PANO PRETO IMPREGNADO COM O FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO Metarhizium anisopliae REDUZ A SOBREVIVÊNCIA DE Culex quinquefasciatus

PANO PRETO IMPREGNADO COM O FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO Metarhizium anisopliae REDUZ A SOBREVIVÊNCIA DE Culex quinquefasciatus Jonathan Willian Bastos dos Santos, Adriano Rodrigues de Paula, Ruth de Souza Braga Dias, Anderson Ribeiro, Welington Sérgio Silva Idalino, Richard Ian Samuels Universidade Estadual do Norte Fluminense/Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias- Laboratório de Entomologia e Fitopatologia, Av. Alberto Lamego, 2000, Campos dos Goytacazes-RJ. jonatan_o_kara@hotmail.com, biodepaula@yahoo.com.br, ruthdias.psi@gmail.com, anderson.ribeirorj@yahoo.com.br, welington.sergio@hotmail.com, richard@uenf.br Resumo - No presente estudo foi observado, em condições de laboratório, a patogenicidade e virulência do fungo Metarhizium anisopliae contra mosquitos fêmeas e machos de Culex quinquefasciatus. Testes de semicampo simulando um cômodo residencial também foram realizados. As fêmeas e machos de C. quinquefasciatus foram suscetíveis aos dois isolados de Metarhizium anisopliae (ESALQ 818 ou LPP 45). Nos testes feitos em condição de semicampo simulando um cômodo residencial as fêmeas expostas aos panos pretos impregnados com ESALQ 818 apresentaram taxa de sobrevivência (28%) significativamente menor comparado com controle (78%). A redução da população de C. quinquefasciatus provavelmente diminuirá a doença filariose. Palavras-chave: Fungo entomopatogênico. Metarhizium anisopliae. Culex quinquefasciatus. Área do Conhecimento: Ciências Biológicas. Introdução O mosquito Culex quinquefasciatus é o principal vetor do nematoide Wuchereria bancrofti responsável pela doença filariose linfática. Mais de 1,3 bilhões de pessoas em 72 países em todo o mundo estão vulneráveis a filariose (WHO, 2012). O constante uso de inseticidas químicos para o controle de insetos tem ocasionado à resistência fisiológica de importantes vetores, como o mosquito Anopheles gambiae (KOEKEMOER et al., 2011; KOFFI et al., 2012), Aedes aegypti (DUSFOUR et al., 2011; LIMA et al., 2011), Culex pipiens (LABBE et al., 2007; LIU et al., 2011). Além disso os inseticidas químicos podem ser tóxicos ao ambiente e aos animais. Os fungos entomopatogênicos são potenciais candidatos para ao controle de mosquitos vetores. Os fungos Metarhizium anisopliae ou Beauveria bassiana foram virulentos contra o mosquito da malária Anopheles (SCHOLT et al., 2003; MNYONE et al., 2009; MNYONE et al., 2010), da dengue Aedes aegypti (SCHOLTE et al., 2007; PAULA et al., 2008; LELES et al., 2010; PAULA et al., 2011) e da filariose C. quinquefasciatus (SCHOLTE et al., 2003). No presente estudo foi observado, em condições de laboratório a patogenicidade e virulência de dois isolados de M. anisopliae contra mosquitos fêmeas e machos de C. quinquefasciatus. Testes de semicampo utilizando fungo contra fêmeas também foram realizados. A redução da população de C. quinquefasciatus provavelmente diminuirá a doença filariose. Metodologia Os mosquitos adultos de C. quinquefasciatus foram criados em pote plástico de 30 x 20 x 20 cm, recoberto com tecido organza branco e mantido a temperatura de 25 ºC, com 75% UR e 12h foto período. Os mosquitos foram alimentados com sacarose 10% disposto em alimentadores artificiais (30 ml). A alimentação sanguínea foi ofertada utilizando um camundongo imobilizado numa malha de arame. As fêmeas fizeram a postura em copos plásticos contendo água de torneira onde eclodiram as larvas. As pupas foram coletadas, colocadas em copos plásticos com água e mantidas em potes plásticos até a emergência dos insetos adultos. Os testes de laboratório foram feitos com fêmeas e machos (separadamente) de C. quinquefasciatus (Figura 1). Nos ensaios de semicampo somente fêmeas foram utilizadas. Figura 1 (A) Fêmea de Culex quinquefasciatus (B) Macho de Culex quinquefasciatus. Fonte: http://medent.usyd.edu.au/arbovirus/mosquit/photo s/mosquitophotos_culex.htm. Acesso 7-10 13. 1

Sobrevivência (%) Nos ensaios de laboratório dois isolados do fungo M. anisopliae (ESALQ 818 ou LPP 45) foram utilizados contra os mosquitos (fêmeas e machos). A infecção dos mosquitos foi feita utilizando um pano preto (100% de algodão) de 8 x 6 cm autoclavado por 15 minutos a 1 atm (121 o C). O pano preto foi imerso em 200 ml de uma suspensão do fungo formulado com 0,05% de Tween 80 (TW) na concentração de 1x10 9 conídios ml -1 e mantido em varal de chão por 24 h horas numa sala com temperatura média de 26 ºC. A concentração final dos conídios no pano preto foi de 1x10 8 conídios cm 2. Depois o pano preto foi colocado dentro de um pote de plástico de 7 x 5 cm juntamente com 10 mosquitos fêmeas ou machos. Para manipulação os mosquitos adultos foram adormecidos utilizando 30 segundos de uma corrente de dióxido de carbono. O experimento controle foi feito igualmente, entretanto o pano preto foi tratado sem o fungo. Para cara ensaio foram utilizados 3 potes plásticos com 10 insetos totalizando 30 insetos por tratamento. No teste de semicampo cinco panos pretos de 20 x 15 cm foram impregnados o isolado ESALQ 818 + TW e mantidos num varal de chão por 24 h. Depois os panos pretos foram fixados com auxílio de uma fita adesiva (Silver Tape marca: Scotch 3M) embaixo de móveis (1 cadeira e 2 mesas) da sala experimental (Figura 2 A)]. Duas salas foram utilizadas: uma para o tratamento com ESALQ 818 e outra para o controle (TW). Cinqüenta mosquitos (fêmeas) de C. quinquefasciatus foram liberados na sala. Os mosquitos ficaram expostos aos panos por 5 dias, depois uma armadilha [BG-Sentinel ; Biogents Ltd.(Figura 2 B)] foi instalada na sala por 48 h para captura das fêmeas vivas. A armadilha foi utilizada em combinação com um atraente (BG Lure ; Biogents Ltd.). Uma inspeção minuciosa foi feita na sala a procura de mosquitos vivos e nenhum foi encontrado fora da armadilha. Figura 2 - (A) Pano preto fixados em móveis em condições de semicampo. (B) Armadilha de captura de insetos vivos. Fonte: Elaboração dos autores (2013). Todos os experimentos foram repetidos três vezes. A homogeneidade dos experimentos foi determinada usando o teste de Log-Rank (ELANDT- JOHNSON et al, 1980) em nível de significância de 95%. Os resultados foram agrupados para análise da curva de sobrevivência, média percentual da sobrevivência e desvio padrão. As comparações das médias de sobrevivência dos mosquitos foram calculadas usando análise de variância (ANOVA) de uma via e teste post-hoc de Duncan. O tempo médio de sobrevivência (S 50 ) foi calculado pelo método de Kaplan-Meier (BLANFORD et al., 2005). Curvas de sobrevivência foram comparadas usando Log- Rank. Resultados As fêmeas de C. quinquefasciatus foram suscetíveis aos dois isolados de M.anisopliae (ESALQ 818 ou LPP 45) apresentando taxas de sobrevivência significativamente menores do que o controle (F 2,8 = 125,84 ; P<0,001; Figura 3). O isolado ESALQ 818 foi o mais virulento, comparado com o isolado LPP 45. 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dias ESALQ 818 LPP 45 CONTROLE Figura 3 Curvas de Sobrevivência de fêmeas de Culex quinquefasciatus expostas a dois isolados do fungo Metarhizium anisopliae ESALQ 818 ou LPP 45. A Tabela 1 mostra que o isolado ESALQ 818 causou menor taxa de sobrevivência de fêmeas de C. quinquefasciatus (21,1%) comparado com a porcentagem de sobrevivência das fêmeas expostas ao isolado LPP 45 (54,4%). Somente o isolado ESALQ 818 apresentou valor do S 50 (3 dias). O tratamento controle teve 74,4% de sobrevivência de fêmeas de A. aegypti. Tabela 1 Sobrevivência (%) e Tempo Médio de Sobrevivência (S 50 ) de fêmeas de Culex quinquefasciatus expostas aos dois isolados de Metarhizium anisopliae ESALQ 818 ou LPP 45. Tratamento Sobrevivência (%) ± DP S 50 ESALQ 818 21,1 ± 10,45 a 3 LPP 45 54,4 ± 4,72 b ND Controle 74,4 ± 1,52 c ND DP = Desvio Padrão. ND = Dados não determinados. Os valores com letras diferentes indicam que os resultados foram estatisticamente diferentes quando comparados usando o teste post-hoc de Duncan (5% probabilidade). 2

Sobrevivência (%) Os isolados ESALQ 818 e LPP 45 foram virulentos contra machos de C. quinquefasciatus. As taxas de sobrevivência de machos expostos aos isolados ESALQ 818 ou LPP 45 foram significativamente menores comparado com o controle (F 2,8 = 252,00; P>0,001; Figura 4). Contudo o isolado ESALQ 818 causou menor taxa de sobrevivência de machos de C. quinquefasciatus (18,8%) comparado com o tratamento feito com o isolado LPP 45 (58,8% de sobrevivência). Somente o isolado ESALQ 818 teve valor do S 50 (3 dias). Foram verificados 78,8% de machos vivos no tratamento controle (Tabela 2). 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dias ESALQ 818 LPP 45 CONTROLE Figura 4 Curvas de Sobrevivência de machos de Culex quinquefasciatus expostos a dois isolados de Metarhizium anisopliae ESALQ 818 ou LPP 45. Tabela 2 Sobrevivência (%) e Tempo Médio de Sobrevivência (S 50 ) de machos de Culex quinquefasciatus expostos a dois isolados de Metarhizium anisopliae ESALQ 818 ou LPP 45. Tratamento Sobrevivência (%) ± DP S 50 ESALQ 818 18,8 ± 10,36 a 3 LPP 45 58,8 ± 5,11 b ND Controle 78,8 ± 2,05 c ND DP = Desvio Padrão. ND = Dados não determinados. Os valores com letras diferentes indicam que os resultados foram estatisticamente diferentes quando comparados usando o teste post-hoc de Duncan (5% probabilidade). O isolado ESALQ 818 foi o mais virulento contra fêmeas e machos de C. quinquefasciatus, sendo selecionado ser utilizado nos testes de semicampo. As fêmeas expostas a cinco panos pretos impregnados com ESALQ 818 numa simulação de um cômodo residencial apresentaram taxas de sobrevivência 28% (± 2,64) significativamente menor comparado com a sobrevivência das fêmeas expostas a cinco panos pretos impregnados com TW 73% (± 2,08) (F 1,5 = 748,16; P<0,001). Discussão Os fungos entomopatogênicos são potenciais candidatos para o controle de mosquitos vetores. Nos ensaios de laboratório foi observado que as taxas de sobrevivência de fêmeas ou machos de C. quinquefasciatus expostos aos isolados ESALQ 818 ou LPP 45 foram significativamente menores comparado com as porcentagens de sobrevivência dos mosquitos nos tratamentos controles (P<0,01). A virulência de M. anisopliae contra fêmeas ou machos de C. quinquefasciatus foi observada por Scholte et al., 2003. A seleção de isolados altamente virulentos torna-se importante quando visamos à utilização de pano preto no campo. No atual trabalho o isolado ESALQ 818 foi o mais virulento contra fêmeas e machos de C. quinquefasciatus (21,1% e 18,8% de insetos vivos, respectivamente), comprado com a virulência do isolado LPP 45 (54,4% e 58,8%). Apesar da baixa virulência sugere-se que mais testes sejam feitos com o isolado LPP 45. Thomas & Read mostraram que alterações relativamente pequenas nas taxas de sobrevivência do mosquito da malária foram suficientes para reduzir significativamente a capacidade vetorial dos mosquitos. Fungos podem causar efeitos não letais em mosquitos. Por exemplo, já foi verificado que a infecção fúngica prejudicou o desenvolvimento do parasita da malaria (BLANFORD et al., 2005), reduziu a alimentação sanguínea e a fecundidade do mosquito Anopheles (SCHOLTE et al., 2006), diminuiu a capacidade de vôo de Anopheles stephensi (GEORGE et al., 2011). Um estudo recente demonstrou que B. bassiana poderia reduzir a transmissão da malária a zero dentro de um ciclo combinando com a redução da sobrevivência, diminuição da alimentação sanguínea e da capacidade de vôo (BLANFORD et al. 2011). O fungo pode infectar o mosquito através da cutícula permitindo sua aplicação diretamente sobre os insetos, entretanto para insetos voadores, como os mosquitos, a aplicação de suspensões de fungos em superfícies atrativas para o pouso dos mosquitos representa melhor as condições de campo (FARENHORST & KNOLS, 2010). Esse estudo mostrou em condições de semicampo que pequenos panos pretos impregnados com M. anisopliae e fixados em móveis residenciais reduziram a sobrevivência de C. quinquefasciatus. O uso de reservatórios de água impregnado com M. anisopliae foi eficaz para redução da sobrevivência de An. gambiae e Anopheles funestus (FARENHORST et al., 2008). Mnyone et al., 2009 observaram em condições de laboratório que M. anisopliae ou B. bassiana impregnados em panelas de barro ou panos pretos foram virulentos contra A. gambiae. Outra 3

estratégia interessante foi o uso de uma caixa confeccionada de madeira, revestida externamente de tela e internamente com panos pretos impregnados com M. anisopliae contra Anopheles arabiensis (LWETOIJERA et al., 2010). Panos pretos impregnados com fungo foram eficientes para redução da sobrevivência de fêmeas de A. aegypti em condições de laboratório (PAULA et al., 2008) e semicampo (PAULA et al., 2013 aceito). Variação na virulência do fungo pode ocorrer devido à variabilidade genética (HAJEK e ST. LEGER 1994) ou a suscetibilidade do hospedeiro. O isolado ESALQ 818 parece ser promissor contra o mosquito C. quinquefasciatus e contra o mosquito A. aegypti. Resultados preliminares mostraram que o isolado ESALQ 818 foi ao mesmo tempo altamente virulento contra C. quiquefasciatus e A. aegypti em condições de laboratório (testes não concluídos). O fungo M. anisopliae tem diversas características que o torna um bom agente para o controle biológico de mosquitos, especialmente os vetores de malária (SCHOLTE et al., 2003; SCHOLTE et al., 2004) A. aegypti (PAULA et al., 2008; LELES et al., 2010) ou C. quinquefasciatus (SCHOLTE et al., 2003), por ser facilmente produzido em massa e com baixo custo (KHETAN, 2001) tendo um considerável período de vida útil, se for armazenado sob condições apropriadas. Além disso, o fungo não é prejudicial para aves, peixes ou mamíferos. No teste de semicampo a taxa de sobrevivência das fêmeas expostas a panos pretos impregnados com ESALQ 818 foi significativamente menor (28%) da porcentagem de sobrevivência dos insetos no tratamento controle (72%). Nas mesmas condições o mosquito A. aegypti foi altamente suscetível ao isolado ESALQ 818 (PAULA et al., 2013 aceito). Kroeger et at. 2006 observaram redução da sobrevivência de A. aegypti expostos a cortinas impregnadas com inseticidas, entretanto o mesmo método não seria viável utilizando fungo, pois se deve levar em consideração os efeitos prejudiciais da radiação ultravioleta (MORLEY-DAVIS, 1995; CHARNLEY 1997). Formulações em óleo vegetal facilitam a aderência dos conídios (SCHOLTE et al., 2005; BLANFORD et al., 2005), propiciam um micro-ambiente que protege o fungo contra raios ultravioletas, desidratação, além de permitir a aplicação em ultra-baixo volume UBV (PRIOR et al., 1988; BATTA, 2003). Atualmente a viabilidade e persistência dos conídios em condições de campo são inadequadas, exigindo o desenvolvimento de formulações de longa duração (KNOLS et al., 2010). Também deve ser levada em consideração a possibilidade da reaplicação do fungo nos panos, reduzindo assim os gastos com o material. A persistência do fungo impregnado em panos pretos tem sido investigada pelo nosso grupo de pesquisa. A perda da virulência de fungos impregnados em panos pretos tem sido documentada (SCHOLTE et al., 2005; FARENHORST et al., 2008). No entanto, Mnyone et al. (2010) notaram que, apesar do declínio na virulência, a patogenicidade dos conídios de M. anisopliae e B. bassiana durou por 28 dias em panos pretos. Superfícies atrativas para pouso dos mosquitos podem ser colocadas em residências humanas, especificamente em lugares sombreados, garagens, varandas, atrás de armários, embaixo de mesas e camas. Contudo, ainda não foram estudadas as conseqüências médicas do uso do fungo em ambientes humanos (LWETOIJERA et al., 2010). Para ser usado no ambiente intradomiciliar o pano deve ser cortado em um tamanho que não incomode o morador. Nesse estudo foram usados panos pequenos de 20 x 15 cm que proporcionaram significativa mortalidade de C. quinquefasciatus. Panos pretos de 3m 2 como testado por Scholte et al. (2005), apesar de eficazes, não seriam facilmente aceitos pela população. O uso de panos com fungos no ambiente extradomiciliar foi altamente eficaz para o controle de Anopheles (LWETOIJERA et al., 2010), pode ser que o mesmo ocorra para o controle de C.quinquefasciatus. Entretanto o presente trabalho não descartou a possibilidade do uso de pano preto com fungo dentro de residencias. Howard et al., 2010 verificou, em condições de semicampo, a diminuição da alimentação sanguínea do mosquito C. quinquefasciatus, entretanto não foi observada a redução da sobrevivência desse vetor. Esse foi o primeiro trabalho mostrando que o fungo M. anispliae reduziu a sobrevivência de C. quinquefasciatus em condições de semicampo, com potencial para ser utilizado no campo. Conclusão O isolado ESALQ 818 foi altamente virulento contra fêmeas e machos de C. quinquefasciatus em condição de laboratório. Foi observado redução da taxa de sobrevivência de fêmeas de C. quinquefasciatus exposta a panos pretos impregnados com fungo em condição de semicampo. Fungos entomopatogênicos são potenciais candidatos para serem utilizados contra mosquitos no campo. Agradecimentos À UENF e FAPERJ projetos: E-26/111.586 /2008, E-26/110.341/2010 e E-26/102.860/2011. 4

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