UTILIZAÇÃO DE UMA ARMADILHA PET COM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO CONTRA Aedes aegypti EM DIFERENTES ESTADOS NUTRICIONAIS

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1 UTILIZAÇÃO DE UMA ARMADILHA PET COM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO CONTRA Aedes aegypti EM DIFERENTES ESTADOS NUTRICIONAIS Leila Eid Imad da Silva, Anderson Ribeiro, Adriano Rodrigues de Paula, Josiane Pessanha Ribeiro, Richard Ian Samuels Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias Laboratório de Entomologia e Fitopatologia, Av. Alberto Lamego, 2000, Campos dos Goytacazes - RJ. imad.saudecoletiva@gmail.com, anderson.ribeirorj@yahoo.com.br, biodepaula@yahoo.com.br, josi.pessanha2@hotmail.com, richardiansamuels@gmail.com. Resumo A armadilha PET com pano preto impregnado com o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae foi eficiente para reduzir a sobrevivência de Aedes aegypti. No presente estudo foi comparada a taxa de sobrevivência de fêmeas de A. aegypti alimentadas com sacarose ou sangue expostas, por diferentes períodos, a armadilhas PET com M. anisopliae. Os testes foram realizados em salas simulando cômodos residenciais. Fêmeas de A. aegypti alimentadas com sacarose expostas as armadilhas PET com fungo por 24h, 48h e 120h apresentaram taxa de sobrevivência de 51,3%, 33,3% e 28,8%, respectivamente. Fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue expostas as armadilhas PET com fungo por 48h, 72h e 120h apresentaram taxa de sobrevivência de 75,3%, 36,6% e 34%, respectivamente. Fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue precisaram de maior tempo de exposição as armadilhas PET com fungo para apresentar significativa redução da taxa de sobrevivência. Tratamentos controle tiveram sobrevivência >78%. Palavras-chave: Vetor, Metarhizium anisopliae, Mosquito, Infecção. Área do Conhecimento: Ciências biológicas. Introdução As fêmeas do mosquito Aedes aegypti são responsáveis pela transmissão dos vírus da febre amarela urbana, chikungunya, Zika e dengue. Felizmente, existe uma vacina contra o vírus da febre amarela urbana. A vacina contra vírus da dengue está em fase final de desenvolvimento e não existe vacina contra os vírus da chikungunya e Zika. O constante uso dos inseticidas sintéticos para o controle dos insetos provocou o aumento de população de mosquitos resistentes (MONTELLA et al., 2007; LIMA et al., 2011). Métodos de controle menos agressivos ao ecossistema devem ser priorizados. Fungos entomopatogênicos são promissores para o controle biológico de mosquitos transmissores de doenças. Várias espécies de fungos foram virulentas contra o mosquito A. aegypti (LELES et al., 2010). Outros mosquitos também foram suscetíveis ao fungo entomopatogênico, por exemplo, o mosquito Culex quinquefasciatus (SEYE et al. 2012) e Anopheles gambiae (HOWARD et al. 2011). Em condições de laboratório as fêmeas de A. aegypti alimentadas com sacarose foram altamente suscetíveis ao fungo M. anisopliae (PAULA et al., 2008). Entretanto foi observada menor suscetibilidade de fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue ao fungo M. anisopliae (PAULA et al., 2011). Várias superfícies impregnadas com fungo foram desenvolvidas para atrair e promover a infecção de mosquitos. Cortinas de panos pretos impregnadas com fungo foram eficientes para reduzir a sobrevivência do mosquito Anopheles (MNYONE et al. 2012). Panos pretos impregnados com fungo e fixados com fita adesiva em móveis residenciais também foram eficientes para infecção de fêmeas de A. aegypti (PAULA et al., 2013). O desenvolvimento de um suporte para pendurar o pano preto facilitou o emprego desse método de controle biológico. Imad Silva et al., (2017) desenvolveram uma armadilha feita de garrafa PET transparente com pano preto + fungo para infectar fêmeas de A. aegypti. Entretanto este teste com a armadilha PET com fungo foi realizado em condição de laboratório com fêmeas alimentadas com sacarose. No campo fêmeas em diferentes estados nutricionais serão encontradas. O objetivo deste estudo foi avaliar em uma simulação de um cômodo residencial as taxas de sobrevivência dos mosquitos alimentados com sacarose ou sangue expostos, por diferentes períodos, a armadilha PET com pano preto impregnado com M. anisopliae. 1

2 Metodologia Os experimentos foram realizados no insetário do Laboratório de Entomologia e Fitopatologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Os ovos de A. aegypti foram coletados usando armadilhas denomonadas ovitrampas colocadas no campus da UENF (Figura 1A) e a criação e manipulação dos mosquitos A. aegypti (Figura 1B) foram realizados conforme Paula et al. (2013). Os mosquitos foram alimentados com sacarose 10% disposto em pote de vidro de 30mL com um pavio amarelo ou alimentados com sangue de camundongo com aprovação do cômitê de Etica da UENF (Protocolo CEUA 248), seguindo protocolo de Paula et al. (2011). O cultivo do fungo M. anisopliae (isolado ESALQ 818) foi realizado conforme Paula et al. (2013). Conídios do fungo foram suspenso em 0,05% de Tween 80 (TW) até obter a concentração desejada para os experimentos (1x10 8 conídios/ml). Figura1 A) Ovitrampa para coleta de ovos de Aedes. B) Pesquisadora selecionando fêmeas de Aedes aegypti adormecidas com CO2. Fonte: o autor O pano preto (100% algodão) no tamanho de 16 x 7 cm, foi autoclavado, imerso em 200 ml da suspensão do fungo, pendurado em um varal de chão por 16 horas para secagem e em seguida suspenso com auxílio de um arame na armadilha PET feita de garrafa PET de 2 litros transparente com corte lateral de 17 x 8 cm permitindo o acesso dos mosquitos ao pano + fungo. Para os tratamentos controles o pano preto foi banhado em apenas com TW. Dois tratamentos foram realizados simultaneamente em salas simulando cômodos residenciais (Figura 2). Na sala 1 foram colocados três armadilhas PET com pano preto + M. anisopliae. Na sala 2 foi colocado três armadilhas PET com pano preto + TW (controle). As armadilhas PET foram colocadas embaixo de mesas e cadeiras simulando moveis das residências. Cinquenta fêmeas de A. aegypti alimentadas com sacarose ou sangue foram adormecidas por 30 segundos com CO2 (seguindo metodologia de Paula et al., 2013) e liberadas em cada sala. As portas foram lacradas para evitar a fuga dos mosquitos. Fêmeas alimentadas com sacarose ficaram expostas as armadilhas PET com fungo ou controle por 24, 48 e 120 horas. Fêmeas alimentadas com sangue ficaram expostas as armadilhas PET com fungo ou controle 48, 72 e 120 horas. As avaliações de todos os testes foram realizadas no quinto dia pós-montagem dos experimentos. Para avaliação dos mosquitos sobreviventes aos experimentos, uma armadilha BG-Sentinel com atraente BG-Lure (Biogents Ltd., Alemanha) foi colocada em cada sala e após 24h o número de mosquitos capturados foi contabilizado. Mosquitos capturados na BG-Sentinel foram avaliados como mosquitos que não foram mortos pelo fungo. 2

3 Figura 2 - Salas simulando cômodos residenciais. Fonte: o autor Esses experimentos foram realizados três vezes. Médias de sobrevivência foram calculadas para cada experimento. O cálculo do desvio padrão foi feito utilizando programa Microsoft Office Excel. As comparações das médias entre os tratamentos foram feitas utilizando o teste de variância (ANOVA) de uma via e o teste post-hoc de Duncan (P<0,05). Resultados A Tabela 1 mostra que a taxa de sobrevivência de fêmeas alimentadas com sacarose expostas por 24h as armadilhas PET com M. anisopliae foi maior (51,3%) e significativamente diferente comparado com resultados de fêmeas alimentadas com sacarose expostas por 48h e 120h as armadilhas PET com mesmo fungo (33,3% e 28,6%, respectivamente) (F2,8 = 170,5; P<0,01). Tabela 1 Taxa de sobrevivência (± Desvio Padrão) de fêmeas alimentadas com sacarose expostas a 3 armadilhas PET com pano preto + Metarhizium anisopliae por diferentes períodos. Sobrevivência (%) ± Desvio Padrão Tratamentos Metarhizium anisopliae Controle SAC 24h 51.3 ± 1.5 a # 82 ± 1 a * SAC 48h 33.3 ± 2.1 b # 81.3 ± 1,52 a * SAC 120h 28.6 ± 1.5 b # 78 ± 1 a * Letras indicam estatística realizada em colunas. Símbolos indicam estatística realizada em linha. Os valores seguidos de letras ou símbolos diferentes indicam que os resultados foram estatisticamente diferentes quando comparados usando o teste post-hoc de Duncan (5% probabilidade). SAC = fêmeas alimentadas com sacarose. A Tabela 2 mostra que a taxa de sobrevivência de fêmeas alimentadas com sangue expostas por 48h as armadilhas PET com M. anisopliae foi maior (75,3%) e significativamente diferente comparado com resultados de fêmeas alimentadas com sangue expostas por 72h e 120h as armadilhas PET com mesmo fungo (36,6% e 34%, respectivamente) (F2,8 = 103,6; P<0,01). 3

4 Tabela 2 Taxa de sobrevivência (± Desvio Padrão) de fêmeas alimentadas com sangue expostas a 3 armadilhas PET com pano preto + Metarhizium anisopliae por diferentes períodos. Sobrevivência (%) ± Desvio Padrão Tratamentos Metarhizium anisopliae Controle SANG 48h 75.3 ± 1.5 a # 81.3 ± 1.5 a * SANG 72h 36.6 ± 1.2 b # 80 ± 2 a * SANG 120h 34 ± 2 b # 79.3 ± 3 a * Letras indicam estatística realizada em colunas. Símbolos indicam estatística realizada em linha. Os valores seguidos de letras ou símbolos diferentes indicam que os resultados foram estatisticamente diferentes quando comparados usando o teste post-hoc de Duncan (5% probabilidade). SANG = fêmeas alimentadas com sangue. Fêmeas de A. aegypti alimentadas com sacarose ou sangue e expostas as 3 armadilhas PET com M. anisopliae por 48 horas apresentaram taxas de sobrevivência significativamente diferente entre si (33.3 % e 75,3% respectivamente) (F2,8 = 47,37; P<0,01). Discussão Estudos de laboratório observaram que fêmeas de A. aegypti recém alimentadas com sangue foram menos suscetíveis ao M. anisopliae, comparado com testes realizados com fêmeas alimentadas com sacarose. Entretanto a suscetibilidade ao fungo foi restabelecida conforme ocorria a digestão sanguinea no mosquito (PAULA et al., 2011). No atual trabalho, realizado em uma simulação de um cômodo residencial, foi observado que um maior período (72h) de exposição do mosquitos A. aegypti alimentados com sangue foi necessário para resultar em baixa taxa de sobrevivência dos insetos (36,6%). Fêmeas alimentadas com sacarose precisaram apenas de 48h de exposção ao M. anisopliae para apresentarem baixa taxa de sobrevivência (33,3%). A alimentação com sangue poderia diminuir a virulência do fungo devido à capacidade do inseto de ativar uma resposta imune ou alterar os níveis de nutrientes disponíveis para propagação do patógeno (MNYONE et al., 2011). Por exemplo, os triatomíneos Rhodnius prolixus alimentados com sangue mostraram maior resposta imune à infecção por Enterobacter cloacae, em comparação aos R. prolixus alimentados com plasma (FEDER et al., 1997). Os mosquitos An. gambiae depois de alimentados com sangue sofreram mudanças fisiológicas com expressões de genes relacionados à formação da matriz peritrófica, digestão, desenvolvimento do ovo e imunidade (DANNA et al., 2005), fato que poderia talvez alterar sua suscetibilidade a patógenos. O comportamento de fêmeas alimentadas com sangue também deve ser estudado. Fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue pousaram menos em panos pretos, comparados com fêmeas alimentadas com sacarose (PAULA et al., 2013). Talvez porque logo após a alimentação sanguinea as fêmeas ficaram mais pesadas e voaram menos. A associação de atraentes de oviposição em armadilhas com fungo poderia ser eficiente para aumentar as taxas de infecções de fêmeas alimentadas com sangue. Várias superfícies impregnadas com fungo já foram estudadas como fonte de infecção de mosquitos. Um estudo na África mostrou que vasos de barro utilizados para armazenamento de água foram adequados para a aplicação de M. anisopliae e infecção de machos e fêmeas de An. gambiae e Anopheles funestus alimentados com sacarose (FARENHORST et al., 2008). Na Tanzânia foram testados vários métodos intradomiciliares utilizando pano preto + fungo para redução da sobrevivência de Anopheles (MNYONE et al., 2012). Snetselaar et al. (2014) mostraram que uma armadilha com atraente + fungo + inseticida sintético reduziu a taxa de sobrevivência de A. aegypti. Infecções fungicas podem causar efeitos subletais nos mosquitos. Na Austrália o efeito de B. bassiana sobre a sobrevivência, comportamento de alimentação de sangue e fecundidade de A. aegypti foi investigada. Os resultados mostraram uma redução de 80% na alimentação de sangue e significativas reduções na sobrevivência dos mosquitos (DARBRO et al., 2012), fato que poderia futuramente ser investigado nas fêmeas de A. aegypti recém alimentadas com sangue sobreviventes à exposição ao fungo. Os fungos entomopatogênicos são potenciais candidatos para o controle integrado de mosquitos apesar da diferença de tempo para reduzir a sobrevivência dos insetos em diferentes estados nutricioais. 4

5 Conclusão Menor período de exposição de fêmeas de A. aegypti alimentadas com sacarose ao fungo foi necessário para resultar em baixa taxa de sobrevivência destes insetos. Fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue precisaram de maiores períodos de exposição ao fungo para resultar em baixas taxas de sobrevivência. Referências DANNA, A.N.; HONG, Y.S.; KERN, M.K.; HILLENMEYER, M.E.; HARKER, B.W.; LOBO, N.F.; HOGAN, J.R.; ROMANS, P.; COLLINS, F.H. Gene expression patterns associated with blood-feeding in the malaria mosquito Anopheles gambiae. BMC Genomics. V.6, DARBRO, J.M.; JOHNSON, P.H.; THOMAS, M.B.; RITCHIE, S.A.; KAY, B.H.; RYAN, P.A. Effects of Beauveria bassiana on survival, blood-feeding success, and fecun- dity of Aedes aegypti in laboratory and semi-field conditions. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. V. 86, p , FARENHORST, M.; FARINA, D.; SCHOLTE, E.; TAKKEN, W.; HUNT, R.H.; COETZEE, M.; Knols, B.G.J. African water storage pots for the delivery of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae to the Malaria vectors Anopheles gambiae s.s. and Anopheles funestus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. V.78, p , FEDER, D.; MELLO, C.B.; GARCIA, E.S.; AZAMBUJA, P. Immune responses in Rhodnius prolixus: influence of nutrition and ecdysone. Journal of Insect Physiology. V.43, p ,1997. HOWARD, A.F.V.; N GUESSAN, R.; KOENRAADT, C.J.M.; ASIDI, A.; FARENHORST, M.; AKOGBÉTO, M.; KNOLS, B.G.J.; TAKKEN, W. First report of the infection of insecticide-resistant malaria vector mosquitoes with an entomopathogenic fungus under field conditions. Malaria Journal, V.10, p.24, IMAD SILVA, L.E.; PAULA, A.R.; RIBEIRO, A.; BUTT, T.; SILVA, C.; SAMUELS, R.I. A new method of deploying entomopathogenic fungi to control adult Aedes aegypti mosquitoes. Journal Entomology Experimentalis et Applicata. V.142, p.59 66, LELES, R.N.; SOUSA, N.A.; ROCHA, L.F.N.; SANTOS, A.H.; SILVA, H.H.G.; LUZ, C. Pathogenicity of some hypocrealean fungi to adult Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Parasitology Research. V.107, p , LIMA, E.P.; PAIVA, M.H.S.; ARAÚJO, A.P.; SILVA, E.V.G.; SILVA, U.M.; OLIVEIRA, L.N.; SANTANA, A.E.; BARBOSA, C.N.; NETO, C.C.P.; GOULART, M.; WILDING, C.S; AYRES, C.F.J; SANTOS, M.A.V.N. Insecticide resistance in Aedes aegypti populations from Ceará, Brazil. Parasites & Vectors. V.4, n.5, p.2-12, MNYONE, L.L.; LYIMO, I.N.; LWETOIJERA, D.W.; MPINGWA, M.W.; NCHIMBI, N.; HANCOCK, P.A.; RUSSELL, T.L.; KIRBY, M.J.; TAKKEN, W.; KOENRAADT, C.J.M. Exploiting the behaviour of wild malaria vectors to achieve high infection with fungal biocontrol agents. Malaria Journal. V.41, p.11:87, MNYONE, L.L.; KIRBY, M.J.; MPINGWA, M.W.; LWETOIJERA, D.W.; KNOLS, B.G.J.; TAKKEN, W.; KOENRAADT, C.J.M.; RUSSELL, T.L. Infection of Anopheles gambiae mosquitoes with entomopathogenic fungi: effect of host age and blood-feeding. Parasitology Research, V.108, p ,

6 MONTELLA, I.R.; MARTINS, A.J.; VIANA-MEDEIROS, P.F.; LIMA, J.B.; BRAGA, I.A.; VALLE, D. Insecticide resistance mechanisms of Brazilian Aedes aegypti populations from 2001 to American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. V.77, p , PAULA, A.R.; CAROLINO, A.T.; SILVA, C.P.; SAMUELS, R.I. Testing fungus impregnated cloths for the control of adult A. aegypti under natural conditions. Parasites & Vectors. V.6, p , PAULA, A.R.; CAROLINO, A.T.; SILVA, C. P.; SAMUELS, R.I. Susceptibility of adult females Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) to the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is modified following blood feeding. Parasites & Vectors. V.4, n.91, p.2-7, PAULA, A.R.; BRITO, E.; PEREIRA, C.; CARRERA, M.P.; SAMUELS, R.I. Susceptibility of adult Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) to infection by Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana: Prospects for Dengue vector control. Biocontrol Science Tecnology. V.18, p.1-21, SEYE, F.; NDIAYE, M.; FAYE, O.; AFOUTOU, J.M. Evaluation of Entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae Formulated with Suneem (Neem Oil) against Anopheles gambiae s.l. and Culex quinquefasciatus adults. Malaria Chemotherapy, Control & Elimination. V.1, p.1-6, SNETSELAAR, J.; ANDRIESSEN, R.; SUER, R.A.; OSINGA, A.J.; KNOLS, B.G.J.; FARENHORST, M. Development and evaluation of a novel contamination device that targets multiple life-stages of Aedes aegypti. Parasites & Vectors. V.7, p.200,