o cultivo laboratorial (in vitro) são utilizados meios de cultura que simulam e até melhoram as condições naturais. Os elementos químicos principais para o crescimento das células são denominados macronutrientes (C, N, H, O, S, P). O carbono é um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano. Com exceção para CO2, os compostos orgânicos são os que contém carbono
Macronutrientes: - Necessários em grande quantidade. - Tem papel importante na estrutura e metabolismo. Micronutrientes: - Necessários em quantidades mínimas. - Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas C N H P, S, K, Na... célula Matéria seca Água
Componentes necessários às células Macronutrientes Fonte de carbono: - Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos): carboidratos lipídeos proteínas - Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos): É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou compostos inorgânicos. Fonte de Nitrogênio: - É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %. (constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.) moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos) moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2) A capacidade de algumas bactérias em utilizar o nitrogênio atmosférico (FBN) é de fundamental importância para a vida de todos os seres.
Componentes necessários às células Hidrogênio: - Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos. (água, sais e gases) Função: Manutenção do ph Formação de ligações de H entre moléculas Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração Oxigênio: - Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos) - É obtido a partir das proteínas e gorduras. Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.
Componentes necessários às células Outros macronutrientes: P Síntese de ácidos nucléicos, ATP S Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas K Atividade de enzimas Mg Estabilidade dos ribossomos Ca Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos Na Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15% de sal. Fe Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
Componentes necessários às células Micronutrientes Metais em quantidades muito pequenas (traços) necessários na composição de um meio de cultura: Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação) - Nem sempre sua adição é necessária - Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra pura podem apresentar deficiências desses elementos. Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte o N2 para NH3 durante a FBN.
Água e outros aditivos Água: - Componente absolutamente indispensável (com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas) No laboratório de utiliza água destilada, filtrada e deionizada. Outros aditivos: Função de aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o ph: Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos EDTA, ácido cítrico, polifosfatos. Inibidores Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger Utiliza-se Fosfato e ph < 2 para reprimir o ácido oxálico
Outros aditivos Tampões - Carbonato de cálcio - Fosfatos - Proteínas (peptona) Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores. Ex: celulose induz a celulase pectina induz a pectinase amido induz a amilase Antiespumantes: cultivos com aeração ocorre a produção de espuma Remoção de células, perda do produto, contaminação Redução do volume do meio álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis: reduzem a tensão superficial das bolhas
Meios de cultura Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos. Não existe um meio de cultura universal, mas Existem vários tipos meios para diversas finalidades Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de suas exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e proporção adequada. Classes Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água) Complexos (utilizam hidrolisados carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro, leite, solo e rúmem de bovino)
Meios de cultura
Meios quimicamente definidos são utilizados para determinar as necessidades nutricionais Até 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos. Robert Koch introduziu os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras). Meio de cultura solidificado com 1,5 % de ágar. Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais. 3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de suplementos orgânicos.
Meios de cultura Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem centenas de formulações para inúmeras finalidades. Alguns são meios gerais: permitem o crescimento de muitas espécies Outros são meios específicos: servem para identificação de espécies, por ex. Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey
Microplacas com diferentes meios de cultura para identificação de enterobactérias.
Meios de cultura para bactérias Normalmente imitam o habitat normal Ex. Se a bactéria prefere os nutrientes encontrados no sangue, então o sangue é adicionado no meio de cultura. As bactérias podem ser autotróficas ou heterotróficas. Meio definido para quimioautotróficas Meio definido para heterotróficas Meio complexo para heterotróficas
Meios de cultura para fungos Todos os fungos são heterotróficos Geralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicos providos pela peptona e extratos de carne ou soja. Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e ph menor (3,8 a 5,6) do que os meios para bactérias. Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.
Meios de cultura para protozoários Os protozoários são heterotróficos aeróbios com exigências nutricionais complexas Muitos não são cultivados in vitro. Os que são necessitam muitos complementos, como emulsões de tecidos cerebrais, soro fetal, infusão de fígado e células bacterianas. Ex: Tetrahymena pyriformis necessita de um meio contendo 10 aminoácidos, 7 vitaminas e sais inorgânicos. Tetrahymena pyriformis não é patogênico mas é utilizdo para diversas pesquisas médicas e biológicas.
Meios de cultura para algas As algas utilizam luz como energia, dióxido de carbono, água e íons inorgânicos solúveis. São fotoautotróficos. Ao contrário dos meios para bactérias e fungos, existem poucos meios prontos para algas. Preparar um meio definido para algas marinhas pode ser muito trabalhoso, pois muitos sais contidos na água do mar poderão ser necessários. Maré vermelha. Algas que produzem toxinas. Algas unicelulares
Meios especiais Meios para anaeróbios: adição de agentes redutores (tioglicolato de sódio) Meios seletivos: favorece o crescimento de um tipo particular ou suprime outros. Ex. meio ágar verde brilhante. Meios diferenciais: para diferenciar microrganismos dentro de uma cultura mista. Ex. meio com sangue para distinguir as hemolíticas. Meios seletivos/diferenciais: Ex. Meio McConkey que contém sais de bile e cristal violeta. Meios de enriquecimento: se objetiva o aumento de uma determinada espécie sem inibir as demais. Ex. isolar bactérias que oxidam fenol, fornecendo fenol como única fonte de carbono.
MEIOS DE CULTURA Meios de Cultura Como determinar uma composição inicial para um meio de cultivo? Passo 1: utilizar dados da composição elementar Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessários de 1,3 g (13%) de N ou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N) Obs: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem introduzir o excesso de um deles. Com relação ao carbono considerar também fração para energia e manutenção (heterotróficos) Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de glicose (40% de C) Fração para energia e manutenção (45%): YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1 e assim por diante. Passo 2: otimização Composição elementar média (% do peso seco) Elemento Bactéria Fungo Carbono 52 51 hidrogênio 7 7 Nitrogênio 13 8,5 Fósforo 2,5 0,4-4,5 Enxofre 0,6 0,1-0,5 Potássio 2,5 0,2-2,5 Sódio 0,75 0,02-0,5 Cálcio 0,55 0,1-1,4 Magnésio 0,25 0,1-0,5 Cloro 0,5 - Ferro 0,1 0,15 Relação C:N média 4:1 6:1 Relação C:N:P:S 85:23:4:1
Condições ambientais (fatores abióticos) Temperatura Oxigênio ph Pressão osmótica, atmosférica, hidrostática Radiação eletromagnética
Temperatura Grupos 1. Psicrófilos temperatura ótima abaixo de 15 oc, suscetíveis de crescer a 0 oc. 2. Mesófilos temperatura ótima 20o - 40 oc, maioria dos patógenos humanos. 3. Termófilos temperatura ótima acima de 45 oc.
Efeito do oxigênio no crescimento microbiano Durante as reações de redução do O2 são formados vários intermediários tóxicos. Ex: H2O2, OH, O2Os microrganismos aeróbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase para destruir as formas tóxicas Meio gelatinoso com indicador redox: Rosa quando oxidado Incolor quando reduzido Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio aerotolerante
Sistema para cultivo de anaeróbios
Sistema para cultivo de aeróbios Equipamentos que transferem oxigênio ao meio de cultura
ph Ao contrário da temperatura, o ph ótimo para o crescimento encontrase no valor médio da variação sobre o qual o crescimento acontecerá, Os microrganismos são encontrados em todos os ambientes e portanto em todas as condições de ph. Quando cultivados in vitro, o meio sofrerá alterações à medida que os metabólitos ácidos ou alcalinos são produzidos. Necessário a adição de um tampão ao meio.
Pressão osmótica Não devem existir grandes diferenças na concentração de solutos dentro e fora da célula, pois podem desidratar-se ou romper-se. Ex: microrganismos marinhos necessitam de teores de sais mais elevados.
CRESCIMENTO MICROBIANO Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de células Na maioria dos procariotos ocorre a fissão binária: crescimento e divisão Varia de minutos até dias Depende muito das condições ambientais
O padrão de crescimento é o exponencial
Tratando-se bactérias, algas unicelulares e leveduras que se multiplicam por divisão binária, temos: 21 > 22 > 23> 24 N = N0.2n Onde N = n microrganismos ao fim de n divisões (gerações) N0 é o número inicial O número de gerações será: n = 3,3(logN - logn0 ) A velocidade exponencial de crescimento (R) é expressa pelo número de divisões no tempo: n R= t - t0 A recíproca de R é o tempo de geração: G= 1 t - t0 = R n
O ciclo de crescimento A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma população microbiana O crescimento de microrganismos apresenta um ciclo típico com todas as fases de crescimento.
1) Fase Lag Período de adaptação da cultura Mudança de meio, preparação do complexo enzimático Reparação das células com danos. 2) Fase exponencial Fase mais saudável das células onde todas estão se dividindo. A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as velocidades de crescimento são bastante variáveis: - Procarióticos crescem mais rapidamente que os eucarióticos - Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores
3) Fase estacionária: Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial não pode ocorrer indefinidamente. Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos. Divisão = morte crescimento líquido nulo Ainda pode ocorrer catabolismo e produção de metabólitos secundários 4) Fase de morte (declínio): A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as células ao processo de morte. A morte celular é acompanhada da lise celular
MEDIDAS DO CRESCIMENTO Podem ser realizadas pelos seguintes métodos: 1) Peso seco total das próprias células filtração, secagem e pesagem 2) Peso de algum componente celular extração, secagem e pesagem 3) Variação no número de células a) contagem de células totais (direta) b) contagem de células viáveis (indireta)
Contagem microscópica direta Utilizam-se câmaras especiais de contagem (lâmina com grade quadriculada) Ex.: Câmara de Neubauer Vantagens: método rápido e fácil Desvantagens: Não distingue as células vivas das mortas Pode-se omitir células pequenas Células móveis precisam ser imobilizadas
Contagem de células viáveis (indireta) Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.
Diluição das suspensões celulares Amostras concentradas precisam ser diluídas São empregadas várias diluições decimais porque é difícil prever o número de viáveis. É c o n ta da a pla c a c o m 3 0 a 3 0 0 c o lô n ia s
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO - Outros métodos Turbidimetria As células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio Pode ser medida com um espectrofotômetro O uso da turbidimetria exige a construção de uma curva padrão Turbidez X quantidade de células
Contagem eletrônica