Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse

Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse Referência K5001 6ª edição Para utilização com os instrumentos de imuno-coloração automatizados Dako. O kit contém reagentes suficientes para 500 testes. (129663-001) P04097PT_01_K500111-2/2015.10 p. 1/8

Índice Página Finalidade... 3 Resumo e explicação... 3 Reagentes... 4 A. Materiais fornecidos... 4 B. Materiais necessários, mas não fornecidos... 4 Precauções... 5 Conservação... 6 Preparação dos reagentes... 6 Colheita e Preparação da Amostra... 6 Procedimento... 6 Controlo de qualidade... 8 Interpretação dos resultados... 8 Explicação dos símbolos... 8 (129663-001) P04097PT_01_K500111-2/2015.10 p. 2/8

Finalidade Para utilização em diagnóstico in vitro. O Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse é indicado para utilização em imuno-histoquímica em conjunto com instrumentos de imuno-coloração automatizados Dako. O kit baseia-se no método de estreptavidina-biotina marcada LSAB (labeled Streptavidin-Biotin) e é utilizado num procedimento em três etapas. A primeira etapa consiste na incubação do tecido com um anticorpo de coelho ou ratinho com uma diluição ideal, a segunda etapa consiste na incubação com Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) e a terceira consiste na incubação com Dako REAL Streptavidin Peroxidase (HRP). A reacção é visualizada através do cromogénio DAB+ Dako REAL que também está incluído no kit. Para assegurar uma coloração adequada, recomenda-se que o kit seja utilizado em conjunto com outros reagentes recomendados listados na secção Materiais necessários, mas não fornecidos. Resumo e explicação O Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse foi concebido para proporcionar a coloração ideal num instrumento de imuno-coloração automatizado Dako, aquando da utilização dos modelos/protocolos aconselhados neste folheto informativo. Antes da coloração, algumas secções de tecido fixadas rotineiramente e impregnadas em parafina deverão ser submetidas a uma recuperação do epítopo induzida por calor (HIER) utilizando a solução Target Retrieval Solution especificada no folheto informativo para o anticorpo primário. Alguns anticorpos primários requerem um pré-tratamento enzimático do tecido em vez da HIER para se obter a coloração ideal. De salientar que o Dako REAL Proteinase K, referência S2019, é concebido para ser utilizado em combinação com HIER para facilitar o processamento de lotes de lâminas. A actividade da peroxidase endógena deverá ser bloqueada com Dako REAL Peroxidase- Blocking Solution, referência S2023 ou Dako Dual Endogenous Enzyme Block, referência S2003. Devido a um procedimento de lavagem eficaz e à presença de proteínas estabilizadoras nos reagentes Dako, não são necessárias etapas de bloqueio extra para reduzir a coloração de fundo não específica. Recomenda-se a utilização de Tampão de lavagem Dako específico para os instrumentos Dako. Os anticorpos primários não são fornecidos com o kit. Recomendamos a utilização de Dako N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies ou de Anticorpos primários concentrados Dako. O Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse baseia-se num método indirecto da estreptavidina-biotina, que tem demonstrado oferecer uma sensibilidade acrescida comparativamente a métodos análogos. O reagente de anticorpo secundário biotinilado do kit reage igualmente bem com imunoglobulinas de coelho e ratinho, sendo, por isso, apenas necessário um reagente secundário para os anticorpos primários de coelho ou ratinho. O reagente de anticorpo secundário foi devidamente marcado com biotina utilizando um braço espaçador de 7 átomos. Isto permite a cada molécula de anticorpo biotinilado reagir com várias moléculas de estreptavidina com conjugado de peroxidase, aumentando, deste modo, a sensibilidade do sistema de detecção. A estreptavidina com conjugado de peroxidase do kit é preparada a partir de estreptavidina isolada de Streptomyces avidinii e peroxidase de rábano (horseradish peroxidase) altamente purificada. A conjugação é realizada através de um método de glutaraldeído purificado de duas etapas. Devido ao facto do ponto isoeléctrico da estreptavidina se situar próximo do neutro, evitam-se interacções iónicas não específicas com os componentes da amostra. O reagente de anticorpo secundário biotinilado, bem como a estreptavidina com conjugado de peroxidase são fornecidos prontos para utilizar em frascos conta-gotas e têm de ser vertidos para dentro dos recipientes adequados do instrumento antes da utilização. O sistema de substrato consiste em dois componentes, DAB+ Chromogen, uma solução de diaminobenzidina (DAB) concentrada e tampão HRP Substrate Buffer contendo peróxido de hidrogénio. Antes da utilização, a solução DAB+ Chromogen tem ser diluída em tampão HRP Substrate Buffer. O sistema de substrato produz um produto final castanho vivo no local do antigénio alvo. (129663-001) P04097PT_01_K500111-2/2015.10 p. 3/8

O Dako REAL Hematoxylin, referência S2020 ou Hematoxylin for the Dako Autostainer, referência S3301, são recomendados para contrastação, uma vez que produzem uma coloração nuclear azul clara. As secções de tecido coradas poderão ser montadas com um meio de montagem aquosa ou à base de solvente orgânico. Reagentes A. Materiais fornecidos Frasco A Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) 100 ml, pronto para utilizar Imunoglobulinas de caprino anti-ratinho e anti-coelho biotinilado. Em solução tamponada contendo proteína estabilizadora e azida de sódio. A cor deste reagente poderá variar de amarelo forte a incolor sem ter qualquer influência no desempenho do kit. Frasco B Frasco C Frasco D Dako REAL Streptavidin Peroxidase (HRP) 100 ml, pronto para utilizar Estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (horseradish peroxidase). Em solução tamponada contendo proteína estabilizadora e conservante. Dako REAL DAB+ Chromogen 5 ml, 50x concentrado 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloreto em solvente orgânico. A cor deste reagente poderá variar de violeta forte a incolor sem ter qualquer influência no desempenho do kit. Dako REAL HRP Substrate Buffer 250 ml, pronto para utilizar Solução tamponada contendo peróxido de hidrogénio e conservante. B. Materiais necessários, mas não fornecidos Instrumentos de imuno-coloração automatizados Dako Tampão de lavagem Dako específico para o instrumento individual Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution, referência S2023 ou Dual Endogenous Enzyme Block, referência S2003 Dako REAL Proteinase K, referência S2019, diluído em Dako REAL Proteinase K Diluent, referência S2032 ou Proteinase K (Ready-to-Use), referência S3020 (se necessário) Dako N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies ou anticorpos primários concentrados alternativos de coelho ou ratinho da Dako N-Series Ready-to-Use Rabbit or Mouse Universal Negative Control ou reagente de controlo negativo adequado para o anticorpo primário Dako REAL Antibody Diluent, referência S2022 (para diluição de anticorpos concentrados) (129663-001) P04097PT_01_K500111-2/2015.10 p. 4/8

Dako REAL Hematoxylin, referência S2020 ou Hematoxylin for the Dako Autostainer, referência S3301 Target Retrieval Solution. Consultar o folheto informativo do anticorpo primário Dako REAL Incubation Container, referência S2030 (opcional) Dako REAL Slide Holder, referência S2029 (opcional) Utensílios dos instrumentos Dako Lâminas de microscópio Reagentes laboratoriais gerais para remoção de cera das secções de tecido impregnadas em parafina. Meio de montagem (base aquosa ou de solvente orgânico) e lamelas Precauções 1. Para utilizadores profissionais. 2. O Frasco A, Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), contém material de origem mamífera. Tal como acontece com qualquer produto de origem biológica, deverão utilizar-se procedimentos de manuseamento adequados. 3. O Frasco A, Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), contém azida de sódio (NaN 3 ), um produto químico altamente tóxico na forma pura. Em situações de concentração do produto, embora não sendo classificada como perigosa, a azida de sódio pode reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando acumulações de azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar o produto, adicionar água abundante para evitar a acumulação de azidas metálicas na canalização. 4. Não expor o Frasco C, Dako REAL DAB+ Chromogen ou a Solução de trabalho de substrato (CHROM) a luz intensa. 5. O Frasco C, Dako REAL DAB+ Chromogen, contém 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'- tetrayltetraammonium tetrahidrocloreto e está rotulado como: H350 H341 P201 P280 Danger P308 + P313 P405 P501 Pode provocar cancro. Suspeito de provocar anomalias genéticas. Pedir instruções específicas antes da utilização. Usar luvas de protecção. Usar protecção ocular ou facial. Usar vestuário de protecção. EM CASO DE exposição ou suspeita de exposição: Consulte um médico. Armazenar em local fechado à chave. Descartar o conteúdo e os recipientes de acordo com todas as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. Como regra, as pessoas com idade inferior a 18 anos não estão autorizadas a trabalhar com este produto. Os utilizadores devem ser cuidadosamente instruídos sobre o procedimento de trabalho adequado, as propriedades perigosas do produto e as instruções de segurança necessárias. Consultar a Ficha de Segurança (FDS) para obter informações adicionais. 6. Usar equipamento de protecção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 7. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações locais e nacionais. (129663-001) P04097PT_01_K500111-2/2015.10 p. 5/8

Conservação Conservar o kit entre 2 8 C. Não utilizar após o fim do prazo de validade impresso no kit. Não trocar componentes do kit de lotes diferentes. Se os reagentes forem conservados em condições diferentes das especificadas, o utilizador deverá verificar essas mesmas condições. A Solução de trabalho de substrato preparada (CHROM) deverá ser conservada a 2 8 C e utilizada no espaço de 5 dias. Caso se observe uma coloração inesperada que não possa ser explicada pela variação nos procedimentos laboratoriais e se suspeite da existência de um problema com o produto, contactar o nosso serviço técnico. Preparação dos reagentes Solução de trabalho de substrato (CHROM) A Solução de trabalho de substrato contendo DAB (CHROM) é preparada misturando minuciosamente 20 µl de DAB+ Chromogen (Frasco C) e 1 ml de HRP Substrate Buffer (Frasco D). Preparar apenas o volume necessário para o número de lâminas que irão ser coloridas. Utilizar a solução CHROM no espaço de 5 dias (conservar num local escuro, a uma temperatura entre 2 8 C). Para mais informações relativas à preparação dos reagentes não fornecidos no kit, consultar as instruções incluídas com o reagente individual. Colheita e Preparação da Amostra As amostras podem consistir em secções de tecido rotineiramente fixadas e impregnadas em parafina e secções de tecido congelado. Para a conservação das amostras podem ser utilizados vários agentes de fixação. As amostras não deverão ser fixadas em formol neutro tamponado durante mais do que 24 horas, sendo preferível um período mais curto. A espessura ideal das secções impregnadas em parafina é de, aproximadamente, 4 µm. A espessura ideal das secções congeladas é de 4 6 µm. As amostras devem ser montadas em lâminas de microscópio. As secções devem ser montadas nas lâminas o mais planas e lisas possível. Secções de tecido demasiado enrugadas poderão afectar os resultados da coloração. NOTA: As lâminas de microscópio têm que ter uma largura adequada para o instrumento Dako. Consultar o Manual do Operador do instrumento Dako individual para mais informações sobre a definição de lâminas de microscópio utilizáveis. As secções de parafina devem ser montadas a partir de um banho de água pré-aquecido com água destilada ou desionizada. O banho de água não deve conter aditivos (como, por exemplo, gelatina, poli-l-lisina, etc.). As secções devem ser secas por aquecimento, normalmente a uma temperatura não superior a 60 C durante, no mínimo, 60 minutos (durante a noite, por exemplo). Para garantir uma aderência adequada das secções às lâminas, é importante drenar a água que se encontra por baixo das secções antes do processo de secagem no forno. Procedimento Os instrumentos de imuno-coloração automatizados Dako utilizam técnicas baseadas em diferentes princípios para se obter um resultado de coloração ideal. Antes de se processar os protocolos nos instrumentos de imuno-coloração automatizados Dako, ler atentamente o Manual do Operador para o respectivo instrumento Dako. Após a desparafinização e hidratação em tampão (água), a maioria das secções de tecido deverão ser submetidas a HIER. Recomenda-se a normalização da HIER, para confirmar a recuperação do epítopo reprodutível. Para normalizar o tratamento, recomenda-se o carregamento do porta-lâminas completo com lâminas, mesmo que uma lâmina possa conter tecido; este procedimento garante um aquecimento idêntico das secções em todos os processos. No final da etapa de recuperação do (129663-001) P04097PT_01_K500111-2/2015.10 p. 6/8

epítopo, as lâminas devem ser mantidas no tampão durante, pelo menos, 20 minutos à temperatura ambiente. Durante este arrefecimento, os instrumentos de imuno-coloração automatizados Dako podem ser preparados para o processo de coloração. Alguns epítopos não toleram a HIER. Consultar as instruções de pré-tratamento no folheto informativo do anticorpo primário Dako individual. Incubação com o anticorpo primário Os anticorpos Dako N-series, Ready-to-Use Primary Antibodies podem ser utilizados com o Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, sendo aplicados em secções fixadas em formol e impregnadas em parafina. No folheto informativo do anticorpo primário concentrado é fornecida uma linha de orientação sobre a diluição para anticorpos primários concentrados Dako e a utilização do pré-tratamento com proteinase K com respeito à aplicação de Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse em secções fixadas em formol e impregnadas em parafina. Os anticorpos primários concentrados devem ser diluídos em Dako REAL Antibody Diluent, referência S2022. As lâminas são carregadas num instrumento Dako e coradas utilizando o respectivo modelo/protocolo para Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, referência K5001. Se o modelo/protocolo não estiver presente no instrumento Dako, contactar o nosso Serviço Técnico. Antes de utilizar o Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, no dispositivo de coloração automático Dako pela primeira vez, é necessário adicionar os reagentes e tempos listados na tabela 1 à lista de reagentes do instrumento. Tabela 1. Adições necessárias à lista de reagentes e tempos de incubação ideais Reagente Referência Sugestão para nome resumido Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution ou Dual Endogenous Enzyme Block Dako REAL Proteinase K Solution ou Dako Proteinase K S2023 ou S2003 S2019 + S2032 S2030 HP Block Pro K Etapa do modelo End. Enz. Block (Bloq. enz. end.) Pre-treatment under antibody (pré-tratamento sob o anticorpo) Anticorpos primários Individual - Antibody (Anticorpo) Dako REAL Detection System Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) Dako REAL Detection System, Streptavidin Peroxidase (HRP) K5001 K5001LIN Secondary Reagent (Reagente secundário) K5001 K5001HRP Tertiary Reagent (Reagente terciário) Dako REAL Detection System (DAB+) K5001 K5001DAB Substrate (Substrato) Dako REAL Hematoxylin ou Dako Hematoxylin for the Dako Autostainer Blueing Buffer (= Tampão do dispositivo de coloração automático) Tempo de incubação 5 minutos 10 minutos 10* 25 minutos 15 minutos 15 minutos 3 minutos (2 vezes) S2020 Auxiliary (Auxiliar) 1 2 minutos - S3301 1 5 minutos S3006 - Auxiliary (Auxiliar) 5 minutos * N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies Para os demais instrumentos Dako, os nomes de reagentes e os tempos de incubação são préprogramados nos modelos/protocolos. (129663-001) P04097PT_01_K500111-2/2015.10 p. 7/8

Controlo de qualidade Cada processo de coloração deverá incluir uma amostra de controlo positivo conhecida para confirmar um desempenho adequado de todos os reagentes aplicados. Caso a amostra de controlo positivo não demonstre uma coloração positiva apropriada, devem considerar-se inválidas as marcações das amostras de teste. Deve ser utilizado um reagente de controlo negativo com cada amostra para identificar qualquer coloração não específica. Caso a coloração não específica não possa ser claramente diferenciada da coloração específica, a marcação da amostra de teste deverá ser considerada inválida. Recomenda-se a utilização de Negative Control for N-Series Rabbit Primary Antibodies, referência N1699 ou Negative Control for N-Series Mouse Primary Antibodies, referência N1698, como reagente de controlo negativo. Interpretação dos resultados A Solução de trabalho de substrato contendo diaminobenzidina (CHROM) produz uma cor castanha no local do antigénio alvo reconhecido pelo anticorpo primário. A cor castanha deverá estar presente na amostra de controlo positivo na localização esperada do antigénio alvo. Em caso de presença de coloração não específica, tal será reconhecido através de uma coloração castanha algo difusa nas lâminas tratadas com o reagente de controlo negativo. Os núcleos serão coloridos de azul pelo contrastante de hematoxilina. Explicação dos símbolos Número de catálogo Limites da temperatura Utilizar até Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Conteúdo suficiente para <n> testes Fabricante Consultar as instruções de utilização Código do lote Símbolo GHS (consultar a secção relativa às precauções) Produzido por: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dinamarca Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 (129663-001) P04097PT_01_K500111-2/2015.10 p. 8/8