UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM ODONTOLOGIA

UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM ODONTOLOGIA Efeito fotossensibilizador in vitro da curcumina na terapia fotodinâmica sobre candida albicans KADMO AZEVEDO DE FIGUEIREDO Orientador: Prof. Dr. Cacio Moura Netto Co-Orientadora: Profa. Dra. Germana Louanne Carvalho Leitão Dissertação apresentada ao Mestrado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Odontologia. SÃO PAULO 2015

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL F49e Figueiredo, Kadmo Azevedo de. Efeito fotossensibilizador in vitro da curcumina na terapia fotodinâmica sobre candida albicans / Kadmo Azevedo de Figueiredo. -- São Paulo; SP: [s.n], 2015. 52 p. : il. ; 30 cm. Orientador: Cacio Moura Netto. Dissertação (mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul. 1. Terapia fotodinâmica - Odontologia 2. Candida albicans 3. Doença da boca Tratamento 4. Curcumina. I. Moura Netto, Cacio. II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título. CDU: 615.831:616.314(043.3)

UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO Efeito fotossensibilizador in vitro da curcumina na terapia fotodinâmica sobre candida albicans KADMO AZEVEDO DE FIGUEIREDO Dissertação de mestrado defendida e aprovada pela Banca Examinadora em 28/08/2015. BANCA EXAMINADORA: Prof. Dr. Cacio Moura Netto Universidade Cruzeiro do Sul Presidente Prof. Dr. Fábio Bastos Valverde Universidade Cruzeiro do Sul Profa. Dra. Elaine Faga Iglecias Universidade Paulista

Dedico este trabalho a minha mãe Glória, sinônimo de amor, sabedoria, paciência e paz.

AGRADECIMENTOS Agradeço inicialmente a Deus, fonte de vida e luz. A minha avó Dalva, sempre companheira e presente. Agradeço a minha família pelo apoio incondicional, em especial aos meus irmãos Karinny, Katianny, Kellyton, Josafá, Thaís e a irmã torta, Conceição (Novinha), que nunca deixou a peteca cair. Agradeço a todos meus amigos pelo apoio, em especial a Vanessa, pela grande ajuda na coleta dos dados. Ao meu orientador, Prof. Dr. Cacio Moura-Netto, pelo empenho a distância, que torna o trabalho mais difícil, e só pôde se realizado com sua ajuda. À minha co-orientadora Dra Germana Louanne Carvalho Leitão que foi meus olhos e minhas mãos nessa pesquisa. Sempre presente e disposta a ajudar. A todos que compõem o Laboratório de Microbiologia das FIP, em especial Patrícia e Alexandre que tão prontamente me receberam e ajudaram de todas as formas possíveis. A toda equipe da UNICSUL, desde mestres aos funcionários pela ajuda. Aos colegas do Mestrado, que já deixaram muita saudade. Muito Obrigado!

Você tem que me prometer que essa viagem não vai ser à toa, que vale a pena. Que por você vale a pena. Que por nós vale a pena. Remar. Re-amar. Amar. (Caio Fernando Abreu)

Figueiredo KA. Efeito fotossensibilizador in vitro da curcumina na terapia fotodinâmica sobre candida albicans [dissertação]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2015. RESUMO O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da terapia fotodinâmica utilizando a curcumina como substância fotossensibilizadora associado a um LED de luz azul na inativação de células planctônicas de Candida albicans, variando a concentração e doses de luz. Foi usado o LED na ativação da curcumina que emite luz no espectro azul, com comprimento de onda predominante 455nm. Suspenções celulares padronizadas dos microrganismos foram preparadas a partir de uma cepa de Cândida albicans e transferidas para placa de 96 orifícios. As amostras foram divididas em 4 grupos: Grupo 1 (controle sem tratamento) as suspenções celulares não sofreram irradiação da luz nem exposição a curcumina; Grupo 2 as suspenções celulares não foram expostas a curcumina, mas as células foram irradiadas com LED separadamente durante 1 e 2 minutos, resultando em doses de luz de 36 e 72J/cm 2, respectivamente; Grupo 3 as células não foram irradiadas, mas houve exposição do fungo às soluções de curcumina nas concentrações de 15μg/ml e 30μg/ml; Grupo 4 (grupo terapia fotodinâmica) houve irradiação do LED nos tempos de 1 e 2 minutos e exposição da curcumina nas concentrações de 15μg/ml e 30μg/ml. Todos os grupos passaram por um tempo de pré-irradiação de 3 minutos. Após cada uma destas etapas, as suspenções celulares foram diluídas e plaqueadas em triplicatas em Sabouraud Dextrose Agar (SDA). Os dados foram coletados e digitados na planilha Excel e os cálculos obtidos através do programa estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences), na versão 21.0. Utilizou-se intervalo de confiança de 95% (p < 0,05). Os resultados foram expressos através das medidas estatísticas descritivas com os valores: média, desvio padrão e mediana. Para comparação entre os grupos e entre as diluições foi utilizado o teste estatístico kruskal-wallis, e no caso de diferença significativa foram utilizadas comparações múltiplas do referido teste. Os resultados obtidos demonstraram que TFD com um LED azul, associado a curcumina, nos parâmetros utilizados, possui eficiência fotodinâmica na inativação total do microrganismo analisado. Os resultados desse estudo podem fornecer dados para a preparação de novos protocolos para o tratamento de infecções relacionadas com a Candida albicans.

Palavras-chave: Candida albicans, Curcumina, Terapia fotodinâmica.

Figueiredo KA. Photosensitizer effect in vitro of curcumin in the photodynamic therapy on candida albican [dissertação]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2015. ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of photodynamic therapy (PDT) using curcumin as a photosensitizing substance associated with a blue light LED on inactivation of Candida albicans planktonic cells by varying concentrations and light doses. A LED was used in the activation of curcumin that emits light in the blue spectrum with predominant wavelength of 455nm. Standardized cell suspensions of the microorganisms were prepared from a strain of Candida albicans and were transfered for 96 well plates. The samples were divided into 4 groups: Group 1 (control with no treatment) cell suspensions did not undergo light irradiation or exposure to curcumin; Group 2 cell suspensions were not exposed to curcumin, but the cells were irradiated with LED 1 and 2 minutes, resulting in light doses of 36 and 72 J/cm 2, respectively; Group 3 cells were not irradiated but there was exposition of the fungus to solutions of curcumin at concentrations of 15 μg/ml and 30 μg/ml; Group 4 (photodynamic therapy group) there was irradiation of the LED in the times of 1 and 2 minutes and exposure of curcumin at concentrations of 15 μg/ml and 30 μg/ml. All groups underwent a pre-irradiation time of 3 minutes. After each step, the cell suspensions were diluted and plated in triplicate in Sabouraud Dextrose Agar (SDA). Data were collected and typed in an Excel spreadsheet and calculations obtained through the SPSS (Statistical Package for Social Sciences), version 21.0. Confidence interval of 95% was used (p < 0.05). The results were expressed through the descriptive statistics with the values of mean, standard deviation and median. For comparison between groups and between dilutions the Kruskal-Wallis statistical test was used and in case of significant difference multiple comparisons were used. The results showed that PDT with a blue LED combined with curcumin, on the used parameters, has photodynamic efficiency in the total inactivation of the analyzed microorganism. The results of this study can provide data to the preparation of new protocols for the treatment of infections related to Candida albicans. Keywords: Candida albicans, Curcumin, Antimicrobial photodynamic therapy.

LISTA DE FIGURAS Figura 1 O mecanismo de ação da terapia fotodinâmica... 19 Figura 2 Câmara de fluxo laminar, onde foram realizados os experimentos... 25 Figura 3 Formulário usado para registro da leitura das placas...26 Figura 4 Cepa de Cândida Albicans usada da pesquisa... 27 Figura 5 LED modelo LEC PRIME da MMOPTICS LTDA... 28 Figura 6 Curcumina em pó e as duas diluições... 28 Figura 7 Espectrofotômetro Calibrado...... 29 Figura 8 Esquema do preparo da solução Salina...... 30 Figura 9 Esquema do preparo do grupo LED... 31 Figura 10 Esquema do preparo do grupo CUR...... 32 Figura 11 Esquema do preparo do grupo TED... 33 Figura 12 Contagem das colônias com auxílio de um contador de colônias...... 35 Figura 13 Média do logaritmo do número de colônias e diluição... 36

LISTA DE TABELAS Tabela 1 Resumo esquemático dos grupos estudados... 34 Tabela 2 Estatísticas do logaritmo do número de colônias +1 segundo o grupo e diluição... 37 Tabela 3 Estatística do logaritmo do número de colônias +1 segundo os grupos controle independente da diluição... 38 Tabela 4 Estatística do logaritmo do número de colônias de +1 segundo os grupos experimentais... 39 Tabela 5 Estatística do logaritmo do número de colônias de +1 segundo os grupos (combinação do corante e da luz), independente da diluição... 40 Tabela 6 Estatísticas do logaritmo do número de colônias +1 segundo grupo... 40

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AIDS CUR DSMO FS HILT LED LILT O2 Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Curcumina Dimetil sulfóxido Fostossensibilizador High Intensity Laser Tratament Diodo Emissor de Luz Low Intensity Laser therapy Oxigênio 1 O2 Oxigênio Singleto TFD Ph SPSS TPI Terapia Fotodinâmica Potencial Hidrogeniônico Statistical Package for the Social Sciences Tempo de pré-irradiação

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 15 2 REVISÃO DA LITERATURA... 18 3 OBJETIVOS... 24 3.1 Geral... 24 3.2 Específicos... 24 4 MATERIAIS E MÉTODOS... 25 4.1 Caracterização da pesquisa... 25 4.2 Terreno da pesquisa... 25 4.3 Instrumento de coleta de dados... 26 4.4 Procedimentos metodológicos... 26 4.4.1 Delineamento da pesquisa... 26 4.4.2 Instrumentos... 26 4.4.3 Preparo do inóculo de cândida alcans... 28 4.4.4 Preparo das soluções de curcumina... 29 4.4.5 Condições experimentais avaliadas... 29 4.4.6 Contagem das unidades formadoras de colônia... 34 4.5 Tratamento dos dados... 35 5 RESULTADOS... 37 5.1 Comparativos entre os grupos controle por diluição e entre diluições por grupo... 37 5.2 Comparativos entre os grupos controle independente da diluição... 38 5.3 Comparativos entre os grupos experimentais (terapia fotodinâmica) por diluição e entre as diluições por grupo... 38 5.4 Comparativos entre os grupos experimentais (grupo de terapia fotodinâmica) independente da diluição... 39

5.5 Comparativos entre os grupos experimentais (grupo de terapia fotodinâmica) e os grupos controle... 40 6 DISCUSSÃO... 43 7 CONCLUSÃO... 48 REFERÊNCIAS... 49

15 1 - INTRODUÇÃO A Candida albicans (CA) é considerada mais prevalente nos indivíduos saudáveis, e também portadores de candidose. (AKPAN; MORGAN, 2002). As espécies do gênero Cândida vivem normalmente nos indivíduos saudáveis sobre a relação de comensalismo, entretanto esses microrganismos podem atuar como patógenos oportunistas, desencadeando processos infecciosos (PFALLER et al., 2009) A terapia fotodinâmica (TFD) foi desenvolvida para combater lesões cancerosas, porém tem sido utilizada com sucesso para o tratamento de infecções fúngicas, sendo empregada com êxito contra CA e outras espécies de cândida (LYON et al., 2011), esses fungos comumente causam infecções das mucosas e da pele em pacientes com imunidade comprometida (MITRA, 2011). Devido a crescente resistência às drogas antifúngicas disponíveis comercialmente, pesquisas são realizadas no intuito de se obter alternativas de tratamento (LI, 2013). Por isso, muitos autores estão realizando continuamente estudos na área de TFD, as quais têm mostrado efeito bactericida e fungicida em microrganismos orais (MAVER-BISCANIN, 2004). Atualmente, a TFD pode ser considerada uma modalidade de tratamento que, embora não substitua as terapias convencionais, funcionam como auxiliar. Essa terapia necessita da presença de uma substância fotoativa, chamada de fotossensibilizador (FS), e uma fonte de luz emitida num espectro próximo ao do pico da absorção do FS utilizado (ALEXIADES-ARMENAKAS, 2006) Este, por sua vez, absorve energia dos fótons de luz e, na presença de oxigênio, da origem a espécies reativas de oxigênio (EROs) (SOUSA, 2007), como o oxigênio singleto e radicais livres que, por reações oxidavas, promovem a morte celular. Em geral, os FSs atuam, inicialmente, sobre a membrana celular e, após o aumento da permeabilidade celular, o FS penetra na célula e age sobre outras organelas intracelulares (LAMBRECHTS; AALDERS; VAN MARLE, 2005). Portanto, diferentemente dos antifungicos convencionais, cujo mecanismo de ação limitasse a um único alvo (JABRA-RIZK; FALKLER; MEILLER, 2004) a TFD atua sobre diversos

16 alvos, tornando improvável o surgimento de resistência (DONNELLY; MCCARRON; TUNNEY, 2008). Fotossensibilizadores seguros e efetivos tem sido alvos de estudos de muitos pesquisadores para a fotoinativação de micro-organismos. A curcumina é um pigmento natural, de coloração amarelada, extraído dos rizomas da planta Curcuma longa L.,(EPTEIN; SAMDERSON; MACDONALD, 2010) Nos últimos anos, um número crescente de estudos tem confirmado o potencial terapêutico da curcumina, como seu efeito anti-inflamatório, antioxidante, antibacteriano, antifúngico e antitumoral (EPTEIN; SAMDERSON; MACDONALD, 2010; RAJASEKARAN, 2011). Autores têm sugerido que alguns desses efeitos poderiam ser acentuados com a exposição da curcumina a uma fonte de luz (PRIYADARSINI, 2009). A alta capacidade de absorção de luz em comprimentos de onda próximo ao azul faz com que a curcumina seja um potencial FS para tratamento de lesões superficiais. Investigações novas sugerem que ela possa apresentar efeito antifúngico sobre espécies de Cândida (GARCIA-GOMES et al., 2012) Estudos têm relatado a utilização de variadas fontes emissoras de luz, dentre elas encontram-se os lasers as luzes halogenas (BRUZELL; MORISBAK; TONNESEN, 2005; LAMBRECHTS; AALDERS; VAN MARLE, 2005) e os LEDs (Luz emitida por Diodo) (DOVIGO et al., 2011; DOVIGO et al., 2011). O LED é uma categoria de luz que emite irradiação numa faixa mais ampla do espectro, porém com um comprimento de onda predominante. Além disso, apresenta uma emissão de luz espontânea, não coerente e com certo espalhamento, o que permite a iluminação de uma maior área, facilitando o tratamento de lesões superficiais. Os LEDs já foram aplicados com sucesso em diversos estudos de TFD antimicrobiana (DOVIGO et al., 2011; DOVIGO et al., 2011) e apresentam vantagens, como o menor custo do aparelho e tecnologia mais simples, quando comparados aos aparelhos de laser (DOUGLAS, 2003; KONOPKA; GOSLINSKI, 2007) O sucesso da TFD depende de diversos fatores, dentre eles, da espécie (PEREIRA, et al., 2011), do FS usado e sua concentração (BRUZELL; MORISBAK; TONNESEN, 2005; BUYTAERT; DEWAELE; AGOSTINIS, 2007) do tempo de iluminação (LAMBRECHTS; AALDERS; VAN MARLE, 2005) e do tempo de préirradiação (TPI) (BUYTAERT; DEWAELE; AGOSTINIS, 2007), que é o tempo em

17 que a substância permanece em contato com os micro-organismos previamente à iluminação. Durante esse período, o FS deverá ligar-se a membrana celular ou penetrar nas células microbianas, para que, no ato da iluminação, essa substância seja capaz de exercer a sua função na indução da morte celular (LAMBRECHTS; AALDERS; VAN MARLE, 2005). Sendo assim, faz-se interessante avaliar os parâmetros necessários para determinar a eficácia da TFD mediada pela CUR, como a concentração e o tempo de irradiação, para dessa forma, garantir a sua aplicabilidade clínica na eliminação de infecções superficiais por Cândida albicans.

18 2 - REVISÃO DE LITERATURA A terapia fotodinâmica (TFD) tem sido utilizada como alternativa para inativação de microrganismos patogênicos em que uma combinação de um fotossensibilizador e uma fonte de luz visível, na presença de oxigênio, é utilizada nesse processo (HILF, 2007; MAISCH, 2009; LYON et al., 2011; BRESKEY et al., 2013). Estudos com essa terapia estão em desenvolvimento para várias aplicações na área da oncologia, dermatologia e oftalmologia. Já na odontologia, a cavidade oral é indicada para a TFD, já que é fácil o acesso para a iluminação (PERNI, 2011). O efeito antimicrobiano potente e de amplo espectro destacou esta terapia como um tratamento alternativo promissor para infecções localizadas (KATO, 2013). Muitos relatos na literatura confirmaram inativação eficiente de várias espécies de bactérias e leveduras após a luz e FS entregue para as células. (KATO, 2013; LI, 2013; LYON, et al., 2011; PERNI, 2011) FSs têm sido usados na TFD por absorverem luz com elevada eficiência, sendo capazes de induzir ou participar de reações fotoquímicas. Como a maioria das espécies microbianas não tem componentes fotossensíveis endógenos é importante o uso de um fotossensibilizador capaz de atrair luz e iniciar a formação de radicais livres (WILSON, 1993). As drogas fotossensibilizadores atuam com um agente de absorção óptica ou cromóforo, que produz fluorescência após a irradiação, causando citotoxidade no meio (PUPO, 2011) Após a luz ativar o FS, poderá seguir dois caminhos para gerar Espécies Reativas de Oxigênio (EROs): O tipo I envolve a interação direta do FS com o meio para gerar radicais ou íons de radicais como radicais hidroxila (OH) e ânions super óxidos (O 2 ); O tipo II comumente ocorre a geração de oxigênio singleto pela excitação do FS por transferência de energia direta do estado tripleto do FS para a molécula do oxigênio. As EROS geradas reage rapidamente com o seu ambiente dependendo da localização da ativação do FS (MAISCH, 2009).

19 Figura 01: O mecanismo de ação da terapia fotodinâmica. Números em sobrescritos denotam o número de elétrons desemparelhados em cada molécula. Adaptado de Konan et al. (2002) Em qualquer caso (Tipo I/Tipo II), o tempo de vida das espécies reativas é relativamente baixa, o que implica que a ação do dano está focada no tecido alvo, sem afetar os tecidos vizinhos, de forma significativa (LYON, 2011). O oxigênio singleto gerado pela excitação de fotossensibilizadores é um agente de oxidação não-específica. Consequentemente, não há nenhuma defesa celular contra ela. De fato, enzimas antioxidantes, como a superóxido-dismutase e catalase, são inativadas por ela. Isso significa que não deve haver nenhuma diferença na suscetibilidade à TFD entre organismos resistentes a antifúngicos convencionais e os seus homólogos. A alta reatividade do oxigênio singleto tem outras vantagens, porque apesar da localização do fotossensibilizador poder ser determinada pelas suas propriedades físico-químicas, a difusão de oxigênio singleto deve ser suficiente para ser capaz de inativar outras estruturas e biomoléculas. Portanto, é pouco provável que os fungos possam desenvolver resistência ao oxigênio singleto. Além disso, os processos de TFD nunca foram associados com efeitos mutagênicos nos microrganismos, e o oxigênio singleto só está presente durante a iluminação, onde os fungos não são continuamente expostos a ela, como eles são com antifúngicos convencionais. O oxigênio singleto não pode viajar para outras partes do corpo, tais como o trato intestinal, durante a terapia. Estes últimos fatos tornam o desenvolvimento de resistência ainda mais improvável (DONNELLY, et al., 2008).

20 Dois pontos devem ser considerados quando a eficácia do procedimento fotodinâmica é avaliada: (i) a concentração do fotossensibilizador no tecido alvo, (ii) a intensidade de fótons incidentes no tecido alvo (LYON, 2011). Uma concentração demasiadamente elevada de FS irá dificultar esse corante de se ligar a célula microbiana que se dejesa, e a luz será absorvida, inutilmente, por moléculas de corantes não ligados a qualquer célula microbiana. (DAI, 2011) Os passos básicos de TFD incluem: (1) a administração de um FS (um produto químico capaz de induzir uma reação fotodinâmica que transfere energia para o tecido); (2) o tempo de espera suficiente para a absorção de local ou sistêmica do fármaco tempo de pre-irradiação - TIP, e (3), em seguida, irradiar com uma luz a área de tratamento no paciente para desencadear a reação fototóxica (BRESKEY et al., 2013). Quando comparada à outras terapias, a TFD tem várias vantagens, tais como elevada especificidade alvo (PS pode ser entregue às células e a luz pode ser centrada no local da lesão), poucos efeitos colaterais indesejáveis e pouca probabilidade de levar ao desenvolvimento de resistência por microrganismos, este tipo de tratamento não está associado com efeitos genotóxicos ou mutagênicos para fungos (DONNELLY et al., 2008). Os estudos demonstram a TFD com azul de metileno (AM) aumentando a permeabilidade da membrana de CA, podendo diminuir a resistência desta levedura a tratamentos adicionais com outras drogas. Esses corantes são conhecidos por se localizarem na membrana plasmática de leveduras, logo este é a estrutura danificada após a iluminação e foi proposta que o aumento da permeabilidade, resultante de tal dano, é a razão para a morte celular (GIROLDO et al., 2009). Para outros autores, esse FS é um inibidor da respiração (MORALES, 2013). A incidência de infecções fúngicas superficiais e profundas tem aumentado significativamente ao longo dos últimos 20 anos. Várias razões têm sido proposta para o aumento da incidência de infecções fúngicas, incluindo o aumento do uso de medicamentos antineoplásicos e imunossupressores, antibióticos de amplo espectro, próteses, enxertos e cirurgias mais agressivas (DONNELLY et al., 2008), até porque com o desenvolvimento da medicina, no campo da cirurgia e

21 transplantologia, tem aumentado de forma dramática o número de indivíduos imunocomprometidos, os quais são mais susceptíveis à infecções fúngicas, (KARKOWSKA-KULETA, 2009). Micoses invasivas representam uma ameaça exponencialmente crescente para a saúde humana devido a uma combinação de diagnóstico lento e a existência de, relativamente, poucas classes de drogas antifúngicas disponíveis e eficazes, podendo resultar em alta mortalidade atribuível (DAI et el., 2012) Muitos dos fatores de virulência fúngica têm se desenvolvido naturalmente durante a evolução do organismo, e originalmente atua como uma defesa contra condições ambientais desfavoráveis, e por este caminho muitos deles tornaram-se importantes como fatores de virulência, facilitando a infecção (KARKOWSKA- KULETA, 2009). Cândida albicans (CA) apresenta-se como a mais prevalente espécie envolvida em infecções (LYON, et al., 2011), representam uma das micofloras oportunistas da cavidade oral com especial importância para a saúde humana (GRICE, 2012), provoca micoses superficiais e doença sistêmica disseminada (PFALLER, 2007). Há também aqueles pacientes com leucemia, imunossupressão, usuários de corticoides, pacientes com outras condições debilitantes que podem desenvolver infecções sistêmicas e/ou locais mais graves, extensas e difíceis de serem tratadas na presença desse fungo (PUPO et al., 2011, EGGIMANN et al., 2003). A alta taxa de mortalidade das infecções invasivas por cândida e disponibilidade limitada de agentes antifúngicos eficazes torna necessário desenvolver novas terapias antifúngicas. (LI, 2013). A TFD reduz a habilidade de a CA causar uma infecção sistêmica (KATO, 2013). Curcumina (CUR) é um pigmento intensamente amarelo, isolado a partir de rizomas de Curcuma longa, que é em todo o mundo usado como um tempero de cozinha, agente aromatizante e corante (EPSTEIN; SANDERSON; MACDONALD, 2010). Ela é um composto natural capaz de inibir o crescimento CA, assim como atuar sinergicamente com outras drogas (GARCIA-GOMES et al., 2012).

22 Existe um crescente número de investigações sugerindo que a CUR apresenta potenciais aplicações terapêuticas que pode ser melhorada por combinação com a luz, uma vez que exibe uma elevada absorção de luz na região espectral visível, em torno de 400-500 nm (HAUKVIK et al., 2009, DOVIGO et al., 2011). Recentemente, este composto natural tem demonstrado possuir potencial efeito fototóxico contra células de levedura (DOVIGO et al., 2011). Os autores descobriram que a CUR é um FS eficaz para a inativação de uma estirpe de referência de CA, na forma planctônica. Também mostrou que a terapia foi mais eficaz na inativação da levedura, sugerindo certa especificidade CUR-mediada de TFD. No entanto, alguns aspectos precisam ser mais bem investigados antes de uma recomendação clínica da terapia, tais como o protocolo adequado para a fotossensibilização eficaz de biofilmes de Candida. A utilização da CUR como fotossensibilizador deve ser restrita à aplicação tópica, sendo de uso ideal em feridas infectadas superficialmente ou em infecções orais. Isso se deve ao fato do comprimento de onda correspondente a sua ativação ser também o mesmo absorvido por biomoléculas, comprometendo, dessa forma, sua penetração nos tecidos adjacentes (HEGGE et al., 2011). Além disso, a CUR possui baixa toxicidade no escuro, o que é uma característica desejada em um fotossensibilizador (MEISEL; KOCHER, 2005) ALVES (2011) analisou a eficiência de equipamentos rotineiramente encontrados nos consultórios odontológicos (LED azul - λ = 450 a 470 nm), associado a Curcumina, por meio do estudo da susceptibilidade in vitro, a inibição fotodinâmica de isolados do fungo Candida albicans e da bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Foram preparadas soluções aquosas de Curcumina (25, 50, 100 e 150 μm) com concentrações reduzidas, e verificada a ressonância entre o corante e a luz emitida pelo equipamento testado. Os resultados obtidos demonstraram que o LED azul associado à Curcumina nos parâmetros utilizados possuem eficiência fotodinâmica na inativação dos microrganismos, podendo assim fornecer subsídios para o planejamento de nova alternativa para o tratamento das infecções relacionadas a esses agentes. Com o objetivo de avaliar a efetividade da TFD mediada pela CUR, associando diferentes tempos de pré-irradiação (TPI), concentrações e doses de luz, na redução

23 da viabilidade celular de três espécies de Cândida em culturas planctônicas e biofilmes, Andrade et al. (2013) concluíram que esse tipo de procedimento foi efetivo na redução da viabilidade celular dos fungos estudados; ainda verificou que fotoinativacão dos micro-organismos nas culturas planctônicas foi dependente da concentração de CUR, porém não foi dependente do TPI, mostrando que as suspensões celulares, independente do tempo de contato com o FS, apresentaram inativações celulares estatisticamente semelhantes Dovigo et al. (2011) avaliaram o efeito da TFD mediada pela CUR contra isolados clínicos de C. albicans, C. tropicalis, e C. glabrata e mostraram que baixas concentrações de CUR poderiam ser altamente eficazes para a inativação de isolados de Cândida quando associado a excitação com luz. As três principais espécies de Cândida que estão frequentemente associadas à infecções fúngicas foram eficientemente fotossensibilizada com os protocolos testados. Leitão (2014), avaliando a efetividade da TFD mediada pela curcumina, associando diferentes concentrações (15 e 30) e doses de luz (36, 108 e 180Jcm3) em culturas planctônicas de Cândida albicans num TPI de 5 minutos, concluiu que houve inativação total do microrganismo em todos os parâmetros testados, oferecendo dados para elaboração de novos protocolos no tratamento das infecções relacionadas à Cândida albicans. Campos et al. (2013) em sua revisão bibliográfica sobre a CUR, como promissor agente fotossensibilizador, concluiu que devido aos protocolos propostos utilizando-a como agente fotossensibilizador na TFD serem recentes, existe a necessidade de se realizarem diversos estudos metodológicos, pré-clínicos e, posteriormente, clínicos, com finalidade de avaliar a concentração inibitória mínima da CUR fotoativada, o tempo de fotoativação necessária para máxima ação antimicrobiana da droga, assim como tempo necessário de pré-irradiação, para que haja sua máxima efetividade.

24 3 - OBJETIVOS 3.1 Geral Avaliar, in vitro, o efeito da terapia fotodinâmica utilizando a curcumina como substância fotossensibilizadora associado a um LED de luz azul na inativação de células planctônicas de Candida albicans 3.2 Específicos Investigar o efeito da curcumina na inativação fotodinâmica de Candida albicans; Avaliar a toxicidade da curcumina, na ausência de luz, em células planctônicas de Candida albicans; Verificar o efeito da luz LED na viabilidade celular de Cândida albicans.

25 4 - MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Caracterização da pesquisa Por se tratar de uma pesquisa envolvendo a contagem de cepas antes e depois do tratamento fotodinâmico, esta pesquisa pode ser classificada como quantitativa. Após a contagem, foi obtida a média entre as triplicatas de cada amostra e o número de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/ml) será calculado. Os valores em UFC/ml foram transformados em logaritmo (log 10 ) para serem analisadas estatisticamente. 4.2 Terreno da pesquisa Esta pesquisa foi realizada no laboratório de microbiologia do curso de biomedicina das Faculdades Integradas de Patos (FIP), localizado na R. Floriano Peixoto 223, Patos, Paraíba Todas as condições testadas foram realizadas no escuro à temperatura ambiente e em condições assépticas no interior de uma câmara de fluxo laminar (Figura 02). As placas microtitulação foram cobertas com lâminas de papel alumínio para impedir a penetração da luz do ambiente, e a sala permaneceu com as luzes apagadas com presenças de pontos luminosos distantes da câmara. Figura 02: Câmara de fluxo laminar, onde foram realizados os experimentos Fonte: Arquivo pessoal

26 4.3 Instrumento de coleta de dados Após a manipulação das culturas de C. albicans e sua diluição, além da diluição e aplicação apropriada da curcumina, os resultados desta pesquisa foram devidamente registrados dentro de um formulário (Figura 03), contendo variáveis como a frequência da luz a LED, o seu tempo de aplicação, a concentração da curcumina, o número de cepas restantes e um campo para anotar qualquer observação a mais. Figura 03: Formulário usado para registro da leitura das placas 4.4 Procedimentos metodológicos 4.4.1 Delineamento Estudo experimental verdadeiro com grupo controle pré e pós- teste. 4.4.2 Instrumentos i) Espécies fúngicas Foi utilizada uma Cultura de Candida albicans (ATCC10231) proveniente da Fundação André Tosello que é uma das principais instituições brasileiras que viabilizam a realização de inúmeros projetos, transferindo conhecimentos da universidade para a indústria, por meio da prestação de serviços administrativos e de manutenção de uma das maiores coleções de culturas microbianas do mundo: a Coleção de Culturas Tropical - CCT.

27 Figura 04: Cepa de Cândida Albicans usada da pesquisa Fonte: Arquivo pessoal ii) Meio de cultura Para a execução do ensaio foi utilizado o meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose-ASD (União Química, São Paulo, Brasil) com 50 mg/l cloranfenicol, preparado e utilizado segundo as recomendações do fabricante. O ASD contendo 5μg/mL de cloranfenicol é um meio seletivo para fungos e será usado nas semeaduras das placas de Petri após procedimentos experimentais envolvendo as culturas planctônicas. Para o preparo do meio de cultura, serão utilizados 65 g do pó para 1L de água destilada, conforme a proporção recomendada pelo fabricante. Após dissolução completa do meio de cultura, o béquer contendo a mistura será levado à autoclave vertical para esterilização a 121 C, por 15 minutos. Após a esterilização, ainda na fase líquida, cerca de 20 ml do meio será vertido em placas de Petri estéreis descartáveis, mantendo proximidade de 10 cm da chama do bico de Bunsen. As placas de Petri serão individualmente fechadas e mantidas em temperatura ambiente até a completa solidificação do meio de cultura. Após a solidificação, todas as placas de Petri serão devidamente identificadas e datadas. iii) Fonte emissora de luz Foi utilizado como fonte de luz um equipamento Diodo Emissor de Luz (LED) azul modelo LEC PRIME (MM OPTICS LTDA, São Carlos, SP Brasil), semicondutor de emissão de luz composto por diodo de InGaN, alimentação: 100-240V~50-60Hz, registro na ANVISA/MS n 80051420018. A luz emitida se encontra numa estreita faixa do espectro fotomagnético, predominantemente em 455nm, próximo da qual o fotossensibilzador empregado apresenta alta capacidade de absorção de luz. A forma de emissão da luz é contínua (CW) e a área da ponteira (spot) é de 0,5 cm 2. Os tempos testados serão de 1 e 2 minutos, que emitirão doses de 36 e 72J/cm 2, respectivamente.

28 Figura 05: LED modelo LEC PRIME da MMOPTICS LTDA Fonte: Arquivo pessoal. iii) Fotossensibilizador O fotossensibilizador utilizado foi a Curcumina em pó (Sigma Curcumin from Curcuma longa (Turmeric), Sigma-Aldrich do Brasil Ltda), em solução aquosa, preparada na concentração final de 15μg/ml e 30 μg/ml. De acordo com Alves (2011) a curcumina é um pigmento que devido sua estrutura química é praticamente insolúvel na água e no éter etílico, mas solúvel no etanol e no DMSO (dimetilsulfóxido), e também é estável em soluções com ph menor que 8,0 e em temperaturas inferiores a 125 C. Figura 06: Curcumina em pó e nas duas diluições Fonte: Arquivo pessoal. 4.4.3 Preparo do inóculo de c. Albicans Células de Candida albicans foram subcultivadas a partir de frascos estoques em Agar Sabouraud Dextrose ASD sob condições aeróbicas a 37 o C. Inóculos da levedura, em solução fisiológica esterilizada a 0,9%, serão preparados a partir de culturas de 24h. Após agitação com o auxílio do aparelho Vortex (Fanem ) durante 2 minutos, a turbidez da suspensão de células será ajustada com auxílio de um espectrofotômetro a 530 nm para obter suspensões com densidade óptica de 0,284,

29 corresponde a uma concentração de fungos de 10 6 unidades formadoras de colônias por ml (UFC/mL)(PEREIRAet al., 2011; QUEIROGA et al., 2011; KATO et al., 2013). Figura 07: Espectrofotômetro Calibrado Fonte: Arquivo pessoal. 4.4.4 Preparo das soluções de Curcumina Para a realização deste experimento, a Curcumina em pó foi dissolvida em DMSO. Uma alíquota dessa solução será diluída com água deionizada obtendo-se solução de concentrações 15μg/ml e 30μg/ml. As concentrações usadas no experimento foram de 7,5μg/ml e 15μg/ml. As soluções de estoque foram, entretanto, preparadas nas concentrações de 15μg/ml e 30μg/ml, o dobro da concentração final desejada, já que, quando esta solução foi adicionada a igual volume de suspensão de Candida albicans a concentração da curcumina foi reduzida à metade, atingindo-se a concentração final de 7,5μg/ml e 15μg/ml, respectivamente. O preparo da solução de Curcumina acima descrito está de acordo com a metodologia desenvolvida por Alves (2011). 4.4.5 Condições experimentais avaliadas A seguir estão descritas as etapas realizadas para a avaliação da efetividade da terapia fotodinâmica mediada pela Curcumina na inativação da cepa de Candidaalbicansem culturas planctônicas. i) Grupo 1 (L-FS-) Grupo Solução Salina No grupo 1 (L-FS-), as células de C. albicans não receberam nenhum

30 tratamento, ou seja, nem foram sensibilizadas pelo fotossensibilizador, nem foram expostas à luz. Alíquotas de 100 µl da suspensão (10 6 ufc/ml) foram transferidas para os poços da placa de microtitulação e, em seguida, o mesmo volume de solução salina a 0,9% foi depositado em cada poço e a placa ficou em repouso no escuro por 2 minutos. Os resultados obtidos com as culturas dessas amostras foram utilizados como parâmetro para comparação com aqueles obtidos com as culturas das amostras submetidas à sensibilização com Curcumina e iluminação com o LED. Figura 08: Esquema do preparo da solução Salina Fonte: Arquivo pessoal. ii) Grupo 2 (L+FS-) Grupo LED No grupo 2 (L+FS-), as células de C. albicans foram expostas à luz do LED, mas não foram sensibilizadas pelo fotossensibilizador. Com este grupo foi possível avaliar o efeito da luz emitida pelo LED isoladamente na inativação das células da levedura. Alíquota de 100μL da suspensão celular foi transferida individualmente para um dos poços de uma placa de 96 poços. Em seguida, o mesmo volume de solução salina 0,9% estéril foi transferido para o poço. O sistema de ensaio ficou mantido no escuro por 2 minutos e em seguida realizou-se a irradiação com o LED azul por 1 mim (L1 FS-), totalizando uma dose de 36J/cm 3 e 2 mim (L2 FS-), totalizando uma dose de 72 J/cm 3.

31 Figura 09: Esquema do preparo do grupo LED Fonte: Arquivo pessoal. De acordo com a dose aplicada foram estabelecidos os dois subgrupos: LED 36 : As amostras foram irradiadas durante 1 minuto, resultando em uma dose de 36J/cm 2 LED 72 : As amostras foram irradiadas durante 1 minuto, resultando em uma dose de 72J/cm 2 A potência de saída (600mW/cm 2 ) e o comprimento de onda de (455nm) do aparelho foram os mesmos nos grupos e a fórmula empregada para o calculo da dose foi: Dose(J/cm 2 ) = Potência (W/cm 2 ) x Tempo (s) iii) Grupo 3 (L-FS+) Grupo Curcumina

32 Para que seja avaliada a existência de efeitos tóxicos da Curcumina sobre as suspensões celulares, foram incluídas neste estudo amostras sensibilizadas com esse fotossensibilizador e que não foram irradiadas com o LED azul em nenhum dos tempos. Alíquotas de 100μl da suspensão celular foram transferidas individualmente para um dos poços de uma placa de 96 poços. Em seguida adicionou-se o mesmo volume de Curcumina de acordo com concentração final da solução. Às suspensões celulares deste subgrupo, foram adicionados 100μl da solução de Curcumina 30μg/ml para obtenção da concentração final de fotossensibilizador de 15μg/ml(L-FS[30]). Da mesma fora foi feita na solução de curcumina de 15μg/ml para obtenção da concentração final de fotossensibilizador de 7.5μg/ml(L-FS[15]). O sistema de ensaio ficou mantido no escuro por 3 minutos. O tempo de incubação da Curcumina foi estabelecido de acordo com trabalhos anteriores que também utilizaram a Curcumina como fotossensibilizador (ALVES, 2011; ANDRADE, 2013). Figura 10: Esquema do preparo do grupo CUR Fonte: Arquivo pessoal

33 iv) Grupo 4 (L+FS+) Grupo terapia fotodinâmica (TFD) No grupo terapia fotodinâmica grupo (FS+L+), as células de C. albicans foram sensibilizadas com a curcumina, e expostas a luz do LED azul. Alíquotas de 100μl da suspensão da levedura (10 6 UFC/mL) foram transferidas individualmente para um poço de uma placa de microdiluição com 96 poços. Em seguida, acrescentou-se o mesmo volume de Curcumina na concentração testada. As placas contendo as suspensões resultantes serão deixadas em repouso, no escuro durante 3 minutos. Após este período, as placas serão expostas a luz do LED azul na dose testada no tempo de 1 e 2 mim. De acordo com as concentrações da solução de curcumina e de acordo com as doses de luz avaliadas foram estabelecidos quatro subgrupos: CUR: Nas suspensões celulares deste subgrupo foram adicionados 100μl da solução de Curcumina 30μg/ml e 15μg/ml para obtenção da concentração final de fotossensibilizador de 15μg/ml e 7.5μg/ml, respectivamente. As amostras serão irradiadas durante 1 e 2 minutos. Figura 11: Esquema do preparo do grupo TFD Fonte: Arquivo pessoal

34 Tabela 1: Resumo esquemático dos grupos estudados. Fonte: Arquivo pessoal Grupos Símbolos Procedimento Subgrupo Grupo 1 G1 L-FS- Sem tratamento Controle Grupo 2 G2 Grupo 3 G3 Grupo 4 G4 TFD L+FS- L-FS+ L+FS+ LED 1mim sem CUR LED 2mim sem CUR Sem LED e CUR 15μg/ml Sem LED e CUR 30μg/ml LED 1 mim + CUR 15μg/ml LED 2 mim + CUR 15μg/ml LED 1 mim + CUR 30μg/ml LED 2 mim + CUR 30μg/ml L1 FS- L2 FS- L-FS[15] L-FS[30] L1 FS[15] L2 FS[15] L2 FS[30] L2 FS[30] 4.4.6 Contagem das unidades formadoras de colônias Para todas as condições avaliadas, foram realizadas diluições seriadas a partir das amostras contidas nos orifícios das placas. Para isso, um alíquota de 100µL foi removida de cada amostra e transferida para um tubo de ensaio contendo 900µL de solução salina estéril. Este tubo foi agitado vigorosamente em agitador de tubos e uma nova alíquota de 100µL será removida do mesmo e colocada em outro tubo de ensaio contendo 900µL da solução salina. Este procedimento foi realizado três vezes para cada amostra e, desta forma, as diluições seriadas de 10-1 à 10-3 foram obtidas. Em seguida alíquotas de 25 µl de cada diluição da suspensão foram semeadas em placas de Petri (90/15mm/DISPO-PETRI) contendo ASD. Adicionalmente, alíquotas de 25 µl foram removidas das cavidades das placas de orifícios e transferidas diretamente para uma placa de Petri, sem a realização de uma diluição. Uma alça de Drigalsky/loop estéril foi utilizada para espalhar a solução sobre o meio de cultura contido na placa. O plaqueamento foi realizado em triplicata, para uma melhor caracterização do valor obtido. Após a incubação das placas de Petri a 37 o C por 48 horas, foi realizado o cálculo do número de microrganismos viáveis em valores de UFC/ml. Optou-se pela contagem em UFC visto que grande

35 parte dos trabalhos revisados, usam esse tipo de contagem facilitando, assim a comparação dos dados. Figura 12: Contagem das colônias com auxilio de um contador de colônias Fonte: Arquivo pessoal Após a contagem, obteu-se a média entre as triplicatas de cada amostra e o número de unidades formadoras de colônias por mililitro (ufc/ml) foi calculado. Os valores em UFC/ml serão transformados em logaritmo (log 10 ) para serem analisadas estatisticamente. Para o cálculo de UFC/ml será utilizada a seguinte fórmula: UFC/ml = Número de colônias x 10 n q Nessa fórmula, n equivale ao valor absoluto da diluição (0, 1, 2 ou 3), e q equivale à quantidade, em ml, pipetada para cada diluição quando nas semeaduras das placas. No presente estudo, q = 0.025 já que foram pipetados 25 μl para cada diluição. Os valores de ufc/ml obtidos foram deixados em notação científica. Optou-se pela visualização dos resultados em dessa maneira, visto que, a maioria dos trabalhos estudados apresentavam esse tipo de contagem, facilitando assim a comparação dos dados. 4.5 Tratamento dos dados Os resultados dos log 10 (UFC/mL) para cada condição testada foram expressos através das medidas estatísticas: média, desvio padrão e mediana.

36 Valores de P inferiores a 0,05 serão considerados significativos. Para a comparação entre os grupos e entre as diluições foi utilizado o teste estatístico Kruskal-Wallis, e no caso de diferença significativa foram utilizadas comparações múltiplas do referido teste (CONOVER, 1980). Ressalta-se que na análise foi o logaritmo decimal do número de colônias + unidade e que a escolha do teste Kruskal-Wallis foi devido ao número de amostras em cada grupo e diluição. A margem de erro utilizada nas decisões dos testes estatísticos foi de 5%. Os dados foram digitados na planilha EXCEL e o programa utilizado para obtenção dos cálculos estatísticos foi o SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na versão 21.

37 5 - RESULTADOS 5.1 Comparativos entre os grupos controle por diluição e entre diluições por grupo São apresentadas as medidas descritivas de tendência central (média e mediana) e de variabilidade (Desvio Padrão) do logaritmo de colônias (UFC) acrescido de uma unidade (+1) segundo os grupos controle e a diluição, na Tabela 2.. Ressalva-se que o logaritmo com valor zero foi somado (+1), sempre que os números de colônia forem nulos, pois não existe logaritmo do numero zero. O logaritmo de maior que 0 e menor do que 1 é negativo e o valor de logaritmo de 1,00 é zero. Foram comprovadas diferenças significativas (p < 0,05) entre as diluições em cada um dos grupos e através de testes de comparações múltiplas se comprova entre cada um dos pares de diluição. Também foram notadas diferenças entre os grupos em cada uma das diluições, sendo verificadas diferenças entre cada um dos pares de grupos, exceto entre Solução salina, LED 1 e LED 2 na diluição 1 (x 10-1 ); exceto entre os pares de grupos Solução salina, LED 1 e LED 2 e entre Curcumina 15 com Curcumina 30 em cada uma das diluições 2 (x 10-2 ) e 3 (x10-3 ). Tabela 02: Estatísticas do logaritmo do numero de colônias +1 segundo o grupo e diluição. Diluição Grupo 1 (10-1+) 2 (10-2 ) 3 (10-3 ) Valor de p Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) Solução salina 3,00 ± 0,00 (3,00) (A, a) 2,59 ± 0,07 (2,61) (B, a) 1,70 ± 0,05 (1,69) (C, a) p (1) = 0,024* LED 1 3,00 ± 0,00 (3,00) (A, a) 2,54 ± 0,04 (2,55) (B, a) 1,61 ± 0,09 (1,62) (C, a) p (1) = 0,024* LED 2 3,00 ± 0,00 (3,00) (A,a) 2,54 ± 0,02 (2,54) (B, a) 1,55 ± 0,08 (1,56) (C, a) p (1) = 0,024* Curcumina (15) 2,89 ± 0,02 (2,90) (A, b) 2,31 ± 0,02 (2,31) (B. b) 1,40 ± 0,03 (1,40) (C, b) p (1) = 0,027* Curcumina (30) 2,85 ± 0,01 (2,85) (A, c) 2,19 ± 0,07 (2,19) (B, b) 1,20 ± 0,05 (1,20) (C, b) p (1) = 0,027* Valor de p p (1) = 0,008* p (1) = 0,024* p (1) = 0,015*

38 (1): Através do teste de Kruskal Wallis para comparações entre as diluições para cada grupo com comparações múltiplas do referido teste. (2): Através do teste de Kruskal Wallis para comparações entre os grupos para cada diluição com comparações múltiplas do referido teste.obs.: Se as letras maiúsculas entre parênteses são distintas, comprova-se diferença significativa entre as diluições para cada grupo correspondente. 5.2 Comparativos entre os grupos controle independente da diluição Pode observar na tabela 3 as medidas descritivas de tendência central (média e mediana) e de variabilidade (Desvio Padrão) do logaritmo de colônias (UFC) acrescido de uma unidade (+1) segundo os grupos controle independente da diluição. Não se observam diferenças significativas entre os grupos (p>0,05). Tabela 3: Estatística do logaritmo do numero de colônias +1 segundo os grupos controle independente da diluição Grupo Média ± DP (Mediana) Suspensão celular 2,43 ± 0,58 (2,61) LED 1 2,38 ± 0,61 (2,55) LED 2 2,36 ± 0,64 (2,54) Curcumina (15) 2,20 ± 0,65 (2,31) Curcumina (30) 2,08 ± 0,72 (2,19) Valor de p p (1) = 0,417 (1): Através do teste de Kruskal Wallis 5.3 Comparativos entre os grupos experimentais (terapia fotodinâmica) por diluição e entre as diluições por grupo Agora serão apresentados, na tabela 4, as medidas descritivas de tendência central (média e mediana) e de variabilidade (Desvio Padrão) do logaritmo de colônias (UFC) acrescido de uma unidade (+1), segundo os grupos resultantes das combinações de Curcumina nas duas concentrações utilizadas (15μg/ml e 30μg/ml) com a luz de LED com tempos de aplicação de 1 e 2 minutos. Como todas as estatísticas foram nulas, os logaritmos foram nulos e não foram vistas diferenças significativas entre os grupos em nenhuma das diluições (p>0,05) mostrando, assim

39 que, nos grupos da terapia fotodinâmica ocorreu a inativação total da Cândida albicans. Tabela 4 Estatística do logaritmo do numero de colônias de +1 segundo os grupos experimentais Diluição Grupo 1 2 3 Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) Média ± DP (Mediana) Curcumina (15) + LED 1 0,00 ± 0,00 (0,00) 0,00 ± 0,00 (0,00) 0,00 ± 0,00 (0,00) Curcumina (15) + LED 2 0,00 ± 0,00 (0,00) 0,00 ± 0,00 (0,00) 0,00 ± 0,00 (0,00) Curcumina (30) + LED 1 0,00 ± 0,00 (0,00) 0,00 ± 0,00 (0,00) 0,00 ± 0,00 (0,00) Curcumina (30) + LED2 0,00 ± 0,00 (0,00) 0,00 ± 0,00 (0,00) 0,00 ± 0,00 (0,00) Valor de p p (1) = 1,000 p (1) = 1,000 p (1) = 1,000 (1): Através do teste de Kruskal Wallis.. 5.4 Comparativos entre os grupos experimentais (grupo de terapia fotodinâmica) independente da diluição A tabela 5 mostra as medidas descritivas de tendência central (média e mediana) e de variabilidade (Desvio Padrão) do logaritmo de colônias (UFC) acrescido de uma unidade (+1), segundo os grupos resultantes das combinações de Curcumina nas duas concentrações utilizadas (15μg/ml e 30μg/ml) com a luz de LED com tempos de aplicação de 1 e 2 minutos. Como todas as estatísticas foram nulas, os logaritmos foram nulos e não foram vistas diferenças significativas entre os grupos em nenhuma das diluições (p>0,05) mostrando, assim que, nos grupos da terapia fotodinâmica ocorreu a inativação total da Cândida albicans.

40 Tabela 5 Estatística do logaritmo do numero de colônias de +1 segundo os grupos (combinação do corante e da luz) independente da diluição. Grupo Média ± DP (Mediana) Curcumina (15) + LED 1 0,00 ± 0,00 (0,00) Curcumina (15) + LED 2 0,00 ± 0,00 (0,00) Curcumina (30) + LED 1 0,00 ± 0,00 (0,00) Curcumina (30) + LED 2 0,00 ± 0,00 (0,00) Valor de p p (1) = 1,000 (1): Através do teste de Kruskal Wallis. 5.5 Comparativos entre os grupos experimentais (grupo de terapia fotodinâmica) e os grupos controle Na tabela 6 observamos as medidas descritivas de tendência central (média e mediana) e de variabilidade (Desvio Padrão) do logaritmo de colônias (UFC) acrescido de uma unidade (+1), segundo o grupo independente de diluição. Verificou-se que a média foi mais elevada quando se usou a solução salina e oscilou-se quando se utilizou a luz LED nos tempos de 1 e 2 minutos, reduzindo ainda mais quando usado a Curcumina 15 e Curcumina 30 e sendo nulas quando foi utilizado o corante Curcumina combinado com a luz LED, sendo comprovada diferença significativa entre os grupos (p < 0,001), com diferenças significativas entre: cada um dos grupos solução Salina e Curcumina 30 e dos grupos da TFD com cada um dos outros grupos controle. Tabela 6: Estatísticas do logaritmo do numero de colônias +1 segundo grupo Estatísticas Grupo Média ± DP Mediana Valor mínimo Valor máximo Solução salina 2,43 ± 0,58 (A) 2,61 1,65 3,00 LED 1 2,38 ± 0,61 (AB) 2,55 1,52 3,00

41 LED 2 2,36 ± 0,64 (AB) 2,54 1,46 3,00 Curcumina (15) 2,20 ± 0,65 (AB) 2,31 1,36 2,91 Curcumina (30) 2,08 ± 0,72 (B) 2,19 1,15 2,86 Curcumina (15) + LED 1 0,00 ± 0,00 (C) 0,00 0,00 0,00 Curcumina (15) + LED 2 0,00 ± 0,00 (C) 0,00 0,00 0,00 Curcumina (30) + LED 1 0,00 ± 0,00 (C) 0,00 0,00 0,00 Curcumina (30) + LED 2 0,00 ± 0,00 (C) 0,00 0,00 0,00 Valor de p p (1) < 0,001* (1): Através do teste de Kruskal Wallis com comparações do referido teste. Obs. Obs.: Se todas as letras entre parênteses são distintas, comprova-se diferença significativa entre os grupos correspondentes.