CARACTERIZAÇÃO CARIOTÍPICA DA POPULAÇÃO DE Astyanax altiparanae DO CÓRREGO DOS CAETANOS, UBERLÂNDIA-MG.

PIBIC-UFU, CNPq & FAPEMIG Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação DIRETORIA DE PESQUISA CARACTERIZAÇÃO CARIOTÍPICA DA POPULAÇÃO DE Astyanax altiparanae DO CÓRREGO DOS CAETANOS, UBERLÂNDIA-MG. Danyele Mendes Oliveira 1 ; Instituto de Genética e Bioquímica; Universidade Federal de Uberlândia; Av. Amazonas, Bloco 4C, sala 26, Uberlândia CEP 38400-902; dany_bio@yahoo.com.br. Robson José de Oliveira Júnior 2 ; Instituto de Genética e Bioquímica; Universidade Federal de Uberlândia; robson_junr@yahoo.com.br. Sandra Morelli 3 Instituto de Genética e Bioquímica; Universidade Federal de Uberlândia;morelli@ufu.br. Resumo: Dos Characiformes o grupo mais complexo é a família Characidae. Integrante desta família, o gênero Astyanax é encontrado desde o território Argentino até a fronteira do México com os Estados Unidos, sendo representado por mais de 100 espécies diferentes. Esse gênero é caracterizado citogeneticamente com um número diplóide variando de 2n=36 a 2n=50. Estudos citogenéticos nestas espécies possibilitaram uma grande evolução no conhecimento taxonômico e das particularidades e semelhanças entre as várias espécies. O presente estudo objetivou analisar citogeneticamente a população da espécie de Astyanax altiparanae encontrada no córrego dos Caetanos, Uberlândia-MG, por meio de técnicas de localização da heterocromatina constitutiva, a qual pode ser realizada por coloração com fluorocromos específicos, e bandamentos por enzimas de restrição. Os fluorocromos utilizados no presente trabalho foram a Cromomicina A 3 e o Hoechst 33258. A Cromomicina é um fluorocromo G-C específico e quando utilizada obteve um padrão de marcação mais evidente apenas no braço menor do primeiro par de cromossomos submetacêntricos. O Hoechst 33258 é um fluorocromo A-T específico e não apresentou marcações, ou seja, a população não possui regiões heterocromáticas ricas nesses pares de bases, o que é característico da espécie. A Enzima de Restrição Dde I produziu blocos heterocromáticos somente nas regiões teloméricas. Enquanto que a Hind III produziu alguns blocos heterocromáticos nas regiões pericentroméricas e teloméricas. Os dados citogenéticos obtidos no presente estudo permitem caracterizar a população de Astyanax altiparanae do córrego dos Caetano, Uberlândia- MG. 1 Acadêmica do Curso de Ciências Biológicas 2 Doutorando em Genética e Bioquímica 3 Orientadora

Palavras-chave: Região Neotropical; Citogenética; Córrego dos Caetano; Cromomicina A 3. 1. INTRODUÇÃO 1.1. Citogenética de Peixes Neotropicais A região Neotropical é complexa e extremamente diversificada devido aos diferentes biomas que dela fazem parte. Sua rede hidrográfica é portadora dos mais representativos grupos de espécies de peixes de água doce do mundo. Essa diversidade pode ser diretamente correlacionada com a heterogeneidade estrutural, bem como com a história geológica dessa região (PERES, 2005). Os peixes representam o grupo mais diversificado e um dos mais interessantes para estudos da variabilidade genética e de evolução entre os vertebrados (ARTONI et al., 2000). A maior parte dessa diversidade, mais especificamente a sul americana, pertence a um dos cinco grupos dominantes: Siluriformes, Ciclídideos, Characiformes, Cyprinodontiformes, Gymninotiformes, (LUNDBERG et al., 2000). A variabilidade no número cromossômico no grupo dos peixes é grande, com o número diplóide variando de 12 a 250 cromossomos (KIRPICHNIKOV, 1981 apud FELDBERG, 1990). Além da variabilidade quanto ao número diplóide, também é observada grande diversificação quanto à distribuição de heterocromatina constitutiva, tamanho e quantidade das regiões organizadoras de nucléolos, morfologia cromossômica, e presença ou ausência de cromossomos supranumerários (ARAUJO, 2003). Estas variações são encontradas não só entre grupos taxonômicos básicos, mas também dentro de ordens, famílias, gêneros ou mesmo espécies (OLIVEIRA et al., 1988). 1.2. Gênero Astyanax Dos Characiformes o grupo mais complexo é a família Characidae (BRITSKI, 1972). Grupo ao qual o gênero Astyanax pertence, tal gênero compreende mais de uma centena de espécies e subespécies, muitas das quais ainda não foram descritas. Em vista do número de espécies, distribuição e taxonomia, Astyanax tem sido considerado um dos mais complexos gêneros de caracídeos da América do Sul (FERNANDES; MARTINS-SANTOS, 2004). O gênero Astyanax é um dos táxons de peixes de água doce mais amplamente distribuído nas Américas. Sua distribuição vai desde a Argentina até a fronteira do México com os Estados Unidos. Seu estudo se faz cada dia mais importante para sua melhor classificação e subdivisão em subespécies (LUCENA; 1993; FROESE; PAULY, 2005). Nos Astyanax o número diplóide varia de 2n=36 a 2n=50 cromossomos (FORESTI, et al 1989). Anteriormente alocado em Tetragonopterinae, Astyanax é hoje considerado um gênero Incerto Sedis em Characidae (LIMA et al, 2003). A. lacustris e A. altiparanae são espécies de bacias diferentes, sendo a primeira da bacia do Rio São Francisco e a segunda do Alto Paraná. Por apresentarem um padrão morfológico semelhante eram até pouco tempo, consideradas como uma única espécie, denominada A. bimaculatus. No entanto, recentes estudos identificaram particularidades suficientes para classificá-las como espécies distintas. Embora A. lacustris tenha o mesmo padrão de colorido de A. altiparanae no flanco e alturas aproximadamente iguais das porções acima e abaixo da linha horizontal que passa pela fenda bucal, dela difere por outros caracteres, tais como dentes grandes com penta e hexácuspides e menor número de dentes pequenos no dentário (GARUTTI; BRITSKI, 2000). 2. OBJETIVOS A. altiparanae é a espécie que possui o maior número de estudos citogenéticos (TORRES- MARIANO; MORELLI, 2008). Deste modo o presente trabalho pretende analisar, por meio de algumas técnicas, a população de A. altiparanae presente no córrego dos Caetanos a fim de 2

comparar com os estudos existentes de outras populações, tentando assim entender a evolução cariotípica da espécie. 3. MATERIAIS E MÉTODOS Trabalho realizado na Universidade Federal de Uberlândia, laboratório de Citogenética, Instituto de Genética e Bioquímica (INGEB) durante o período de Setembro de 2008 a Julho de 2009. 3.1. Materiais As coletas dos exemplares de Astyanax altiparanae foram realizadas em pontos do Córrego dos Caetano, localizado na Fazenda Caetano, Uberlândia MG. O número total de espécimes capturados, por pesca com vara ou rede, foram 23, dos quais 13 eram fêmeas e 10 eram machos. 3.2. Métodos Os cromossomos mitóticos foram obtidos através da técnica de preparação direta, adaptada por Bertollo et al. (1978), para estudos cromossômicos em peixes, com pequenas mudanças. A Heterocromatina constitutiva foi marcada através de Coloração com Cromomicina A3 (CMA3), descrita por Schmid (1980), e Hoechst 33258, descrita por Verma e Babu (1995). Foram utilizadas também enzimas de restrição, DdeI e HindIII, as quais são responsáveis por reconhecer e cortar as moléculas de DNA em seqüências específicas. As melhores metáfases foram escolhidas para montagem dos diferentes cariótipos, com a finalidade de determinar os tipos cromossômicos. Assim, as melhores fotografias foram recortadas e os cromossomos organizados em ordem decrescente de tamanho, em seguida cada um foi medido em um programa de computador especifico para cromossomos, o Micro Measure, o qual identifica os tipos cromossômicos, mostrando se os mesmos são metacêntricos, submetacêntricos, ou acocêntricos, o tamanho dos cromossomos e também os pares homólogos. 4. RESULTADOS 4.1 Cromossomos mitóticos a partir de coloração com Giemsa convencional As metáfases analisadas da espécie Astyanax altiparanae (Figura 1) do Córrego dos Caetano, apresentaram, na maioria das vezes, um número diplóide de 2n= 50 cromossomos, como é característico da espécie. Figura 1: Exemplar de Astyanax altiparanae Os cromossomos mitóticos obtidos através da técnica de preparação direta, adaptada por Bertollo et al. (1978), foram analisados e as metáfases mais adequadas foram utilizadas para a montagem do cariótipo (Figura 2). 3

Com a montagem dos cariótipos, a partir de lâminas com coloração com Giemsa, observouse que os espécimes analisados apresentaram 8 pares de cromossomos metacêntricos, 13 pares de submetacêntricos, 2 pares de subtelocêntricos e 2 pares de acrocêntricos (figura 2). 4.2 Coloração com Cromomicina Figura 2: cariótipo de Astyanax altiparanae corado com giemsa. As lâminas contendo os cromossomos metafásicos foram submetidas à técnica de coloração com cromomicina A 3, obtendo-se a marcação da heterocromatina constitutiva. Em Astyanax altiparanae o tratamento com o fluorocromo cromomicina A 3 evidenciou a heterocromatina rica em G-C associada às NORs (PACHECO, GIULIANO-CAETANO, DIAS, 2001). Os indivíduos tiveram apenas o braço menor do primeiro cromossomo submetacêntrico marcado. Sendo que na maioria das metáfases os dois cromossomos do par apresentavam uma marcação com CMA 3 evidente(figura 3). Figura 3: Metáfase tratada com Cromomicina A 3. As setas indicam o primeiro par de cromossomos 4.3 Coloração diferencial por Hoechst 33258 As metáfases de Astyanax altiparanae coradas com Hoechst 33258, que é um corante fluorescente que tem uma afinidade maior pelas bases nitrogenadas Adenina e Timina (A-T), não apresentaram uma coloração mais forte em regiões ricas nestes pares de bases, como ocorreu com a 4

cromomicina (Figura 4). Este resultado é característico da espécie, como relatado em outras literaturas. Figura 4: Metáfase submetida à coloração com Hoechst 33258. 4.4 Bandamentos por endonucleases de restrição As enzimas de restrição são responsáveis por cortarem o DNA em seqüências específicas, sendo que o local do corte varia de uma enzima para outra. As regiões cromossômicas que ficam mais claras após o tratamento com as enzimas são ricas na seqüência de bases nitrogenadas específicas da enzima utilizada, portanto são mais digeridas. As regiões mais escuras, ou seja, coradas mais fortemente, são aquelas onde as enzimas não atuam, deixando assim essas regiões menos digeridas, pois não houve perda de DNA nesse local, já que são pobres na seqüência da enzima ou regiões protegidas por heterocromatina constitutiva. Dde I A Enzima de restrição Dde I, extraida da bactéria Desulfovibrio desulfurican, tem como caracteristica cortar o DNA na seguinte seqüência específica: 5...C TNA G...3 3...G ANT C...5 As lâminas contendo os cromossomos metafásicos foram tratadas com a enzima Dde I e apresentaram marcações nas regiões teloméricas, como mostra a Figura 5. Figura 5: Coloração com a enzima Dde I. As setas indicam regiões com blocos heterocromáticos teloméricos. As regiões mais claras do cromossomo são aquelas pobres na seqüência AAGCTT. Hind III A Enzima de restrição Hind III, extraida da bactéria Haemophilus influenzae, corta o DNA na seguinte seqüência específica: 5...A AGCT T...3 3...T TCGA A...5 5

Os cromossomos metafásicos tratados com Hind III apresentaram alguns blocos heterocromáticos pericentroméricos e teloméricos. No maior par de cromossomos metacêntricos foram encontrados regiões pericentroméricas mais fortemente coradas, mais conservadas (Figura 6). Figura 8: Coloração com Hind III. As setas indicam regiões com bloco heterocromático pericentromérico e telomérica. 5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO A macroestrutura cariotípica verificada apresenta tendência à manutenção do número diplóide basal para esta espécie, a exemplo do que ocorrem em populações de Astyanax altiparanae em outras bacias hidrográficas estudadas anteriormente, especialmente em relação ao número cromossômico diplóide para machos e fêmeas (2n = 50 cromossomos). Na população de Astyanax altiparanae do Córrego dos Caetano localizado na cidade de Uberlândia-MG, verificou-se também um número cromossômico diplóide igual a 50 cromossomos. Este é, portanto um caráter que deve ser considerado como basal para a espécie. Quanto à classificação dos cromossomos de acordo com a localização do centrômero observou-se variação quando comparada com outras populações anteriormente descritas. Esta variação cariotípica encontrada pode ser conseqüência da diferença de condensação cromossômica. Segundo Oliveira et al. (1988), de que em alguns grupos de peixes a diversidade cromossômica existente é encontrada dentro de ordens, famílias, gêneros ou mesmo espécies. Morelli et al., (1983) sugere que as diversificações cariotípicas nos Astyanax, podem ser resultado de rearranjos Robertsonianos, isto é, fusão de dois cromossomos acrocêntricos formando um metacêntrico; e o fato de que muitos dos caracídeos caracterizarem-se por apresentar um par de cromossomos metacêntricos grandes, quando comparados coma diferença entre os demais, pode indicar que estes rearranjos ocorreram na evolução do cariótipo do grupo. Quando submetidos à coloração com Cromomicina A 3, tal população apresentou coloração no braço menor do primeiro par de cromossomos submetacêntricos. Indivíduos de populações diferentes de Astyanax altiparanae,podem apresentar marcações em mais de um par cromossômico. Esta diferença de marcação com Cromomicina A 3 pode ser utilizada como ferramenta para se distinguir indivíduos de duas populações. A distância existente entre diferentes populações dificulta o fluxo gênico entre os indivíduos. Como as populações de diferentes regiões estão sofrendo diversificadas pressões ambientais é compreensível que ambas possuam características genéticas distintas, resultantes de uma evolução cariotípica diferenciada. O par de cromossomos submetacêntricos marcados pela cromomicina corresponde ao par de cromossomos portador da NOR. Este resultado é frequentemente encontrado em peixes, uma vez que neste grupo as regiões organizadoras do nucléolo quase sempre são associadas a regiões ricas em GC. Quando submetidos à coloração com Hoechst 33258 não foi evidenciada nenhuma região com coloração mais forte, não revelando assim regiões ricas em AT. 6

Cromossomos metafásicos fixados com metanol / ácido acético e secados ao ar são susceptíveis a enzimas de restrição (DNases). O padrão de coloração produzido por cada enzima de restrição é muito característico e facilmente reprodutível, fornecendo a oportunidade de usar essas enzimas para entender a natureza e características da porção de heterocromatina constitutiva do genoma (VERMA; BABU, 1995). Os cromossomos metafásicos tratados com Hind III apresentaram alguns blocos heterocromáticos pericentroméricos e teloméricos, provavelmente devido ao fato de tal região não possuir grande quantidade da seqüência específica que a enzima reconhece e digere. Em um dos cromossomos metacêntricos foram encontrados regiões pericentroméricas conservadas (mais fortemente coradas). Todos os resultados apontam para um grau de conservação em relação à macroestrutura cariotípica nos exemplares das populações em estudo, mas as pequenas variações observadas sugerem que diversas técnicas de bandamento cromossômico podem trazer novas informações para o estudo cariotípico destas populações (TORRES-MARIANO, 2006). 6. AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus pais que sempre estiveram do meu lado e me apoiaram, ao meu irmão e orientadora, que acreditaram no meu potencial e me ajudaram muito para que eu chegasse até aqui e também ao CNPq pelo fomento da pesquisa científica e realização de sonhos acadêmicos. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA ARAUJO, A. C. S. Comparação citogenética de quatro populações de Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae) da região do triângulo Mineiro. 66.p. Dissertação (Mestrado em Genética e Bioquímica) Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2003. ARTONI, R. F; VICARI, M. R; BERTOLLO, L. A. C. Neotropical fish cytogenetics: methods, results and perspectives. Biological and Health Sciences, v. 6, p. 43-60. 2000. BERTOLLO, L.A.C.; TAKAHASHI, C.S.; MOREIRA FILHO, O. Cytotaxonomic considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Brazil. J. Genet., v.1, p. 103-120. 1978. BRITSKI, H.A. Peixes de água doce do Estado de São Paulo. Sistemática. Poluição e Piscicultura. Faculdade de Saúde Pública da USP Instituto de Pesca da C.P.R.N. da Secretaria da Agricultura, p. 79-108. São Paulo, 1972. FELDBERG, E. Estudos citogenéticos em 12 espécies de peixes da família Curimatidae (Characiformes) da Amazônia Central. Tese (programa de pós graduação do INPA) INPA, Manaus, 1990. 126p. FERNANDES, C. A.; MARTINS-SANTOS, I. C. Cytogenetic studies in two populations of Astyanax altiaparanae (Pisces, Characiformes). Hereditas, v. 141, p. 1-5, 2004. FORESTI, F.; ALMEIDA-TOLEDO, L. F.; TOLEDO, S. A. Supranumerary chromosome system C-banding pattern characterization and multiple Nucleolus Organizing Regions in Moenkhausia cactafilomene (Pisces, Characidae) Genetica, v. 79. p. 107-114, 1989. GARUTTI, V.; BRITSKI, H.A. Descrição de uma nova espécie de Astyanax altiparanae (Teleostei: Characidae) da bacia do rio Paraná e considerações sobre as demais espécies do gênero na bacia. Comun. Mus. Ciênc. Tecnol. PUCRS. Sér. Zool. Porto Alegre, v. 13, p. 65-88, 2000. 7

LIMA, F. C. T. et al. Genera Incertae Sedis in Characidae. In: Reis, R. E.; S. O. Kullander; Ferraris JR. C. J. (Org. ). Check list of the freshwater fishes of South and Central América. Porto Alegre: EDIPUCRS, 2003. p. 106-169. LUCENA, C. A. S. Estudo monofilético da família Characidae com um a discussão dos grupos naturais propostos (Teleostei, Ostariophysi, Characiformes). 1996. 158 p. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) Universidade de São Paulo, São Paulo, 1993. LUNDBERG, J. G. et al. So many fishes, so little time: na overview of recent ichthyological discovery in continental water. Annals of the Missouri Botanical Garden, v.87, p.26-62, 2000. MORELLI, S.; BERTOLLO,L.A.C.; MOREIRA-FILHO,O. Cytogenetic considerations on the genus Astyanax (Pisces, Characidae). II. Ocurrence of natural triploidy. Caryologia,v.36,p.245-250,1983. OLIVEIRA, C. et al. Chromosome formulae of neotropical freswater fishes. Brazilian Journal of Genetics, v. 11, p. 577-624, 1988. PACHECO, R. B.; GIULIANO-CAETANO, L.; DIAS, A. L. Cytotypes and multiple NORs in a Astyanax altiparanae population (Pisces, Tetragonopterinae). Chromosome Science. v. 5, p. 109-114, 2001. PERES, W. A. M. Análise da diversidade cariotípica de Characidae da bacia do São Francisco, 2005 disponível em: <http://www. bdtd. ufcar. br/tde_arquivos/16/tde-2006-02- 03T11:34:55Z-781/Publico/DissWAMP. pdf. > acesso em 7 de Maio de 2007. SCHMID, M. Chromosome banding in Amphibia. IV. Differentiation of GC- and AT- rich chromosome regions in anura. Chromosoma v. 77, p. 83-103, 1980. SCHMID, M.; GUTTENBACH, M. Evolutionary diversity reverse (R) fluorescent chromosomes bands in vertebrates. Chromosoma. v. 97, p.101-114, 1989. TORRES-MARIANO, A. R.; MORELLI, S. Chromosomal analysis of Astyanax fasciatus(pisces, CHARACIDAE) from the Araguari river, Uberlândia, MG, Brazil. Brazilian Journal of Biology, v.66, p. 161-165. 2006. TORRES-MARIANO, A. R.; MORELLI, S. B chromosomes in a population of Astyanax eigenmanniorum (Characiformes, Characidae) from the Araguari River Basin (Uberlândia, MG, Brazil). Genetics and Molecular Biology, 31, 246-249, 2008. KARYOTIPICAL CHARACTERIZATION OF THE Astyanax altiparanae POPULATION OF CAETANOS STREAM, UBERLÂNDIA-MG. Danyele Mendes Oliveira 1 ; Genetics and Biochemistry Institute; Federal University of Uberlândia ; Av. Amazonas, Bloco 4C, sala 26, Uberlândia CEP 38400-902; dany_bio@yahoo.com.br. Robson José de Oliveira Júnior 2 ; Genetics and Biochemistry Institute; Federal University of Uberlândia; robson_junr@yahoo.com.br. Sandra Morelli 3 Genetics and Biochemistry Institute; Federal University of Uberlândia; morelli@ufu.br. ABSTRACT: The Characidae family is the most complex group of Characiformes. Astyanax genus is found from the Argentine territory to the border of Mexico with the United States, represented by more than 100 different species. The study of this genus is important to better classification and division into subspecies. This genus is cytogenetically characterized with a diploid number ranging from 2n = 36 to 2n = 50. Cytogenetic studies in these species have enabled a great progress in 8

taxonomic knowledge and in the particularities and similarities between various species. This study aimed to analyze the cytogenetic population of the species of Astyanax altiparanae found in Caetanos stream, Uberlândia-MG, using techniques for localization of constitutive heterochromatin, which can be performed by staining with specific fluorochromes. The fluorochromes used in this study were the Chromomycin A3 and Hoechst 33258. The Chromomycin is a GC specific fluorochrome and obtained a marking pattern only in the lower arm of the first pair of submetacentric chromosomes. The Hoechst 33258 is an AT specific fluorochrome and showed no markings, indicating that this population doesn t show regions of heterochromatin rich in these base pairs, which is characteristic of the species. The Dde I restriction enzyme produced heterochromatic blocks only in telomeric regions. While Hind III produced some heterochromatic blocks in pericentromeric and telomeric regions. The cytogenetic data obtained in this study permit to characterize the population of Astyanax altiparanae of the stream of Caetano, Uberlândia-MG. Key-words: Neotropical region; Cytogenetics; Caetano stream; Chromomicyn A 3. 9