MF-459.R-1 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO EFEITO AGUDO LETAL CAUSADO POR EFLUENTES LÍQUIDOS EM CRUSTÁCEOS DA ESPÉCIE ARTEMIA SALINA MÉTODO ESTÁTICO Notas: Aprovada pela Deliberação CECA nº 3.480, de 25 de abril de 1996. Publicada no DOERJ de 10 de maio de 1996. 1. OBJETIVO Estabelecer o método de determinação do efeito agudo letal causado por efluentes líquidos em nauplius do crustáceo marinho da espécie Artemia Salina. 2. DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA NT-202 Critérios e Padrões para Lançamento de Efluentes Líquidos. NT-213 Critérios e Padrões para Controle de Toxicidade em Efluentes Líquidos Industriais. JN-214 Justificativa Técnica da NT-213 Critérios e Padrões para Controle de Toxicidade em Efluentes Líquidos Industriais. MF-402 Método de Coleta de Amostras de Efluentes Líquidos Industriais. MF-454 Método de Determinação do Efeito Agudo Letal Causado por Agentes Tóxicos em Crustáceos da Espécie Artemia Salina Método Estático. DZ-942 Diretriz do Programa de Autocontrole de Efluentes Líquidos PROCON ÁGUA. 3. DEFINIÇÕES Para efeito deste documento são consideradas as definições: 3.1 Efluentes líquidos despejos, provenientes de atividades poluidoras ou potencialmente poluidoras, de origem industrial, doméstica, comercial, agrícola e outras lançados diretamente em corpos d água. 3.2 Toxicidade capacidade de um efluente líquido provocar um efeito observável em um organismo aquático vivo. 3.3 Toxicidade aguda toxicidade em que os efeitos nos organismos testes são observados em curto período de tempo de, no máximo, 96 horas.
3.4 Teste de toxicidade teste padronizado no qual organismos aquáticos vivos são utilizados para detectar a toxicidade de um efluente líquido. 3.5 Concentração de Efeito Não Observado CENO maior concentração de um efluente líquido que não causa efeito letal em nauplius de Artemia salina num período de 24 horas. É expressa em porcentagem de efluente líquido na solução-teste. 3.6 Número de Unidades de Toxicidade ou Fator de Diluição-UT definido pela fórmula: UT = 100 / CENO. 3.7 UT A número de unidades de toxicidade tendo como referência os testes em nauplius de Artemia salina. 3.8 Nauplius forma larval do desenvolvimento de alguns crustáceos, quando recém-eclodidos do cisto (ovo). 4. PRINCÍPIO DO MÉTODO A sensibilidade de organismos às propriedades tóxicas das substâncias químicas pode variar consideravelmente de uma espécie para outra, devido às diferenças em seus metabolismos e à natureza de seus habitats. A Artemia salina é um pequeno crustáceo marinho característico de poços e pequenos lagos de água salgada, apresentando uma grande adaptação às variações de salinidade. Os nauplius da Artemia salina são utilizados internacionalmente em testes de toxicidade, por apresentarem as seguintes características: - os organismos adultos têm um grande potencial reprodutivo; - são de fácil aquisição e manutenção em laboratório; - os cistos (ovos) são de fácil eclosão; - os testes apresentam uma boa reprodutibilidade. O método se baseia na propriedade de efluentes líquidos causarem efeito letal em nauplius da espécie Artemia salina. 5. RESUMO DA TÉCNICA O método consiste na exposição de nauplius de Artemia salina (com 24 horas de vida após a eclosão) às várias concentrações de efluentes líquidos por um período de 24 horas. Tal procedimento permite determinar a maior concentração que não causa efeito letal aos organismos testados (CENO). O efeito tóxico é expresso em Número de Unidades de Toxicidade ou Fator de Diluição do Efluente Líquido (UT A ).
6. APLICABILIDADE Este método se aplica a efluentes líquidos industriais com salinidade igual ou maior que 5 g/kg. 7. INTERFERÊNCIAS Efluentes líquidos com alto teor de sólidos em suspensão, alto consumo de oxigênio dissolvido, ph menor que 5,0 e maior que 9,0, óleos e graxas provocam variações nos resultados que serão incluídas na avaliação da toxicidade. 8. APARELHAGEM E MATERIAIS 8.1 Os aparelhos, vidrarias e materiais necessários são: - balança analítica com precisão de 0,1 mg; - agitador magnético; - barras magnéticas revestidas de teflon; - sala com temperatura controlada a 24 ºC 1 ºC; - câmara de DBO com temperatura controlada (24 ºC 1º C); - condutivímetro/salinômetro; - medidor de oxigênio dissolvido; - medidor de ph; - lupa estereoscópica; - balões volumétricos de 100 ml, 200 ml, 500 ml, 1000 ml e 2000 ml; - kit para filtração a vácuo; - pipetas Pasteur; - pipetas volumétricas de 10 ml, 20 ml e 50 ml; - pipetas tipo Mohr de 1ml, 5 ml e 10 ml; - béqueres de 250 ml, 500 ml, 1000 ml; - recipientes para teste: béqueres de 25 ml; - kitazato de 2000 ml; - depósitos de água em vidro de 1 L a 10 L; - béquer para hidratação e separação dos nauplius (Figura 1). 8.2 Todo o material que entre em contato com a amostra do efluente líquido deve ser quimicamente inerte. 8.3 A vidraria, antes de ser utilizada nos testes, deve ser lavada na seguinte seqüência: detergente, água de torneira, acetona pura, água de torneira, ácido nítrico a 5%, água de torneira e água destilada.
9. PRODUTOS QUÍMICOS E SOLUÇÕES 9.1 PRODUTOS QUÍMICOS a) Ácido Bórico (H 3 BO 3 ) PA b) Sal Tetra Sódico do Ácido Etileno Diamino Tetracético (Na 4 EDTA) PA c) Bicarbonato de Sódio (NaHCO 3 ) PA d) Brometo de Potássio (KBr) PA e) Cloreto de Estrôncio (SrCl 2.6H 2 O) PA f) Cloreto de Cálcio (CaCl 2. H 2 O) PA g) Cloreto de Potássio (KCl) PA h) Cloreto de Magnésio (MgCl 2.6H 2 O) PA i) Cloreto de Sódio (NaCl) PA j) Fluoreto de Sódio (NaF) PA l) Silicato de Sódio (NaSiO 3.9H 2 O) PA m) Sulfato de Sódio (Na 2 SO 4 ) PA 9.2 SOLUÇÕES a) Solução 1N de Ácido Clorídrico (HCl) PA b) Solução 1N de Hidróxido de Sódio (NaOH) PA 10. ÁGUA DE DILUIÇÃO DO EFLUENTE LÍQUIDO ÁGUA DO MAR SINTÉTICA A água utilizada para diluição do efluente líquido é a mesma água usada para incubar os cistos (ovos) para eclosão dos nauplius. Para o preparo da água do mar sintética deve-se utilizar água desionizada com condutividade menor que 5 us/cm. Reagentes Concentrações (g/l) Solução A: NaF 0,03 SrCl 2.6H 2 O 0,20 H 3 BO 3 0,30 KBr 1,00 KCl 7,00 Solução B: CaCl 2.2H 2 O 5,57 Solução C: Na 2 SO 4 20,0
Solução D: MgCl 2.6H 2 O 107,8 Solução E: NaCl 117,5 Solução F: NaSiO 3.9H 2 O 0,20 Na 4 EDTA 0,010 NaHCO 3 2,00 OBSERVAÇÃO: Se houver suspeita de que o efluente ou a substância contenha metais pesados, deverá ser suprimido o ETDA do preparo da solução e mantidas as concentrações indicadas nas demais soluções. Para cada litro de água do mar sintética misturar os reagentes inicialmente nos seguintes volumes de água desionizada: Reagentes Água desionizada (ml) Solução A 100 Solução B 200 Solução C 200 Solução D 100 Solução E 200 Solução F 100 Juntar os volumes de acordo com a ordem especificada anteriormente em um balão volumétrico de 1000 ml ou outro recipiente aferido. Rinsar os recipientes com água desionizada transferindo para o recipiente aferido e completar o volume para 1000 ml. Para volumes maiores utilizar proporcionalmente as quantidades e os procedimentos descritos. Os volumes a serem preparados dependerão da programação de testes. Para maior homogeneização dos reagentes, misturar em agitador magnético pelo menos 24 horas, obtendo-se os seguintes valores de parâmetros: ph entre 8,0 e 9,0 e salinidade entre 34,0% e 35,0%.
Se necessário, corrigir o ph utilizando NaOH 1N ou HCl 1N. Em seguida filtrar a água do mar sintética por membrana com porosidade de 0,45 u. Alterar, fracamente, apenas o volume que será utilizado no teste ou eclosão dos nauplius, uma hora antes da utilização. O restante deve ser estocado em recipiente protegido da luz por um período de, 2 semanas a 24 ºC 1 ºC. 11. AMOSTRA DO EFLUENTE LÍQUIDO 11.1 A amostra do efluente líquido deve ser mantida em temperatura na faixa de 0 a 4 ºC para sua utilização em, no máximo, 48 horas ou à temperatura menor que -12 ºC no período de 7 dias, após o qual a amostra perde a validade. 11.2 O volume da amostra necessário dependerá da toxicidade do efluente e da necessidade de repetição do teste, coletando-se normalmente 1 litro. 11.3 Os frascos utilizados para coleta de amostras devem ser de material quimicamente inerte. 11.4 É necessário que alguns parâmetros e características do efluente sejam medidos e observados no momento da coleta, tais como: salinidade, ph, temperatura, oxigênio dissolvido, sólidos, cor, presença de óleo e vazão. Anotar esses dados na Ficha de Coleta. 11.5 As mesmas determinações e observações devem ser feitas em laboratório, à temperatura do teste, imediatamente antes do preparo das soluções-teste e os resultados anotados na Ficha de Controle (Anexo 2) 12. ORGANISMO TESTE Nauplius de Artemia salina (Leach, 1812) Crustácea, Branchiopoda, Anostraca. 12.1 OBTENÇÃO DE ORGANISMOS PARA TESTE Os organismos utilizados são provenientes de cistos (ovos) comprados no mercado. É extremamente importante que a proveniência destes seja conhecida e que possuam uma alta taxa de eclosão, pois do contrário não será possível obter uma população homogênea de nauplius nos estágios II e III, após 24 horas de eclosão. Os cistos devem ser guardados protegidos da umidade e da luz. Os nauplius para o teste são obtidos de acordo com as instruções constantes no Anexo 1.
12.2 AFERIÇÃO DA SENSIBILIDADE DOS ORGANISMOS Cada lote de nauplius deve ser avaliado quanto à sua sensibilidade, utilizando-se uma substância de referência. Dentre os compostos indicados, o Dodecil Sulfato de Sódio (DSS) ou Lauril Sulfato de Sódio (LSS), com grau de pureza de 98% a 102%, é o mais usado por ser solúvel em água e servir como detergente na dispersão de óleos em ambientes marinhos. Os nauplius são expostos a várias concentrações do DSS por 24 horas. Utiliza-se um controle e uma série de 5 a 6 concentrações com intervalos iguais na escala logarítmica, preferencialmente na faixa entre 9 mg/l a 36 mg/l de DSS. Utilizam-se duas a três réplicas para cada concentração e para o controle, sendo que para cada réplica devem ser usados 10 nauplius. Ao final do teste o valor da CL 50 deve estar entre 16 mg/l e 28 mg/l de Dodecil Sulfato de Sódio (DSS), para que o lote seja aprovado. 13. PROCEDIMENTOS 13.1 LOCAL DO TESTE O local do teste deve ser independente dos locais de lavagem de material e estocagem dos organismos, isento de gases tóxicos, poeiras e com temperatura controlada para que as soluções-teste se mantenham na faixa de 24 ºC 1 ºC. 13.2 PREPARO DAS SOLUÇÕES-TESTE 13.2.1 As soluções-teste devem ser preparadas em local apropriado e para diluição das amostras deve ser usada água do mar sintética, preparada de acordo com as instruções constantes no item 10. 13.2.2 Medir o ph, OD, temperatura e salinidade do efluente e anotar na Ficha de Controle (Anexo 2). Outras determinações e observações efetuadas por ocasião da coleta devem ser também repetidas e anotadas. 13.2.3 Preparar uma série de concentrações com volumes de 100 ml em balões volumétricos, de acordo coma série geométrica apresentada na Tabela:
SÉRIE DE DILUIÇÕES PARA TESTE COM EFLUENTES LÍQUIDOS PARTES DA ÁGUA DE DILUIÇÃO PARTES DE EFLUENTES FATOR DE DILUIÇÃO (UT) CONCENTRAÇÃO % 0 1 1 100,00 1 1 2 50,00 3 1 4 25,00 7 1 8 12,50 15 1 16 6,25 31 1 32 3,13 63 1 64 1,56 127 1 128 0,78 O número de soluções-teste e a faixa de concentração a ser utilizada dependerá da toxicidade do efluente. Normalmente utilizam-se 4 a 6 concentrações e um controle com água de diluição. 13.2.4 Medir o ph, OD, temperatura e salinidade de cada solução-teste e da água de diluição que será usada como controle e anotar na Ficha de Controle (Anexo 2) 13.3 DESENVOLVIMENTO DO TESTE 13.3.1 Preparar 2 a 3 béqueres de 25 ml com um volume de 100 ml para cada réplica e para o controle. 13.3.2 Transferir 10 nauplius para cada béquer contendo soluções-teste, usando uma pipeta Pasteur, iniciando pelo controle até a maior concentração. 13.3.3 Incubar um câmara de DBO por 24 horas a 24 ºC 1 ºC. 13.3.4 Ao final de 24 horas medir o ph, OD, temperatura e salinidade e como auxílio de uma lupa estereoscópica, contar o número de organismos mortos em cada réplica e concentração. Anotar esses dados na Ficha de Controle. 14. RESULTADOS 14.1 DETERMINAÇÃO DA CENO E UT A A CENO é determinada diretamente dos dados de mortes observadas no teste e, a UT A, pelo fator de diluição correspondente, em número inteiro. Ex.: CENO = 12,5% UT A = 8
14.2 VALIDADE DOS RESULTADOS O teste será considerado válido se obedecer aos seguintes critérios: - a porcentagem de mortalidade ao final do teste, nos recipientes controle não exceder a 10%; - a LC 50 (24h) do Dodecil Sulfato de Sódio situada entre 16 mg/l e 28 mg/l; - a concentração de oxigênio dissolvido no final do teste deve ser maior que 2 mg/l na menor concentração com 100% de mortalidade dos nauplius. 14.3 RELATÓRIO Devem constar no relatório de teste as seguintes informações: a) método utilizado; b) identificação da amostra testada; c) data da realização do teste; d) água de diluição da amostra; e) origem e número do lote de Artemia salina; f) condições físico-químicas do teste e da amostra; g) a faixa crítica (0% - 100% mortalidade); h) os dados confirmando a validade dos resultados:. CL 50 (24 horas) do DSS;. porcentagem de mortalidade no controle;. conteúdo de oxigênio dissolvido na menor concentração com 100% de mortalidade. qualquer modificação durante o teste 15. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 15.1 VANHAECKE, P & PERSOONE, G. The Arc-Test: a standardized short-term routine toxicity test with Artemia Nauplius. Methodology and evaluation. Ecotoxicological testing for the marine environment. Brendene, 1984. v.2. 15.2 -----. Report on a intercalibration exercise on a short-term standard toxicity teste with Artemia Nauplii (arc-test); INSERM acute aquatic ecotoxicological tests, 1981.v.106.
ANEXO 1 INCUBAÇÃO DOS CISTOS E OBTENÇÃO DOS NAUPLIUS DE Artemia salina. Colocar 0,1 g de cistos em um béquer especial (figura 1), próprio para hidratação e separação dos nauplius, com 1 litro de água do mar sintética (item 10) previamente aerada. Incubar, sem aeração em uma câmara de DBO com temperatura controlada a 24 ºC 1 ºC, por um período de 24 horas, na ausência de luz, para que os ovos sofram um processo de hidratação e eclosão. Retirar o béquer da câmara e separar os nauplius recém eclodidos dos cistos (ovos) não eclodidos e das cascas vazias, com o auxílio de uma caixa de separação (figura 2) e uma lâmpada. Transferir estes nauplius para um béquer comum de 500 ml com mais ou menos 200 ml de água do mar sintética, abrindo rápida e gentilmente a torneira do béquer de separação, em intervalos de mais ou menos 10 min. Dessa forma os nauplius, respondendo ao comportamento de fototactismo positivo, se aproximam do ponto de luz, próximo da torneira de vidro (figuras 1 e 2). Os nauplius separados no béquer de 500 ml devem retornar à câmara de DBO, por mais 24 horas na ausência de luz. Depois deste período estarão prontos para o teste. Para a realização de cerca de 20 testes, 100 mg de cistos (ovos) de boa qualidade e com alta tava de eclosão, fornecem uma quantidade de nauplius suficiente.
ANEXO 2 ANVERSO
ANEXO 2 VERSO