ARMADILHA FEITA DE GARRAFA PET COM PANO PRETO IMPREGNADO COM Metarhizium anisopliae REDUZ A SOBREVIVÊNCIA DE Aedes aegypti

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1 ARMADILHA FEITA DE GARRAFA PET COM PANO PRETO IMPREGNADO COM Metarhizium anisopliae REDUZ A SOBREVIVÊNCIA DE Aedes aegypti Adriano Rodrigues de Paula, Anderson Ribeiro, Leila Eid Imad, Eduardo Rodrigues de Paula, Richard Ian Samuels Universidade Estadual do Norte Fluminense - Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias- Laboratório de Entomologia e Fitopatologia, Av. Alberto Lamego, 2000, Campos dos Goytacazes - RJ. biodepaula@yahoo.com.br; Resumo Pano preto impregnado com fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae fixado com uma fita adesiva em móveis residenciais reduz a sobrevivência do mosquito da dengue A. aegypti. Entretanto danos têm sido observados nos móveis após a fixação do pano + fungo com a fita adesiva. O objetivo do atual estudo foi desenvolver uma armadilha suporte para o pano preto + fungo. A armadilha foi feita de garrafa PET transparente com o pano preto + M. anisopliae e testada para infecção de A. aegypti: utilizando uma caixa de acrílico (CA) e numa simulação de um cômodo residencial (SCR). Na SCR foi comparada a sobrevivência de fêmeas expostas a três panos pretos + M. anisopliae fixados em móveis com a sobrevivência de fêmeas expostas a três PETS com pano preto + M. anisopliae. No teste feito na CA foi verificado 14,4% (± 8,35) de mosquitos vivos. Na SCR a taxa de sobrevivência dos mosquitos expostos a panos pretos + M. anisopliae fixados nos móveis (26,6 ± 1,52) foi significativamente igual à sobrevivência dos insetos expostos as PETS com pano preto + fungo (24% ± 1,23). A armadilha PET com pano preto + M. anisopliae foi eficiente para infecção dos mosquitos A. aegypti, podendo ser utilizada em testes de campo. Palavras-chave: Aedes aegypti, Fungo entomopatogênico, Metarhizium anisopliae, semicampo. Área do Conhecimento: Ciências Biológicas. Introdução O mosquito Aedes aegypti é o principal vetor de dengue e métodos convencionais de controle não tem impedido epidemias em todo o mundo (WHO). Adultos de A. aegypti são controlados durante epidemias com uma variedade de métodos de pulverização química ao ar livre, provocando o desenvolvimento de mosquitos resistentes aos inseticidas carbamatos, organoclorados, organofosforados e piretróides utilizados em muitas regiões do Brasil (RANSON et al., 2010). A resistência dos mosquitos a inseticida químico tem sido investigada (DA-CUNHA et al., 2005; MONTELLA et al., 2007; LIMA et al., 2011). Com isso novas abordagens para o controle de insetos devem ser desenvolvidas. O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae foi virulento contra os mosquitos adultos A. aegypti (PAULA et al., 2008; PAULA et al., 2011a; Paula et al., 2011b). Testes utilizando uma gaiola grande ou simulando um cômodo residencial (SCR) mostraram que M. anisopliae impregnado em pano preto fixado em móvel residencial reduziu a sobrevivência de A. aegypti (PAULA et al., 2013a; PAULA et al., 2013b). Mas esse método não seria viável para ser utilizado no campo. A fixação de pano preto com fita adesiva poderia danificar os móveis dos moradores ou desgrudar facilmente inviabilizando o estudo (observação pessoal). O presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma armadilha suporte para o pano preto + M. anisopliae facilitando posteriormente a sua utilização nas residencias. A armadilha foi feita de garrafa PET transparente com pano preto + M. anisopliae e testada para infecção de fêmeas de A. aegypti em condições de semicampo: utilizando uma caixa de acrílico (CA) ou numa SCR. Metodologia Este trabalho foi conduzido no insetário do Laboratório de Entomologia e Fitopatologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes - RJ. A criação dos mosquitos e a produção de fungo seguiram os métodos de Paula et al., Somente fêmeas de A. aegypti de 2ª 3 dias de idade, alimentadas com sacarose, foram utilizadas nos experimentos. 1 1

2 Preparo do pano preto impregnado com o fungo e confecção da armadilha feita de garrafa PET O pano preto de 17 x 11 cm foi imerso em 100 ml da suspensão do fungo + 0,05% de Tween 80 (TW) e mantido em varal de chão por 24 horas (Figura 1). Ensaios utilizando uma caixa de acrílico (CA) Nesse teste duas CA de 100 x 51 x 61 cm foram utilizadas. Numa CA foi feito os testes com uma garrafa PET com pano preto + fungo e na outra foi feito os testes com uma garrafa PET com pano preto sem o fungo (Figura 3). Os mosquitos fêmeas de A. aegypti (n = 50) foram adormecidos por 30s de CO2, liberados na CA ficando expostos a uma armadilha PET por 7 dias. Diariamente o número de insetos mortos foram contabilizados. Figura 1 A - Pano preto imerso na suspensão do fungo. B - Pano preto mantido num varal de chão. Subsequentemente o pano foi pendurado, com auxílio de um arame, dentro de uma garrafa PET transparente com um corte lateral (18 x 12 cm). No fundo da garrafa PET foi colocado gesso para maior estabilidade (Figura 2). A concentração do fungo no pano preto foi de 1x10 8 conídios ml -1. Figura 3 Câmara de observação com mosquitos A. aegypti expostos a uma garrafa PET com pano preto impregnado com o fungo M. anisopliae. Ensaios em condições de semicampo - SCR Figura 2 Armadilha feita de garrafa PET 2 L transparente com pano preto impregnado com fungo entomopatogênico M. anisopliae. Nesse teste foi avaliada a taxa de sobrevivência dos mosquitos expostos a três panos pretos + M. anisopliae fixados em móveis (Figura 4 - A), comparado com as porcentagens de sobrevivência dos mosquitos expostos a três armadilhas feitas de garrafa PET com pano preto + M. anisopliae (Figura 4 B). As três garrafas PET com pano preto + fungo foram colocadas no chão da sala SCR. Quatro salas de semicampo de 9m²/cada foram utilizadas nos testes SCR. Duas salas foram utilizadas para o tratamento com fungo e duas salas foram utilizadas para tratamento controle. As salas foram lavadas com água de torneira, detergente neutro, água sanitária, antibactericida, enxaguadas com água, esterilizadas com álcool (70%) e mantidas abertas por 24 h. Depois dentro de cada sala foram colocados três alimentadores (30mL) com pano absorvente amarelo contendo sacarose (10%), posteriormente os três panos pretos + fungo foram fixados nos móveis ou as 2 2

3 três armadilhas PET com pano + fungo foram colocadas no chão e cinqüenta fêmeas de A. aegypti foram liberadas/sala. As portas possuem telas para evitar a fuga dos mosquitos. Nenhuma sala possui janela, há um exaustor (encapado com tecido organza) para circulação do ar. Cinco dias após a liberação dos mosquitos uma armadilha para a captura de mosquitos vivos (BG-Sentinel ; Biogents Ltd.) com um atraente (BG Lure ; Biogents Ltd.) foi instalada na sala por 24 horas. Depois os mosquitos capturados foram quantificados. Os tratamentos controles foram feitos igualmente, entretanto o pano preto foi impregnado com TW. Resultados Ensaios em condições de laboratório Nos testes feitos utilizando a CA (Figura 5) foi observada significativa redução da taxa de sobrevivência dos mosquitos exposto a uma armadilha PET com pano + fungo (14,4% ± 8,35), comparado com tratamento controle (77,7% ± 2,19). Os mosquitos expostos a uma PET com pano preto + fungo apresentaram valor de S50 4 dias. Sobreivência (%) Dias PET com pano + fungo PET com pano sem fungo Figura 5 Curvas de sobrevivência diária de fêmeas de A. aegypti expostas a uma garrafa PET com pano + fungo dentro de uma caixa de acrílico. Ensaios em condições de semicampo - SCR Figura 4 A - Sala de semicampo (SCR) com três panos pretos impregnados com fungo fixados com uma fita adesiva em móveis residenciais. B - Sala de semicampo (SCR) com três armadilhas feitas de garrafa PET com pano preto + fungo. Os tratamentos controles foram feitos igualmente em outras salas SCR com pano preto sem o fungo. A Tabela 1 mostra que a taxa de sobrevivência dos mosquitos expostos aos três panos pretos + fungo fixados nos móveis residências (26,6 ± 1,52) foi significativamente igual à porcentagem de sobrevivência dos insetos expostos as três garrafas PET com pano preto + fungo (24% ± 1,23) colocada no chão da SCR. Nos tratamentos controles os mosquitos expostos aos três panos pretos sem o fungo fixados nos móveis apresentaram 80% (± 1,73) de sobrevivência, enquanto os insetos expostos as três garrafas PET com pano sem o fungo tiveram 77,3% (± 1,52) de sobrevivência. 3 3

4 Tabela 1 - Resultados do teste comparando as taxas de sobrevivência de fêmeas de A. aegypti expostas às três armadilhas feitas de garrafas PET com pano preto (P) + fungo (F) ou somente ao pano preto (P) + fungo (F) fixado em móveis. Nos testes controles os panos pretos foram tratados com TW. Tratamento PET+P+F PET+P+TW P+F P+TW % 24 a 77,3 b 26,6 80 b Sobrevência a Desvio Padrão 1,23 1,52 1,52 1,73 Os valores seguidos de mesma letra indicam que os resultados não foram estatisticamente diferentes quando comparados usando o teste post-hoc de Duncan (5% probabilidade). Discussão A utilização de fungos entomopatogênicos contra insetos vetores de doenças tem sido alvo de extensas pesquisas desde a publicação de dois importantes artigos em 2005 (BLANFORD et al., 2005; SCHOLTE et al., 2005). Parece haver poucas duvidas que a utilização de fungos terá um papel importante na redução do sofrimento causado por mosquitos vetores de doenças, entretanto estratégias para aplicação do fungo no campo requerem maiores investigações. O primeiro teste de campo utilizando fungo para o controle de mosquitos da malária foi realizado na África, suspendendo lençóis de algodão grandes impregnados com fungos no teto de habitações (SCHOLTE et al., 2005). O resultado deste teste de campo foi promissor com 23% de infecção no mosquito da malária, que conectado a um modelo de transmissão da malária previu uma redução de 75% na intensidade da transmissão. Estudos recentes tem mostrado a eficácia de iscas impregnadas com fungo (M. anisopliae) para o controle de Anopheles arabiensis (LWETOIJERA et al., 2010). Vaso de barro utilizado para armazenamento de água impregnado com M. anisopliae reduziram a sobrevivência de Anopheles gambiae ss e An. funestus sob condições de laboratório (FARENHORST, et al., 2008). Este tipo de abordagem é muito interessante, pois os vasos de barro + fungo podem ser usados no extra-domicílio e intradomicílio, visando tanto mosquitos exofilico como endofilico. Recentemente vários métodos intra-domicílio foram testados usando fungo 1: rede de beiral, 2: pano preto de algodão no beiral, 3: painel de pano de algodão, 4: pano de algodão no beiral inclinados e 5: tiras de pano de algodão ao redor de uma cama ocupada. Estes métodos resultaram numa redução de 39-57% na sobrevivência dos mosquitos (MNYONE et al., 2012). Ensaios utilizando uma gaiola grande de 115 x 60 x 75 cm foram realizados para testar a eficácia de M. anisopliae impregnado em pano de algodão preto (30 x 20 cm) para o controle da vetor da dengue A. aegypti (PAULA et al., 2008). Os resultados mostraram uma redução de 70% na sobrevida ao longo de um período de 7 dias. Na Austrália, o efeito de B. bassiana sobre a sobrevivência, comportamento de alimentação sanguínea e fecundidade foi testado contra A. aegypti em grandes gaiolas (5 x 7 x 4 m), os resultados mostram uma redução de 80% comportamento de alimentação sanguínea e redução na sobrevivência do mosquito 59-95% (DABRO et al., 2012). No entanto, nestas experiências, os mosquitos foram infectados sob condições de laboratório e em seguida liberado para as gaiolas observando modificações no comportamento e sobrevivência. PAULA et al., 2013a demonstraram a eficiência do fungo impregnado em pano preto na redução da sobrevivência de adultos de A. aegypti em condições de semicampo utilizando gaiolas grandes (115 x 60 x 75 cm). Foram observadas reduções significativas na sobrevivência quando o pano preto foi deixado nas gaiolas durante 12h. Tempos de exposição mais longos resultaram em reduções adicionais na sobrevivência dos mosquitos. Foi interessante notar que era possível infectar mosquitos com condições naturais de umidade relativa inferior a 90%. Num estudo recente foi observado que panos pretos de algodão impregnados com M. anisopliae e exposto aos mosquitos por 7 dias numa sala de semicampo, simulando condições de intradomicílio, resultou em significativa diminuição da taxa de sobrevivência de A. aegypti (44%), quando comparado com o controle (76%). A adição do inseticida neonicotinóide Imidacloprid reduziu ainda mais as taxas de sobrevivência (38%), agindo como um agente sinérgico (PAULA et al., 2013b), entretanto os panos pretos foram fixados com uma fita adesiva nos móveis o que no campo não seria viável, pois poderia causar danos econômicos e estéticos. Com isso os atuais resultados mostrando a eficiência da armadilha PET com pano preto + fungo para infecção de mosquitos torna-se importante e apresenta potencial para ser utilizada no campo. Atraentes de mosquitos são muito utilizados em armadilhas de oviposição ou captura. Atraente de oviposição sintético (AtrAedes ) libera um odor 4 4

5 que atrai os mosquitos para um recipiente preto com água (armadilha denominada MosquiTRAP ) associado a um cartão adesivo que prende os mosquitos (EIRAS et al. 2009). A armadilha BG- Sentinel - Biogents Ltd é utilizada com uma substância química baseada em ácido lático (atraente - BG Lure ; Biogents Ltd.) que atrai os mosquitos uma ventoinha suga os mosquitos adultos que ficam presos em um saco coletor (BALL et al., 2010) os mosquitos morrem dentro da armadilha (observação pessoal). Estamos investigando se pano preto impregnado com M. anisopliae associado a um atraente sintético reduzirá ainda mais a sobrevivência do mosquito A. aegypti. Conclusão Nesse estudo a armadilha feita de garrafa PET transparente com pano preto impregnado com fungo M. anisopliae foi eficiente para infecção de fêmeas A. aegypti. Essa armadilha poderá ser colocada dentro de residências para infecção de mosquitos da dengue (testes em andamento) o que provavelmente diminuirá a população de A. aegypti e a incidência de dengue. Agradecimentos À UENF e FAPERJ projetos: E-26/ /2008, E-26/ /2010 e E-26/ /2011. Referências - BALL, T. S; RITCHIE, S. R. Evaluation of BGsentinel trap trapping efficacy for Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in a visually competitive environment. Journal of Medical Entomology. V.47, n.4, p , BLANFORD, S; CHAN, B. H. K; JENKINS, N; SIM, D; TURNER, R. J; READ, A. F; THOMAS, M. B. Fungal pathogen reduces potential for malaria transmission. Science. V.308, p , DARBRO, J. M; THOMAS, M. Persistence and Likelihood of Aeroallergenicity of Entomopathogenic Fungi Used for Mosquito Control. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. V.80, p , DA-CUNHA M.P; LIMA J.B; BROGDON W.G; MOYA G.E; VALLE D. Monitoring of resistance to the pyrethroid cypermethrin in Brazilian Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) populations collected between 2001 and Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. V.100, p , EIRAS, A. E; RESENDE, M. C. Preliminary evaluation of the Dengue-MI technology for Aedes aegypti monitoring and control. Caderno de Saúde Pública do Rio de Janeiro. V.1, p.45-58, FARENHORST, M; FARINA, D; SCHOLTE, E; TAKKEN, W; HUNT, R.H; COETZEE, M; Knols, B.G.J. African water storage pots for the delivery of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae to the Malaria vectors Anopheles gambiae s.s. and Anopheles funestus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, V.78 p , LIMA, E.P; PAIVA, M.H.S; ARAÚJO, A.P; SILVA, E.V.G; SILVA, U.M; OLIVEIRA, L. N; SANTANA, A.E; BARBOSA, C.N; NETO, C.C.P; GOULART, M; WILDING, C. S; AYRES, C.F.J; SANTOS, M.A.V.N. Insecticide resistance in Aedes aegypti populations from Ceará, Brazil. Parasites & Vectors. V.4, n.5, p.2-12, LWETOIJERA, D.W; SUMAYE, R.D; MADUMLA, E.P; KAVISHE, D.R; MNYONE, L.L; RUSSELL, T.L; OKUMU, F.O. An extra-domiciliary method of delivering entomopathogenic fungus, Metharizium anisopliae IP 46 for controlling adult populations of the malaria vector, Anopheles arabiensis. Parasites & Vectors. V.3, p.2-6, MNYONE, L.L; LYIMO, I.N; LWETOIJERA D.W; MPINGWA, M.W; NCHIMBI, N; HANCOCK, P.A; RUSSELL, T.L; KIRBY, M.J; TAKKEN, W; KOENRAADT, C.J.M; Exploiting the behaviour of wild malaria vectors to achieve high infection with fungal biocontrol agents. Malaria Journal. V.41, p.11:87, MONTELLA, I.R; MARTINS, A.J; VIANA- MEDEIROS, P.F; LIMA, J.B; BRAGA, I.A; VALLE, D. Insecticide resistance mechanisms of Brazilian Aedes aegypti populations from 2001 to American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. V.77, p ,

6 - PAULA, A.R; CAROLINO, A.T; SAMUELS, R.I. Efficiency of fungus-impregnated black cloths combined with Imidacloprid for the control of adult A. aegypti (Diptera: Culicidae). Letters in Applied Microbiology. V.57, p , 2013a. - PAULA, A.R; CAROLINO, A.T; SILVA, C.P; SAMUELS, R.I. Testing fungus impregnated cloths for the control of adult A. aegypti under natural conditions. Parasites & Vectors. V.6, p , 2013b. - PAULA, A.R; CAROLINO, A.T; SILVA, C. P; SAMUELS, R.I. Susceptibility of adult females A. aegypti (Diptera: Culicidae) to the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is modified following blood feeding. Parasites & Vectors V.4, n.91, p.2-7, 2011a. - PAULA, A. R; CAROLINO, A. T; PAULA, C.O; SAMUELS, R. I. The combination of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae with the insecticide Imidacloprid increases virulence against the Dengue vector A. aegypti (Diptera: Culicidae) Parasites & Vectors. V.4, n.8, p.2-8, 2011b. - PAULA, A.R; BRITO, E; PEREIRA, C; CARRERA, M.P; SAMUELS, R.I. Susceptibility of adult A. aegypti (Diptera: Culicidae) to infection by Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana: Prospects for Dengue vector control. Biocontrol Science Tecnology. V.18, p.1-21, RANSON, H; ROSSITER, L; ORTELLI, F; JENSEN, B; WANG, X; ROTH, C.W; COLLINS, F.H; HEMINGWAY, J. Identification of a novel class of insect glutathione S-transferases involved in resistance to DDT in the malaria vector Anopheles gambiae. Biochemical Journal, V.359, p , SCHOLTE, E; NG`HABI, K; KIHONDA, J; TAKKEN, W; PAAIJMANS, K; ABDULA, S; KILLEEN, G. F; KNOLS, B. G. J. An entomopathogenic fungus for control of adult African malaria mosquitoes. Science. V.308, p , SCHOLTE, E; NG`HABI, K; KIHONDA, J., TAKKEN, W; PAAIJMANS, K; ABDULA, S; KILLEEN, G. F; KNOLS, B. G. J. An entomopathogenic fungus for control of adult African malaria mosquitoes. Science. V.308, p ,