1 SUMÁRIO ASSUNTOS PÁGINAS INTRODUÇÃO 2 ESTRUTURA, PRINCIPAIS FORMAS E ATIVIDADE DO ABA 3 MUTANTES DEFICIENTES E INCENCÍVEIS AO ABA 4 BIOSSÍNTESE INATIVAÇÃO, METABOLISMO E TRANSPORTE DO ABA 6 OCORRÊNCIA DO ABA NAS PLANTAS 10 EFEITO DO ABA NA FISIOLOGIA E NO DESENVOLVIMENTO 12 O ABA Atinge Níveis Máximos nas Sementes Durante a Embriogênese 13 O ABA Promove a Tolerância à Dessecação no Embrião 14 O ABA Promove o Acúmulo de Proteínas de Reserva nas Sementes Durante a Embriogênese 14 A Dormência das Sementes pode ser Imposta pela Testa ou pelo Embrião 15 Dormência Imposta pela Testa 15 Dormência do Embrião 16 Dormência Primária X Dormência Secundária da Semente 16 Fatores Ambientais Controlam a Liberação da Dormência das Sementes 16 A Dormência da Semente é Controlada pela Razão entre ABA e GA 17 O ABA Inibe a Germinação Precoce e a Viviparidade 18 O ABA é Acumulado nas Gemas Dormentes 19 O ABA Inibe a Produção de Enzimas Induzidas pelo GA 20 O ABA Fecha os Estômatos em Resposta ao Estresse Hídrico 20 Em Baixos Potenciais Hídricos, o ABA Promove o Crescimento das Raízes e Inibe o Crescimento da Parte Aérea 22 O ABA Promove a Senescência Foliar Independentemente do Etileno 23 MECANISMO DE ABERTURA E FECHAMENTO ESTOMÁTICO 24 O ABA Aumenta o Cálcio do Citosol, Eleva o ph Citosólico e Despolariza as Membranas 24 A Ativação pelo ABA de Canais Aniônicos Tipo Slow Causa uma Despolarização de Longa Duração da Membrana 27 A Sinalização do ABA nas Rotas Independentes de Ca +2 29 PROTEÇÃO CONTRA INJÚRIAS 31 APLICAÇÕES PRÁTICAS DO ABA 31 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 32
2 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DISCIPLINA: FISIOLOGIA VEGETAL PROFESSOR: ROBERTO CEZAR LOBO DA COSTA ÁCIDO ABSCÍSICO 1- INTRODUÇÃO Por muitos anos, os fisiologistas vegetais suspeitaram que o fenômeno da dormência das sementes e de gemas fosse causado por compostos inibidores, e tentaram com grandes esforços extrair e isolar tais compostos a partir de uma variedade de tecidos vegetais, em especial de gemas dormentes. Antes da década de 40, foram conhecidos os efeitos dos extratos vegetais na promoção da dormência em gemas e sementes, onde na década de 50, as primeiras pesquisas utilizaram cromatografia em papel para separar os extratos vegetais e os bioensaios verificou uma substância denominado inibidor-β, baseados no crescimento de coleóptilos e com a dormência. Na década de 60, os americanos Addicott e cols, isolaram e cristalizaram uma substância que promovia abscisão de frutos do algodoeiro, a abscisina II, na mesma época o inglês Wareing e cols levaram à identificação de um grupo de composto inibidores de crescimento ou dormência incluindo uma substância conhecida como dormina. O neozelandês Van Steveninck, verificou que frutos em desenvolvimento de Lupinus luteus L. produziam uma substância responsável pela abscisão de flores e frutos jovens localizado na posição apical na inflorescência (inibidor β). Uma vez descoberto que a dormina inibidor β era quimicamente idêntica a uma substância que promovia abscisão de frutos do algodoeiro, a abscisina II, e o composto foi renomeado como ácido abscísico (ABA). Hoje se sabe que o etileno é o hormônio que desencadeia a abscisão e que o ABA induz a abscisão de frutos como por exemplo em frutos de algodoeiro por sua capacidade de estimular a produção de etileno. O ABA é atualmente considerado um hormônio vegetal importante pelo seu próprio mérito. Ele inibe o crescimento e a abertura estomática, em especial quando a planta está sob estresse ambiental. Uma outra função importante é a regulação da maturação e da dormência de sementes. Em retrospecto, a dormina poderia ser o nome mais apropriado para este hormônio, contudo a denominação do ácido abscísico é tradicionalmente utilizada na literatura.
3 O ácido abscísico é encontrado em todas as plantas vasculares e nos musgos, mas parece estar ausente nas hepáticas. Vários gêneros de fungos produzem ABA como metabólitos secundários. Nas plantas ele tem sido detectado na maioria dos órgãos ou tecidos vivos, desde a coifa até a gema apical. O ABA é sintetizado em quase todas as células que possuem cloroplastos ou amiloplastos. 2- ESTRUTURA, PRINCIPAIS FORMAS E ATIVIDADE DO ABA O ácido abscísico é um composto de 15 carbonos semelhante à porção terminal de algumas moléculas de carotenóide. A melhor relação estabelecida entre a estrutura e a atividade do ABA são as duplas ligações do Carbono 2-cis e 4-trans, onde o ABA se encontra ativo, C-2 e 4 trans são inativos em experimentos ao escuro. Entretanto, o mesmo no claro se torna ativo provavelmente à isomerização óptica do ABA. A presença de grupos carboxílicos, hidroxílicos e da configuração C- 4-Cetona é essencial para ao receptor e atividade do ABA. Apresenta um carbono assimétrico posição 1 do anel, garantido a atividade óptica (desvio da luz polarizada), onde a forma natural do hormônio é positiva (+) sentido horário dextrógira. Os 2 enantiômeros, (+)-ABA-natural e (-)-ABA (sintético) apresentam atividade biológica, porém em diferentes taxas do catabolismo e produtos (Figura 1). A mistura racêmica é a forma comercial mais acessível, enquanto que a forma pura pode ser obtida a partir da cultura de fungos. Os estudos das exigências estruturais para atividade biológica do ABA têm mostrado que praticamente qualquer mudança na molécula resulta na perda da atividade.
4 Figura 1. Estrutura química e o sistema de numeração dos carbonos na molécula do 2-cis-S(+)- ácido abscísico(aba) e compostos correlatos naturais que fazem parte da biossíntese e/ ou degradação do ABA. Fonte: Kerbauy (2004). 3- MUTANTES DEFICIENTES E INCENCÍVEIS AO ABA Vários mutantes ABA-deficientes apresentando falhas em etapas específicas da via têm sido identificados. Esses mutantes exibem fenótipos anormais, que podem ser corrigidos pela aplicação de ABA exógeno. Por exemplo, flacca e sitiens são mutantes wilty de tomateiro, nos quais a tendência de murcha das folhas (devido à incapacidade de fechar seus estômatos) pode ser evitada pela aplicação de ABA exógeno.
5 Vários ensaios biológicos têm sido utilizados para o ABA, incluindo a inibição do crescimento de coleóptilo, a germinação ou a síntese de α-amilase induzida por giberelinas. Por outro lado, a indução do fechamento estomático e a indução da expressão gênica constituem exemplos de respostas indutivas rápidas. Os mutantes de milho vivíparos (vp) que são bloqueados em outras etapas da via dos carotenóides possuem também níveis reduzidos de ABA e apresentam viviparidade germinação precoce das sementes no fruto enquanto ainda ligado à planta (Figura 2). A viviparidade é uma característica de muitas sementes ABA-deficientes. Os mutantes aba3 de Arabidopsis não apresentam um cofator molibdênio funcional e são, portanto, incapazes de sintetizar ABA. Os métodos físicos de detecção do ABA são muito mais confiáveis do que os bioensaios, devido à sua especificidade e à sua adequação para análises quantitativas. As técnicas mais utilizadas atualmente baseiam-se na cromatografia gasosa ou na cromatografia líquida de alta eficiência. A cromatografia gasosa permite a detecção de concentrações tão baixas quanto 10-13 g de ABA, porém necessita de várias etapas preliminares de purificação. Os imunoensaios são também altamente sensíveis e específicos. Figura 2. Germinação precoce do mutante de milho vp14 ABA-deficiente. A proteína VP14 catalisa a clivagem dos 9-cis-epoxi-carotenóides para formar xantoxal, um precursor do ABA. Fonte: Taiz & Zeiger (2004).
6 4- BIOSSÍNTESE INATIVAÇÃO, METABOLISMO E TRANSPORTE DO ABA Assim como nos outros hormônios, a resposta do ABA depende da sua concentração no tecido e na sensibilidade do tecido ao hormônio. Os processos de biossíntese, catabolismo, compartimentação e transporte, contribuem para a concentração do hormônio ativo no tecido, em qualquer estágio de desenvolvimento. A biossíntese do ABA ocorre nos cloroplastos e outros plastídios. A biossíntese do ABA pode-se dividir em três etapas: (1) síntese dos carotenóides não-oxigenados nos plastídeos; (2) Síntese e clivagem dos carotenóides oxigenados (xantofilas) nos plastídeos, constituído de precursores do ABA; (3) síntese do ABA no citossol. A síntese dos carotenóides não-oxigenados nos plastídeos(figura 3), tem como a via inicial com o isopentenildifosfato (IPP), a unidade isoprênica biológica que por uma série de reações formará o caroteno. Onde o mesmo depois através da Síntese e clivagem dos carotenóides oxigenados nos plastídeos haverá a síntese da xantofila C 40 (Figura 4), violaxantina - um carotenóide oxigenado (Figura 5) através de uma série de reações vai sintetizar o ABA no citossol. A síntese da violaxantina é catalisada pela zeaxantina epoxidase (ZEP), a enzima codificada pelo lócus: ABA1 de Arabidopsis. Essa descoberta forneceu evidências conclusivas de que a síntese do ABA ocorre preferencialmente por via indireta ou via de carotenóides, mais do que como uma pequena molécula. A violaxantina é convertida a um composto C 40, 9 -cis-neoxantina, o qual é, então, cliva- do para formar o composto C 15, xantoxal, um inibidor de crescimento neutro que apresenta propriedades fisiológicas semelhantes à aquelas do ABA. A clivagem é catalisada pela 9 - cis-epoxicarotenóide dioxigenase (NCED), assim chamada porque pode clivar tanto o 9 -cisviolaxantina quanto o 9 -cis-neoxantina. A síntese da NCED é rapidamente induzida pelo estresse hídrico, sugerindo que a reação que ela catalisa é uma etapa-chave de regulação na síntese do ABA. Essa enzima localiza-se nos tilacóides, onde o substrato carotenóide ocorre. Por último, o xantoxal é convertido a ABA por intermédio da etapa oxidativa, envolvendo o(s) intermediário(s) ABAaldeído e/ou ácido xantóxico. A síntese do ABA, a partir da xantoxina, ocorrem no citossol, através de três rotas (1) xantoxina é convertida em ABA-Aldeído e este em ABA, sendo possivilmente o rota mais importante nas plantas; (2) a xantoxina é convertida em aldeído, e este em ABA-álcool e posteriormente em ABA e a ultima a xantoxina é convertida em ac. Xantóxico e este em ABA. (Figura 5). Essa etapa final é catalisada por uma família de aldeído oxidases que necessitam de um cofator molibdênio; A biossíntese e a concentração de ABA podem variar muito em tecidos específicos durante o desenvolvimento ou em resposta às mudanças das condições ambientais. Nas
7 sementes em desenvolvimento, por exemplo, os níveis de ABA podem aumentar 100 vezes em poucos dias e então declinar a níveis muito baixos à medida que a maturação prossegue. Sob condições de estresse hídrico, o ABA nas folhas pode aumentar em 50 vezes dentro de quatro a oito horas. Uma vez irrigadas, o nível de ABA retorna ao normal no mesmo período de tempo. A biossíntese não é o único fator que regula as concentrações de ABA nos tecidos. Assim como em outros hormônios vegetais, a concentração de ABA livre no citosol é também regulada pela degradação, compartimentação, conjugação e transporte. Por exemplo, o ABA citosólico aumenta durante o estresse hídrico como resultado de sua síntese nas folhas, redistribuição nas células do mesófilo, importação das raízes e movimentação a partir de ou trás folhas. A concentração de ABA diminui após a irrigação devido à sua degradação e exportação das folhas, bem como ao decréscimo da taxa de síntese. A maior causa da inativação do ABA livre é a oxidação, produzindo o 6-hidroximetil ABA, um intermediário instável, o qual é rapidamente convertido a ácido faséico (PA) e ácido diidrofaséico (DPA) (ver Figura 2 TAIZ). em geral o PA é inativo ou possui atividade muito reduzida em bioensaios. Entretanto, o PA pode induzir o fechamento estomático em algumas espécies e é tão ativo quanto o ABA na inibição da produção da α-amilase induzi- da pelo ácido giberélico, na camada de aleurona da aveia. Esses efeitos sugerem que o PA é capaz de se ligar a receptores do ABA. Ao contrário do PA, o DPA não apresenta atividade detectável em qualquer um dos bioensaios realizados. O ABA livre é também inativado por conjugação covalente com outras moléculas, com um monossacarídeo. Um exemplo geral de conjugação do ABA é o ABA-β-D-glicosil éster (ABA- GE). A conjugação não apenas resulta na inativação do ABA como hormônio; ela também altera a sua polaridade e a distribuição celular. Enquanto o ABA livre está no citosol, o ABA-GE acumulase nos vacúolos e, assim, poderia, teoricamente, servir como uma forma de armazenamento desse hormônio. As enzimas esterases das células vegetais poderiam liberar o ABA da forma conjugada. Entretanto, não há evidência de que a hidrólise do ABA-GE contribua para o rápido aumento do ABA na folha durante o estresse hídrico.
8 Figura 3. Biossíntese dos carotenóides não-oxigenados, independente do ácido mevalônico, destacando-se a participação das enzimas sintase da 1-desoxi-D-xilulose fosfato (DXS), sintase do fitoeno (PSY) e dessaturase do fitoeno (PDS). Fonte: Kerbauy (2004).
9 Figura 4. Síntese dos carotenóides oxigenados(xantofilas) nos plastídeos, a partir da formação da zeaxantina e subseqüente clivagem oxidativa da 9-cis-violaxantina e/ ou 9-cis-neoxantina. A epoxidase da zeaxantina(zep) catalisa as duas reações de epoxidação para formação da transvioloxantina. A clivagem oxidativa e a incorporação de oxigênio (O 2 *) resultam na formação da xantoxina e de um subproduto com 25 carbonos. Essa reação é catalisada pela dioxigenase do 9-cisepoxicarotenóide(NCED). Os mutantes vp14 e not não realizam essa clivagem oxidativa. Fonte: Kerbauy (2004).
10 Figura 5. Biossíntese do ácido abscísico(aba) no citosol. A xantoxina é formada a partir da clivagem oxidativa da 9-cis-violoxantina e/ ou 9-cis-neoxantina com incorporação de oxigênio. A formação do ABA-aldeído a partir xantoxina é catalisada por uma desidrogenase/redutase de cadeia curta (SDR). O ABA-aldeído forma o ABA com a participação de H 2 O. A reação é catalisada pela oxidase do ABA-aldeído (AO). Os mutantes em que essa reação não ocorre são flc, sit, droopy, nar2a, aba 1, aba3. O ABA também pode ser formado a partir do ABA-álcool e do ácido xantóico. Fonte: Kerbauy (2004). 5- OCORRÊNCIA DO ABA NAS PLANTAS O ABA está presente em todas as plantas vasculares, ocorrendo também em alguns musgos, algas verdes e fungos. Esta presente praticamente em todas as células vivas do vegetal, assim como na seiva do xilema e do floema e no ápice caulinar até o radicular. O ABA é transportado tanto no xilema, floema e células parenquemáticas, havendo intercâmbio entre folhas adultas, folhas jovens e raízes, mas ele é, via de regra, mais abundante na seiva do floema. Quando o ABA radioativado é aplicado em uma folha, ele é transportado tanto de forma
11 ascendente no caule quanto descendente nas raízes. A maior parte do ABA radioativo é encontrada nas raízes dentro de 24 horas. A destruição do floema pelo anelamento do caule inibe o acúmulo do ABA nas raízes, indicando que esse hormônio é transportado pelo floema. O ABA sintetizado nas raízes pode também ser transportado para a parte aérea através xilema. Enquanto que a concentração do ABA na seiva xilemática de plantas de girassol bem hidratadas está entre 1,0 a 15,0 nm, plantas de girassol sob estresse hídrico elevam a concentração do ABA em até 3.000 nm (3,0 um). A magnitude da alteração dos níveis do ABA no xilema induzido pelo estresse varia muito entre as espécies, sendo sugerido que o ABA também seja transportado na forma conjugada e liberado por hidrólise nas folhas. Quando o estresse hídrico inicia, uma parte do ABA sintetizado nas raízes é carregada pela corrente xilemática, a partir das raízes que estão em contato direto com o solo seco. Já que o transporte do ABA ocorre antes que a redução do potencial hídrico do solo possa causar alguma mudança mensurável na condição de água das folhas, acredita-se que o ABA atue como um sinal da raiz, promovendo a redução da taxa de transpiração da planta pelo fechamento estomático. Embora a concentração de 3,0 um do ABA no apoplasto seja suficiente para fechar os estômatos, nem todo o ABA da corrente xilemática atinge as células-guarda. Muito do ABA da corrente transpiratória é absorvido e metabolizado pelas células do mesófilo. Todavia, durante as fases iniciais do estresse hídrico, o ph da seiva xilemática torna-se mais alcalino, aumentando aproximadamente do ph 6,3 para o ph 7,2. O controle principal da distribuição do ABA entre os compartimentos das células vegetais segue um controle de armadilha de ânions : a forma dissociada (ânion) deste ácido fraco acumulase em compartimentos alcalinos e pode ser redistribuída de acordo com o gradiente de ph através da membrana. Além da compartimentação decorrente do ph, os transportadores específicos para absorção contribuem para a manutenção de uma concentração baixa do ABA no apoplasto das plantas não-estressadas. A alcalinização do apoplasto induzida pelo estresse favorece a produção da forma dissociada do ácido abscísico, ABA -, a qual não atravessa facilmente a membrana. Conseqüentemente, menos ABA entra nas células do mesófilo e mais moléculas atingem as célulasguarda através da corrente transpiratória (Figura 6). Observe que o ABA é redistribuído na folha sem que a sua quantidade total seja aumentada. Este aumento no ph da seiva do xilema pode funcionar como um sinal das raízes promovendo o início do fechamento estomático.
12 Figura 6. Aalcalinização da seiva do xilema durante o estresse hídrico promove a redistribuição do ABA na folha. Fonte: Taiz & Zeiger (2004). Nas folhas o ABA pode ser encontrado no apoplasto, citossol, cloroplasto e vacúolo, sendo um ácido fraco, a compartilhamento do ABA obedece ao conceito de aprisionador de ânions em meio alcalino. A molécula de ABA (ABAH) não dissociada lipofílica atravessa a membrana livremente a membrana plasmática da célula-guarda. Por difusão, o ABAH se dissocia como ânion impermeável (ABA - ), sendo guardado no meio mais alcalino do citossol. De vários fatores que afetam a redistribuição do ABA, o gradiente de ph através da membrana são um deles. Onde o estresse hídrico deixa mais alcalino o fluido do apoplasto e a seiva do floema, provocando uma diminuição considerável no gradiente de ph entre simplasto e apoplasto. Provocando assim a liberação do ABA que estava preso no simplasto em direção ao apoplasto, e/ou evita a saída do apoplasto, onde o acumulo do ABA em teores elevados, exercerá seu efeito. As elevações das concentrações endógenas de ABA são encontradas em tecidos vegetais submetidos a estresses ambientais, por exemplo, no desenvolvimento de sementes, a concentração endógena é maior que em tecidos vegetais, haja vista que o ABA está envolvido com o acumulo de proteínas e lipídeos de reserva contra a dissecação, na inibição da germinação precoce e na imposição de dormência primária. 6- EFEITO DO ABA NA FISIOLOGIA E NO DESENVOLVIMENTO O principal papel do ácido abscísico é controlar o início e a manutenção da dormência de sementes e de gemas e as respostas do vegetal ao estresse, em particular ao estresse hídrico. Além disso, o ABA pode influenciar outros aspectos do desenvolvimento por interagir, geralmente como um antagonista, com auxina, a citocinina, a giberelina, o etileno e os brassinosteróides.
13 6.1- O ABA ATINGE NÍVEIS MÁXIMOS NAS SEMENTES DURANTE A EMBRIOGÊNESE O desenvolvimento das sementes pode ser dividido em três fases com duração aproxima damente iguais: 1. Durante a primeira fase, a qual é caracterizada pela divisão celular e diferenciação dos tecidos, o zigoto sofre embriogênese e o tecido do endosperma se prolifera. 2. Durante a segunda fase, as divisões celulares cessam e compostos de armazenamento são acumulados. 3. Na fase final, o embrião torna-se tolerante à dissecação e a semente desidrata, perdendo mais de 90 % de água. Como conseqüência da desidratação, o metabolismo cessa e a semente entra em um estádio quiescente ( latência ). Ao contrário das sementes dormentes, a sementes quiescentes irão germinar após serem reidratadas. As duas últimas fases resultam na produção de sementes viáveis e com recursos adequados para sustentar a germinação, bem como a capacidade para retardar a germinação por semanas e até anos antes de reiniciar o crescimento. Normalmente, o conteúdo de ABA é muito baixo no início da embriogênese, atingindo os níveis mais elevados na fase intermediária desse processo e, então, diminui gradualmente reduzindo os níveis até a semente atingir a maturidade. Assim, existe um grande pico de acúmulo do ABA na semente, correspondendo ao período entre as fases intermediária e tardia da embriogênese. O balanço hormonal das sementes é complexo devido ao fato de que nem todos os tecidos possuem o mesmo genótipo. A testa é originada dos tecidos maternos; o zigoto e o endosperma são originados das plantas parentais. Estudos genéticos em mutantes de ABA-deficientes de Arabidopsis demonstraram que o genótipo do zigoto controla a síntese do ABA no embrião e no endosperma, e é essencial para a indução da dormência, enquanto que o genótipo materno controla o primeiro e principal pico de acúmulo do ABA, auxiliando na inibição da viviparidade na fase intermediária da embriogênese. A principal função do ácido abscísico está ligada à inibição da germinação durante a maturação, ou seja, em sua ausência, pode ocorrer a germinação precoce como em sementes de trigo ainda presas à espiga e de feijão, soja e amendoim no interior da vagem.(figura 4.21 fisiologia de sementes.)
14 6.2- O ABA PROMOVE A TOLERÂNCIA À DESSECAÇÃO NO EMBRIÃO Uma importante função do ABA no desenvolvimento da semente é a promoção da tolerância à dissecação que pode danificar severamente as membranas e outros constituintes celulares. Durante o período entre as fases intermediária e tardia do desenvolvimento da semente ocorre tanto o acúmulo de RNAs-mensageiros específicos quanto o aumento dos níveis endógenos do ABA. Estes RNAs-mensageiros codificam as chamadas proteínas abundantes da embriogênese tardia LEA (LEA, late-embryogenesis-abundant), que parecem estar envolvidas na tolerância a dessecação. A síntese de muitas proteínas LEA pode ser induzida pelo ABA em tratamentos utilizando embriões jovens ou tecidos vegetativos. Assim, a síntese da maior parte das proteínas LEA está sob controle do ABA. 6.3- O ABA PROMOVE O ACÚMULO DE PROTEÍNAS DE RESERVA NAS SEMENTES DURANTE A EMBRIOGÊNESE Compostos de reserva são acumulados entre as fases intermediária e tardia da embriogênese. Devido à presença de elevados níveis do ABA nessa fase, supõe-se que o ABA possa afetar a translocação de açúcares e aminoácidos e/ou a síntese de materiais de reserva. Estudos com mutantes tanto na síntese quanto na resposta ao ABA demonstraram que este hormônio não possui efeito na translocação de açúcar. Por outro lado, o ABA tem apresentado efeito na quantidade e na composição das proteínas de reserva. Por exemplo, o ABA exógeno promove o acúmulo de proteínas de reserva em embriões cultivados de várias espécies. Em alguns mutantes ABA-deficiente ou ABA-insensível, ocorre a redução no acúmulo de proteínas de reserva. Contudo, a síntese de proteínas de reserva é também reduzida em sementes desenvolvidas em mutantes com níveis e respostas normais do ABA, indicando que este é somente um dos vários sinais que controlam a expressão de genes de proteínas de reserva durante a embriogênese. O ABA não somente regula o acúmulo de proteínas de reserva durante a embriogênese como pode também manter o embrião maduro em um estado de dormência, até que as condições ambientais sejam ótimas para o crescimento. A dormência de semente é um fator importante na adaptação dos vegetais a ambientes desfavoráveis. Os vegetais desenvolveram variados mecanismos, alguns dos quais envolvendo o ABA, que permitem a manutenção de suas sementes em um estado de dormência.
15 6.4- A DORMÊNCIA DAS SEMENTES PODE SER IMPOSTA PELA TESTA OU PELO EMBRIÃO Durante a maturação da semente, o embrião entra em uma fase quiescente em resposta à dissecação. A germinação da semente pode ser definida como a retomada do crescimento do embrião na semente madura; ela depende das mesmas condições ambientais das quais depende o crescimento vegetativo. A água e o oxigênio devem estar disponíveis, a temperatura deve ser adequada e não devem existir substâncias inibidoras. Em muitos casos uma semente viável (viva) não irá germinar mesmo se todas as condições ambientais para crescimento sejam satisfeitas, fenômeno denominado dormência da semente. A dormência da semente induz um retardo temporal no processo de germinação, fornecendo um tempo adicional para a dispersão da semente. Isto também maximiza a sobrevivência das plântulas pela inibição da germinação sob condições desfavoráveis. Dois tipos de dormência de sementes têm sido identificadas: dormência imposta pela testa e dormência do embrião. 6.5- DORMÊNCIA IMPOSTA PELA TESTA A dormência imposta ao embrião pela testa da semente e outros tecidos circundantes, como o endosperma, pericarpo ou órgãos extraflorais, é conhecida como dormência imposta pela testa. Os embriões dessas sementes irão germinar rapidamente na presença da água e do oxigênio uma vez que a testa e outros tecidos circundantes tenham sido removidos ou danificados. Existem cinco mecanismos básicos na dormência imposta pela testa. 1 Impedimento da absorção da água. 2 Restrição mecânica. O primeiro sinal visível da germinação é a quebra da testa da semente pela radícula. No entanto, em alguns casos, a testa pode ser demasiadamente rígida para que ocorra a penetração da radícula. Para que as sementes germinem, as paredes das células do endosperma devem ser afrouxadas pela produção de enzimas que degradam as paredes celulares. 3 Interferência com as trocas gasosas. A redução da permeabilidade da testa da semente ao oxigênio sugere que a testa inibe a germinação pela limitação do suprimento do oxigênio para o embrião. 4 Retenção de inibidores. A testa pode impedir a saída de inibidores da semente. 5 Produção de inibidores. A testa da semente e o pericarpo podem conter concentrações relativamente altas de inibidores de crescimento, incluindo o ABA, que pode impedir a germinação do embrião.
16 6.6- DORMÊNCIA DO EMBRIÃO O segundo tipo de dormência de semente é a dormência do embrião, uma dormência que é intrínseca ao embrião e que não é resultante de qualquer influência da testa da semente ou de outros tecidos circundantes. Em alguns casos, a dormência do embrião pode ser interrompida pela excisão dos cotilédones. Espécies nas quais os cotilédones exercem um efeito inibitório incluem a avelã (Corylus avellana) e o freixo (Fraxi-nus excelsior). Uma demonstração fascinante da capacidade dos cotilédones em inibir o crescimento é encontrada em espécies (p. ex., pêssego) nas quais o embrião dormente isolado germina, porém possui um crescimento extremamente lento, formando uma planta anã. Todavia, se os cotilédones são removidos em um estágio inicial do desenvolvimento, a planta muda abruptamente para um crescimento normal. Acredita-se que a dormência do embrião deva-se à presença de inibidores, especialmente o ABA, bem como a ausência de promotores de crescimento como o GA (ácido giberélico). A perda da dormência do embrião está freqüentemente associada à queda acentuada na razão entre ABA e GA. 6.7- DORMÊNCIA PRIMÁRIA X DORMÊNCIA SECUNDÁRIA DA SEMENTE Diferentes tipos de dormência de sementes também podem ser distinguidas mais com base na determinação do tempo de início da dormência do que na causa da dormência: As sementes que são liberadas da planta em um estado dormente são ditas apresentarem dormência primário. As sementes que são liberadas da planta em um estado não-dormente, mas que se tornam dormentes se as condições para a germinação forem desfavoráveis, são ditas apresentarem dormência secundária. Por exemplo, sementes de aveia (Avena sativa) podem se tornar dormentes na presença de temperaturas superiores ao máximo adequado para a germinação, enquanto sementes de facélia (Phacelia dubia) tornam-se dormentes em temperaturas abaixo do mínimo para a germinação. Os mecanismos da dormência secundária são pouco compreendidos. 6.8- FATORES AMBIENTAIS CONTROLAM A LIBERAÇÃO DA DORMÊNCIA DAS SEMENTES Vários fatores externos liberam a semente da dormência do embrião e sementes dormentes respondem tipicamente a mais de um dos três fatores seguintes:
17 1 Pós-maturação. Muitas sementes perdem a dormência quando os seus teores de umidade são reduzidos a um certo nível de dessecamento um fenômeno conhecido como pós-maturação. 2 Resfriamento. Baixas temperaturas, ou resfriamento podem liberar as sementes da dormência. Muitas sementes necessitam de um período de frio (0 10 ºC) quando completamente hidratadas (embebidas), como condição para germinar. 3 Luz. Grande quantidade de sementes necessita de luz para germinar, podendo envolver apenas uma breve exposição como no caso da alface, um tratamento intermitente (p.ex., nas suculentas do gênero Kalanchoe) ou mesmo um fotoperíodo envolvendo dias curtos e longos. 6.9- A DORMÊNCIA DA SEMENTE É CONTROLADA PELA RAZÃO ENTRE ABA E GA As sementes maduras podem ser dormentes ou não, dependendo da espécie. Sementes nãodormentes, como a ervilha, germinarão rapidamente se supridas apenas com água. Por outro lado, sementes dormentes não germinam na presença de água, necessitando de algum tratamento ou condição adicional. Conforme foi visto, pode ser conseqüência da rigidez ou da impermeabilidade da testa (a testa impondo a dormência) ou da manutenção do estado de impedimento do desenvolvimento do embrião. Exemplos deste último incluem sementes que necessitam de pósmaturação, de resfriamento ou de luz para germinar. Mutantes do ABA têm sido extremamente úteis em demonstrar o papel deste hormônio na dormência de sementes. A dormência de sementes de Arabidopsis pode ser superada com um período de pós-maturação e/ou tratamento com frio. Foi demonstrado que os mutantes ABAdeficientes (aba) não eram dormentes na maturidade. Quando foram realizados cruza-mentos recíprocos entre aba e plantas tipo selvagem (dormentes), as sementes apresentaram dormência somente quando o embrião foi capaz de produzir ABA. Nem o ABA materno nem a aplicação exógena foram eficazes na indução da dormência do embrião aba. Por outro lado, a ABA derivado do tecido materno constitui o principal pico presente nas sementes e é necessário para outros aspectos do desenvolvimento dessas como, por exemplo, evitar a viviparidade na fase intermediária da embriogênese. Assim, as duas fontes de ABA funcionam em vias de desenvolvimento diferentes. A dormência é também muito reduzida em sementes do mutante ABAinsensível abi1 (ABA-insensível 1), abi2, e abi3, ainda que tais sementes contenham concentrações mais altas de ABA do que aquelas do tipo selvagem durante todo o desenvolvimento, possivelmente refletindo uma regulação por feedback do metabolismo do ABA. Os mutantes de tomateiro ABA-
18 deficientes parecem funcionar da mesma maneira, indicando que o fenômeno é provavelmente geral. Entretanto, outros mutantes com dormência reduzida, mas com sensibilidade e níveis normais de ABA, indicam a presença de reguladores adicionais de dormência. Embora o papel do ABA na iniciação e na manutenção da dormência da semente é bem estabelecido, outros hormônios contribuem para o efeito total. Por exemplo, o pico de produção do ABA em sementes de muitas plantas coincide com um declínio nos níveis de AIA e GA. A importância da razão entre ABA e GA nas sementes foi demonstrada a partir da triagem genética que levou ao isolamento do primeiro mutante ABA-deficiente em Arabidop-sis. Sementes mutantes GA-deficientes que não poderiam germinar na ausência do GA exógeno foram tratadas com mutagênicos e em seguida crescidas em casa de vegetação. As sementes produzidas por essas plantas foram selecionadas para a reversão e recuperaram a capacidade de germinar. Observou-se que tais sementes isoladas para a reversão eram mutantes da síntese do ácido abscísico. Aquelas que apresentaram a reversão germinaram porque não ocorria a indução da dormência. Assim, a subseqüente síntese do GA não era necessária para superar esse efeito. O estudo ilustra o princípio geral de que o balanço entre os hormônios vegetais é freqüentemente mais crítico do que as suas concentrações absolutas na regulação do desenvolvimento. Entretanto, o ABA e o GA exercem seus efeitos na dormência da semente em diferentes períodos, de modo que os seus efeitos antagônicos na dormência não refletem necessariamente uma interação direta. Recentes triagens genéticas para supressores da insensibilidade ao ABA identificaram interações antagônicas adicionais entre o ABA e o etileno ou brassinosteróides que afetam a germinação. Além disso, muitos alelos novos de mutantes ABA-deficientes ou ABA-insen-sível4 (abi4) têm sido identificados nas triagens para alterações na sensibilidade ao açúcar. Tais resultados indicam que uma complexa rede de regulação integra a sinalização de hormônios e nutrientes. 6.10- O ABA INIBE A GERMINAÇÃO PRECOCE E A VIVIPARIDADE Quando embriões imaturos são removidos de suas sementes e colocados em cultura para completar o seu desenvolvimento, antes do início da dormência, eles germinam precoce-mente, isto é, sem passar pelos estágios normais de quiescência ou de dormência. O ABA adicionado ao meio de cultura inibe essa germinação precoce. Tal resultado, em combinação com o fato de que o nível endógeno do ABA na semente é alto entre as fases intermediária e tardia do desenvolvimento, sugere que o ABA seja o repressor natural que mantém o estado embriogênico do embrião em desenvolvimento.
19 Evidências adicionais do papel do ABA na inibição da germinação precoce têm sido fornecidas por estudos genéticos da viviparidade. A tendência à viviparidade, também conhecida como germinação pré-colheita, é uma característica varietal dos cereais favorecida pelo clima úmido. No milho, foram selecionados vários mutantes vivíparos (vp) nos quais os embriões germinam diretamente na espiga enquanto ainda ela está conectada à planta. Vá-rios desses mutantes são ABA-deficientes (vp2, vp5, e vp 14) (ver Figura 3); um é ABA-insensível (vp1). A viviparidade nos mutantes ABA-deficientes pode ser parcialmente evitada por tratamentos com ABA exógeno. A viviparidade em milho também exige a síntese do GA na fase inicial da embriogênese como um sinal positivo; os duplos mutantes deficientes tanto no GA quanto no ABA não apresentam viviparidade. Ao contrário dos mutantes de milho, os mutantes de um único gene de Arabidopsis (aba1, aba3, abi1 e abi3) não exibem viviparidade, embora não seja dormente. A falta da viviparidade deve ser o resultado da ausência da umidade, pois essas sementes germinam no interior dos frutos sob condições de alta umidade relativa. Entretanto, outros mutantes de Arabidopsis com resposta normal ao ABA e com níveis moderadamente reduzidos de ABA (p. ex., fusca3 - embrião cor castanha pertencente à classe de mutantes deficientes na regulação da transcrição da embriogênese para a germinação) apresentam alguma viviparidade mesmo em baixas umidades. Ademais, os duplos mutantes que combinam a deficiência na síntese do ABA ou na resposta ao ABA com a mutação fusca3 apresentam alta freqüência de viviparidade, sugerindo que mecanismos redundantes de controle impedem a viviparidade em Arabidopsis. 6.11- O ABA É ACUMULADO NAS GEMAS DORMENTES Nas espécies lenhosas, em regiões temperadas a dormência é um importante caráter adaptativo em climas frio. Quando uma árvore é exposta a temperaturas muito baixas, no inverno, ela protege seus meristemas com escamas e o crescimento cessa temporariamente. Tal resposta a baixas temperaturas necessita de um mecanismo sensorial que detecte as mudanças ambientais (sinais sensoriais), além de um sistema de controle que realiza a transdução dos sinais sensoriais e desencadeia o processo de desenvolvimento, levando à dormência das gemas. O ABA foi sugerido originalmente como o hormônio que induz à dormência, em decorrência de se acumular nas gemas dormentes e de diminuir os seus níveis após o tecido haver sido exposto a baixas temperaturas. No entanto, estudos posteriores demonstraram que o conteúdo de ABA nas gemas nem sempre possui correlação com o grau de dormência. Como foi visto no caso das sementes dormentes, essa aparente discrepância poderia refletir as interações entre o ABA e outro
20 hormônios como parte do processo no qual a gema dormente e o crescimento são regulados pelo balanço entre inibidores de crescimento, como o ABA, e substâncias que induzem o crescimento, como as citocininas e as giberelinas. Embora muitos progressos tenham sido alcançados na elucidação do papel do ABA na dormência das sementes, utilizando mutantes ABA-deficientes, o avanço no conhecimento do papel do ABA na dormência das gemas, o qual se aplica principalmente para gemas de lenhosas perenes, encontrase em atraso pela inexistência de um sistema genético adequado. Tal discrepância ilustra a extraordinária contribuição que a genética e a biologia molecular têm oferecido à fisiologia vegetal, indicando a necessidade de se estenderem essas abordagens para as espécies lenhosas. As análises de tais características, como a dormência, são dificultadas pelo fato de que elas são freqüentemente controladas por ações combinadas de vários genes, resultando em uma variação gradual de fenótipos referidos como caracteres quantitativos. Recentes pesquisas de mapas genéticos sugerem que homólogos de ABI1 podem regular a dormência de gemas em árvores de álama. 6.12- O ABA INIBE A PRODUÇÃO DE ENZIMAS INDUZIDAS PELO GA O ABA inibe a síntese de enzimas hidrolíticas que são fundamentais para a quebra das re-servas armazenadas nas sementes. Por exemplo, o GA estimula a camada de aleurona dos grãos de cereais a produzir α-amilase e outras enzimas hidrolíticas, que degradam as reservas do endosperma durante a germinação. O ABA inibe a síntese dessas enzimas dependentes do GA, pela inibição da transcrição do mrna da α-amilase. O ABA exerce seu efeito inibitório por pelo menos dois mecanismos: 1 A VP1, uma proteína originalmente identificada como um ativador da expressão do gene induzido pelo ABA, age como um repressor transcricional de alguns genes regulados pelo GA. 2 O ABA reprime a expressão do GA-MYB induzido pelo GA. O GA-MYB é um fator de transcrição que regula a expressão da α-amilase induzida pelo GA. 6.13- O ABA FECHA OS ESTÔMATOS EM RESPOSTA AO ESTRESSE HÍDRICO O esclarecimento do papel do ABA nas respostas ao estresse hídrico, ao frio e à salinidade levou à sua caracterização como um hormônio do estresse. A concentração do ABA nas folhas pode aumentar até 50 vezes sob condições de seca a alteração de concentração mais severa descrita por um hormônio em resposta a um sinal ambiental. A distribuição ou a biossíntese do ABA é muito
21 eficaz no fechamento estomático e seu acúmulo em folhas estressadas exerce um importante papel na redução da perda de água, pela transpiração, sob condições de estresse hídrico. (Figura 7). FIGURA 7. Comparação do crescimento das partes aéreas (A) e das raízes (B) de plantas normais de milho em comparação com mutantes ABA-deficientes (viviparos) crescidas em vermiculita e mantidas em alto potencial hídrico (-0,03 MPa) ou em baixo potencial hídrico (-0,3 MPa em A e 1,6 MPa em B). O estresse hídrico (baixo potencial hídrico) diminui o crescimento tanto das raízes quanto das partes aéreas comparado com os controles. (C) Observe que sob estresse hídrico (baixo Ψw), a taxa de crescimento da raiz, comparada com a da parte aérea, é muito maior quando o ABA está presente (no tipo selvagem) do que quando ela está ausente (no mutante). Fonte: Taiz & Zeiger (2004). O fechamento estomático pode também ser causado pelo transporte do ABA sintetizado nas raízes para a parte aérea. Os mutantes que perderam a capacidade para produzir o ABA exibem uma murcha permanente e são chamados de mutantes wilty, devido à sua incapacidade de fechar os estômatos. A aplicação exógena do ABA nesses mutantes leva ao fecha-mento estomático e à restauração da pressão de turgor.
22 6.14- EM BAIXOS POTENCIAIS HÍDRICOS, O ABA PROMOVE O CRESCIMENTO DAS RAÍZES E INIBE O CRESCIMENTO DA PARTE AÉREA O ABA apresenta diferentes efeitos no crescimento das raízes e da parte aérea. Tais efeitos são profundamente dependentes da condição de água da planta. A Figura 8 compara o crescimento o crescimento das raízes e da parte aérea em plântulas de milho crescidas sob condições abundantes de água (alto potencial hídrico) ou sob condições de desidratação (baixo potencial hídrico). Foram utilizados dos tipos de plântulas: (1) plântulas tipo selvagem com níveis normais de ABA e (2) um mutante vivíparo, ABA-deficiente. FIGURA 8. Alterações no potencial hídrico, na resistência estomática (o inverso da condutância estomática) e no conteúdo de ABA em milho, em resposta ao estresse hídrico. á medida que o solo perde água, o potencial hídrico das folhas decresce e aumenta tanto o conteúdo de ABA quanto à resistência estomática. O processo foi revertido pela rega. Fonte: Taiz & Zeiger (2004). Quando o suprimento de água é abundante (alto potencial hídrico), o crescimento da parte aérea é maior na plantas tipo selvagem (com níveis endógenos normais de ABA) do que no mutante ABA-deficiente. O crescimento reduzido da parte aérea no mutante ABA-deficiente poderia ser decorrente, em parte, da perda excessiva de água pelas folhas. Entretanto, em plantas de milho e tomate, o crescimento atrofiado (reduzido) da parte aérea em altos potenciais hídricos das plantas ABA-deficientes parece ser devido à superprodução de etileno, o qual é normalmente inibido pelo
23 ABA endógeno. Essa descoberta sugere que o ABA endógeno promove o crescimento da parte aérea em plantas bem hidratadas por inibir a produção de etileno. Quando a água é limitante (baixo potencial hídrico), ocorre o oposto: o crescimento da parte aérea é maior no mutante ABA-deficiente do que no tipo selvagem. Assim, o ABA endógeno age como um sinal para reduzir o crescimento da parte aérea somente sob condições de estresse hídrico. Agora será examinado de que forma o ABA afeta as raízes. Quando a água é abundante, o crescimento da raiz é levemente maior no tipo selvagem (níveis endógenos normais de ABA) do que no mutante ABA-deficiente, resultado semelhante ao crescimento observado para a parte aérea. Isso mostra que os níveis endógeno de ABA exercem um leve efeito positivo tanto no crescimento das raízes quanto no crescimento das partes aéreas. Entretanto, sob condições de desidratação, o crescimento das raízes é muito superior no tipo selvagem que no mutante ABA-deficiente, embora, o crescimento esteja ainda inibido em relação ao crescimento da raiz de ambos genótipos quando a água é abundante. No caso, o ABA endógeno promove o crescimento da raiz aparentemente por inibir a produção de etileno durante o estresse hídrico. Resumindo, sob condições de desidratação, quando os níveis de ABA são altos, o hormônio endógeno exerce um forte efeito positivo no crescimento das raízes por suprimir a produção de etileno e um leve efeito negativo no crescimento da parte aérea. O efeito geral é um aumento marcante na razão raiz: parte aérea em baixos potenciais de água (ver Figura 6), o qual, juntamente com o efeito do ABA no fechamento dos estômatos, auxilia a planta a enfrentar o estresse hídrico. 6.15- O ABA PROMOVE A SENESCÊNCIA FOLIAR INDEPENDENTEMENTE DO ETILENO O ácido abscísico foi isolado originalmente como um fator causador de abscisão. Entretanto, temse tornado evidente que o ABA estimula a abscisão de órgãos em apenas poucas espécies e que o principal hormônio causador da abscisão, é o etileno. Por outro lado, o ABA está claramente envolvido na senescência foliar, considerando-se que essa promoção da senescência deva-se indiretamente ao aumento da síntese de etileno que estimula a abscisão. A senescência foliar tem sido extensivamente estudada, sendo que durante o processo ocorrem mudanças anatômicas, fisiológicas e bioquímicas. Segmentos de folhas senescem mais rapidamente no escuro que na luz, e torna-se amarelados como resultado da degradação da clorofila. Além disso, a degradação de proteínas e ácidos nucléicos é aumentada devido à ativação de várias hidrolases. O ABA acelera intensamente a senescência tanto dos segmentos foliares quanto das folhas ligadas à planta. Por exemplo, apesar do teor de ABA ser maior em folhas jovens, estas podem conter também concentrações mais elevadas de substâncias inibitórias da senescência.
24 7- MECANISMO DE ABERTURA E FECHAMENTO ESTOMÁTICO 7.1- O ABA AUMENTA O CÁLCIO DO CITOSOL, ELEVA O PH CITOSÓLICO E DESPOLARIZA AS MEMBRANAS O fechamento estomático é induzido pela redução da pressão de turgor, causada pelo massivo efluxo (saída) de K + e ânions da célula. Durante a diminuição da célula, decorrente da perda de água, a área superficial da membrana pode contrair até 50%. Para onde vai a sobra da membrana? A resposta parece ser que elas são retiradas por endocitose como pequenas vesículas um processo que também envolve a reorganização do citoesqueleto de actina. Entretanto, a primeira alteração detectável após a exposição das células-guarde ao ABA é a despolarização transitória da membrana causada pelo influxo (entrada) de cargas positivas e o aumento transitório da concentração de cálcio citosólico (Figura 9). FIGURA 9. Medidas simultâneas do aumento interno das correntes positivas e das concentrações de cálcio citosólico pelo ABA nas células-guarda de Vicia faba (fava). A corrente foi medida pela técnica patch clamp; o cálcio foi medido com o uso de um corante indicador fluorescente. O ABA foi adicionado ao sistema no ponto indicado pela seta, em cada caso. Fonte: Taiz & Zeiger (2004). O ABA estimula o aumento da concentração de Ca +2 citosólico pela indução tanto do influxo através de canais da membrana plasmática, quanto da liberação do Ca +2 do interior do citosol a partir de compartimentos internos, como o vacúolo central. O estímulo do influxo ocorre via uma
25 rota que utiliza as espécies reativas de oxigênio (ERO), como o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) ou o superóxido (O.- 2 ) como mensageiros secundários que levam a ativação de canais da membrana plasmática. A liberação do cálcio a partir das reservas intracelulares pode ser induzida por vários mensageiros secundários, incluindo o inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3 ), o ADP-ribose cíclico (ADPRc), bem como o próprio aumento (induzido pelo cálcio) da liberação do Ca 2+. Estudos recentes têm demonstrado que o ABA estimula a síntese de óxido nítrico (ON) nas células-guarda, o qual induz o fechamento estomático de forma dependente do ADPRc, indicando que o ON é um mensageiro secundário inicial dessa via de resposta. A combinação do influxo do cálcio e a liberação do cálcio das reservas internas, elevam as concentrações citosólicas de 50 para 350 nm, podendo chegar a 1.100 nm (1,1,mM) (Figura 11.A). Esse aumento é suficiente para causar o fechamento estomático, como é demonstrado pelo experimento que segue: O cálcio foi microinjetado nas células-guarda em uma forma aprisionada, que poderia ser hidrolisada por um pulso de luz UV. Este método permite aos pesquisadores controlar tanto a concentração de cálcio livre quanto o tempo para a liberação no citosol. Nas concentrações citosólicas de 600 nm ou maiores, o cálcio liberado do aprisionador desencadeia o fechamento estomático. Tal nível de cálcio intracelular corresponde às concentrações observadas após o tratamento com ABA. Em estudos prévios, o cálcio livre intracelular foi medido pela microinjeção do corante fluorescente cálcio-sensível, como o fura-2 ou indol-1. Entretanto, as microinjeções do corante fluorescente em uma única célula são difíceis e freqüentemente resultam na morte celular.
26 Figura 10. Aumento das concentrações do cálcio citosólico induzido pelo ABA nas células-guarda (parte superior do gráfico) e da abertura estomática induzida pelo ABA (parte inferior do gráfico) ao longo do tempo. Fonte: Taiz & Zeiger (2004). Figura 11. Oscilação do cálcio induzido pelo ABA em células-guarda de Arabidopsis expressando yellow cameleon, um corante protéico indicador de cálcio. (A) As oscilações eliciadas pelo ABA são indicadas por um aumento da razão de emissão de fluorescência e 335 e 480 nm. (B) Imagens de fluorescência pseudocoloridas de células-guarda de Arabidopsis. Azul, verde, amarelo e
27 vermelho representam o aumento na concentração do cálcio citosólico. Fonte: Taiz & Zeiger (2004). Por outro lado, plantas transgênicas expressando o gene para a proteína indicadora de cálcio yellow cameleon torna possível monitorar paralelamente várias células fluorescentes, sem a necessidade de injeções invasivas. Estes estudos têm demonstrado que a concentração do Ca +2 citosólico varia com periodicidades distintas, dependendo dos sinais recebidos (Figura 11.B). Os resultados apresentados sustentam a hipótese de que um aumento no cálcio citosólico, parcialmente obtido das reservas intracelulares, é o responsável pelo fechamento estomático induzido pelo ABA. Entretanto, o hormônio de crescimento auxina pode induzir a abertura estomática, tal como o ABA induz o fechamento, acompanhado pelo aumento do Ca +2 citosólico. Essa descoberta sugere que as características detalhadas da localização e da periodicidade da oscilação do Ca +2, mais do que a concentração total do cálcio citosólico, é o que determina a resposta celular. Além do aumento da concentração do cálcio citosólico, o ABA promove a alcalinização do citosol de cerca de ph 7,67 para ph 7,94. Tem sido demonstrado que o aumento do ph citosólico ativa os canis de membrana para o efluxo de K +, aparentemente pelo aumento do número de canais disponíveis para ativação. 7.2- A ATIVAÇÃO PELO ABA DE CANAIS ANIÔNICOS TIPO SLOW CAUSA UMA DESPOLARIZAÇÃO DE LONGA DURAÇÃO DA MEMBRANA A rápida e temporária despolarização induzida pelo ABA é insuficiente para abrir os canis de efluxo do K +, os quais necessitam de uma despolarização da membrana de longa duração para abrir. Entretanto, tem sido demonstrado que o ácido abscísico induz despolarizações de longa duração. De acordo com o modelo mais amplamente aceito, a despolarização de longa duração da membrana é desencadeada por dois fatores: (1) uma despolarização transiente (passageira) da membrana plasmática induzida pelo ABA, associada com (2) um aumento do cálcio citosólico. Ambas as condições são necessárias para abrir os canais aniônicos tipo slow (tipo-s) da membrana plasmática ativados pelo cálcio. Tem sido indicado que o ABA ativa canais aniônicos tipo slow nas células-guarda. A abertura prolongada desses canais de ânions tipo slow permite que grandes quantidades de Cl - e íons malato -2 saiam da célula, movendo-se ao longo de seu gradiente eletroquímico. (O lado interno da célula é carregado negativamente, assim, empurra o Cl - e o mala-to -2 para fora da célula, e o lado externo possui menores concentrações de Cl - e malato -2 do que o interior). O fluxo para o
28 exterior dos íons Cl - e malato -2 carregados negativamente gera uma forte despolarização da membrana, desencadeando a abertura dos canais voltagem-de-pendentes de efluxo do K +. Em apoio a este modelo, o inibidores que bloqueiam os canais tipo slow, como o ácido 5- nitro-2,3-fenilpropilaminobenzóico (NPPB), também bloqueia o fechamento estomático induzido pelo ABA. Inibidores dos canais de ânions tipo rapid (tipo-r), como o ácido 4,4 - diisotiocianatostilbeno-2,2 -dissulfônico (DIDS), não apresentam efeito no fechamento estomático induzido pelo ABA. Um outro fator que pode contribuir para a despolarização da membrana é a inibição da H + - ATPase da membrana plasmática. O ABA inibe a ativação das bombas de prótons promovida pela luz azul, nos protoplastos das células guarda (Figura 12), coerente com o modelo de que a despolarização da membrana plasmática pelo ABA é em parte causada por uma diminuição na atividade da H + -ATPase da membrana plasmática. Entretanto, o ABA não inibe diretamente a bomba de prótons. Figura 12. Inibição pelo ABA da bombas de prótons de protoplastos de células-guarda estimuladas pela luz. Os protoplastos de células-guarda, em suspensão, foram incubados sob luz vermelha, sendo o ph do meio de suspensão monitorado com um eletrodo de ph. O ph inicial foi o mesmo em todos os casos (as curvas estão deslocadas para facilitar a visualização). Fonte:Taiz & Zeiger (2004). Especialmente em Vicia faba (fava), a H + -ATPase da membrana plasmática das folhas é fortemente inibida pelo cálcio. Uma concentração de cálcio de 0,3 μm bloqueia 50% da atividade
29 da H + -ATPase e 1 μm de cálcio bloqueia completamente esta enzima. Aparente-mente, esses dois fatores contribuem para a inibição da bomba de prótons da membrana plasmática pelo ABA: um aumento na concentração citosólica do cálcio e a alcalinização do citosol. Além de provocar o fechamento estomático, o ABA inibe a abertura estomática induzida pela luz. Neste caso, o ABA age pela inibição dos canais de influxo do K +, abertos quando a membrana é hiperpolarizada pela bomba de prótons. A inibição dos canais de influxo de K + é mediado pelo aumento da concentração do cálcio citosólico induzido pelo ABA. Assim, o cálcio e o ph afetam os canais das células-guarda de duas maneiras: 1 Eles inibem a abertura estomática pela inibição dos canais de influxo do K + e das bombas de prótons da membrana plasmática. 2 Eles promovem o fechamento estomático pela ativação dos canais que direcionam os ânions para fora, levando assim, a ativação dos canais de efluxo do K +. 7.3- A SINALIZAÇÃO DO ABA NAS ROTAS INDEPENDENTES DE CA +2 Embora um aumento na concentração citosólica do cálcio induzido por ABA seja uma característica-chave no modelo atual para o fechamento da células-guarda induzido por ABA, o ABA é capaz de induzir o fechamento estomático mesmo em células-guarda que não apresentam aumento do cálcio citosólico. Em outra palavras, o ABA parece ser capaz de atuar por meio de uma ou mais vias independentes do cálcio. Além do cálcio, o ABA pode utilizar o ph citosólico com um sinalizador intermediário. Conforme discutido anteriormente, uma elevação no ph citosólico pode levar à ativação dos canais de efluxo de K + e um efeito na mutação abi1 é conferir a esses canais de K + a in-sensibilidade ao ph. Tal redundância nas vias de transdução de sinal explica como as células-guarda são capazes de integrar uma grande variedade de estímulos hormonais e ambientais que afetam a abertura estomática e essa redundância provavelmente não é específica das células-guarda. Um modelo simplificado para a ação do ABA nas células-guarda dos estômatos é apresentado na (Figura 13). Para facilitar a compreensão, somente os receptores da superfície celular são apresentados.
30 Figura 13. Modelos simplificado da sinalização do ABA nas células guarda do estômato. O efeito resultante é a perda do potássio e de seu ânion (Cl- ou malato-2) da célula (R= receptor, ERRO= espécie reativas de osigênio; ADPRc= ADPR-ribose cíclico; Proteína G= proteína que se liga ao GTP; PLC= fosfolipase C.). Fonte: Taiz & Zeiger (2004).
31 Figura 14. Representação esquemática do modo de ação do ácido abscísico em células-guardas, evidenciando o envolvimento do Ca +2, do inositol 1,4,5-trifosfato(IP 3 ) e da adenosina difosfato ribose cíclica(cadr) como mensageiros secundários. (1) O ABA se liga ao receptor e ativa canais de efluxo de K + ; (2) a ligação do ABA-receptor estimula o aumento de Ca +2 no citossol através do influxo ou da liberação desse cátion do estoque intracelular, com a participação do IP 3 e cadr; (3) o aumento na concentração de cálcio no citossol ativa canais de efluxo de K + e bloqueia aqueles de influxo, ocorrendo pré-despolarização da membrana; (4) o Ca +2 promove a despolarização da membrana, ocorrendo a liberação de ânions e cátions do vacúolo e manutenção da atividade dos canais de efluxo de K +. Fonte: Kerbauy (2004). 8- PROTEÇÃO CONTRA INJÚRIAS Ferimentos causados por herbívoros ou injuria mecânica causam danos ao revestimento externo de proteção da planta, causando entradas para inúmeros patógenos, em respostas aos ferimentos causados vai mudar a expressão gênica que vai sintetizar uns grupos de proteínas envolvidas na cicatrização e prevenção na entrada de patógenos. Vários estudos indicam o envolvimento do ABA na indução dessas proteínas. 9- APLICAÇÕES PRÁTICAS DO ABA As aplicações do ABA parecem limitadas, até o momento, apesar do direcionamento de várias pesquisas. O ABA, por apresentar rápido metabolismo e fotodestruição, tem sua utilização como produto comercial ainda limitada. Como várias características da molécula do ABA são essências à sua atividade biológica, as possibilidades de produzir análogos ativos são reduzidas. Em contrapartida foram obtidas substancias análogas ao ABA (figura.11.8 kerbauy), onde possui vida