PROTEÍNAS TOTAIS Instruções de Uso Ref.:99 MS 10009010080 Finalidade. Sistema para a determinação colorimétrica das Proteínas Totais em amostras de sangue e líquidos pleural, sinovial e ascítico por reação de ponto final. Uso profissional. [Somente para uso diagnóstico in vitro.] +2 Princípio. Os íons cobre (Cu ) em meio alcalino (Reagente de Biureto) reagem com as ligações peptídicas das proteínas séricas formando cor púrpura, que tem absorbância máxima em 545 nm, proporcional à concentração das proteínas na amostra. Características do sistema. O sistema Proteínas Totais da Labtest é um método direto e rápido que tem elevada sensibilidade, associada com a especificidade da reação de biureto que é uma das reações mais simples e exatas para determinação das proteínas em líquidos biológicos. O reagente possui excelente estabilidade e resposta semelhante para todas as proteínas do soro. Concentrações moderadas de bilirrubina e hemoglobina presentes na amostra não provocam erros significativos. As concentrações de triglicérides maiores que 500 mg/dl produzem interferências positivas que podem ser minimizadas utilizando branco de amostra ou aplicando fotometria de leitura bicromática com filtro primário em 545 nm e filtro secundário em 700 nm. O sistema é facilmente aplicável em analisadores semi-automáticos e automáticos capazes de medir com exatidão a absorbância entre 530 e 550 nm. Metodologia. Biureto. Reagentes 1. Reagente - Biureto - Armazenar entre 15-30 ºC. Reagente pronto para uso. Contém hidróxido de sódio 600 mmol/l, sulfato de cobre 12 mmol/l, estabilizador e antioxidante. Manusear com cuidado. Reagente corrosivo. Não pipetar com a boca. 2. Padrão - 4,0 g/dl - Armazenar entre 15-30 ºC. Armazenar bem vedado para evitar evaporação. Contém albumina bovina 4 g/dl e azida sódica 14,6 mmol/l. Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. Precauções e cuidados especiais Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação dos reagentes que não devem ser pipetados com a boca. O Reagente Biureto contém hidróxido de sódio que é corrosivo e pode produzir queimaduras. No caso de contato com os olhos deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. Em caso de ingestão oferecer grande quantidade de água com suco de limão ou vinagre. Não provocar vômitos. Procurar auxílio médico. Devem-se utilizar os equipamentos de proteção adequados para manipular reagentes corrosivos. O Padrão contém azida sódica, que é tóxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato com os olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar o reagente. Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas e manuseados de acordo com as boas práticas de laboratório, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. Materiais necessários e não fornecidos 1. Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre 530 e 550 nm e opcionalmente entre 700 e 800 nm. 2. Analisador automático capaz de processar 1 reagente (para aplicações automáticas). 3. Pipetas para medir amostras e reagentes (aplicações manuais). 4. Cronômetro (para aplicações manuais). Influências pré-analíticas. Em amostras colhidas durante a manhã, as concentrações das proteínas são 3% maiores que em amostras colhidas no período da tarde. A mudança da posição em pé para a posição deitada, provoca uma passagem de líquido do espaço extravascular para os espaços intravasculares, que pode reduzir as concentrações relativas das proteínas e dos analitos ligados às proteínas em até 10%. No período de gestação, devido ao aumento do líquido intravascular, a proteína total diminui significativamente podendo apresentar reduções de até 14%. Quando o torniquete é mantido por mais de 3 minutos durante a colheita da amostra, ocorre um aumento de até 5% no valor da proteína total no sangue. Exercícios físicos aumentam as concentrações das proteínas. 01 Português - Ref.: 99
Soros fortemente hemolisados ou contendo expansores de plasma (Dextran, PVP e Hemacel) nas amostras leva a obtenção de resultados falsamente elevados. Amostra Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) que estabeleça procedimentos adequados para coleta, preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimento analítico. Usar soro e líquidos (pleural, sinovial e ascítico). As proteínas são estáveis 3 dias entre 2-8ºCe7dias a 10 ºC negativos. A metodologia não é adequada para a dosagem das proteínas na urina ou no líquor. Para estas amostras deve ser utilizada a metodologia proposta 5 6 por Meulemans e Pennock, ou utilizar o produto Sensiprot Labtest, (Ref. 36). Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las devem-se seguir as normas estabelecidas para biossegurança. Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Interferências As concentrações de bilirrubina até 32 mg/dl, hemoglobina até 130 mg/dl e triglicérides até 500 mg/dl não produzem interferências significativas. Concentrações de triglicérides entre 500 mg/dl e 1100 mg/dl produzem interferências positivas que podem ser minimizadas utilizando o Branco da Amostra ou fotometria de leitura bicromática com filtro primário em 545 nm e filtro secundário em 700 nm. Concentrações de hemoglobina maiores que 130 mg/dl produzem interferências positivas que não podem ser minimizadas utilizando o Branco da Amostra. Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em uma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo: Diluir 0,05 ml da amostra em 2,0 ml de NaCl 150 mmol/l (0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando o zero com água deionizada ou destilada. Hemoglobina (mg/dl) Absorbância x 601 405 Hemoglobina (mg/dl) Absorbância x 467 415 Minimização da ação de interferentes. Branco da Amostra: Misturar 1,0 ml de NaCl 150 mmol/l (0,85%) com 0,02 ml da amostra. Medir a absorbância em 545 nm, acertando o zero com água destilada ou deionizada. Subtrair a absorbância assim obtida da absorbância do teste e calcular a concentração. Este sistema de correção só pode ser aplicado nos casos em que a amostra produz uma interferência fotométrica como ocorre nas amostras lipêmicas ou com concentração de bilirrubina maior que 32 mg/dl. Procedimento Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir: Amostra Padrão (n 2) Água destilada ou deionizada Reagente Biureto Misturar e incubar a 37 ºC durante 10 minutos. Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 545 nm (530 a 550), acertando o zero com o branco. A cor é estável durante 1 hora. O procedimento sugerido para a medição é adequado para fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual ou menor que 1,0 ml. Deve ser feita uma verificação da necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado. Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste. O procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes da amostra menores que 0,01 ml são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a imprecisão da medição. Cálculos. Ver linearidade. Proteínas Totais = Exemplo Absorbância do teste = 0,405 Absorbância do padrão = 0,238 Proteínas Totais = Absorbância do teste Absorbância do padrão 0,405 0,238 x 4 g/dl = 6,80 g/dl x (4 g/dl) Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator para calcular as concentrações das amostras com absorbância dentro do intervalo de linearidade. Fator de calibração = Branco 0,02 ml 4 g/dl Teste 0,02 ml Absorbância do padrão Proteínas Totais = Absorbância do teste x Fator (g/dl) Padrão 0,02 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 02 Português - Ref.: 99
Exemplo Adultos: 6,0 a 8,0 g/dl Fator = 4 g/dl 0,238 = 16,80 g/dl Conversão: Unidades Convencionais (g/dl) x 10 = Unidades SI (g/l). Características do desempenho 10 Proteínas Totais = 0,405 x 16,80 g/dl = 6,80 g/dl Calibração. A concentração de proteínas no Padrão (No. 2) e nos calibradores da serie Calibra é rastreável ao Standard Reference Material (SRM) 927 do National Institute of Standards and Technology (NIST). Calibrações manuais Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentes ou quando o controle interno da qualidade indicar. Sistemas automáticos Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio 150 mmol/l (0,85%); Usar os calibradores da linha Calibra Labtest. Intervalo de calibrações Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote; Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle interno da qualidade indicar. Linearidade O resultado da medição é linear entre 1,0 e 14,0 g/dl. Para valores maiores diluir a amostra com NaCI 150 mmol/l (0,85%) e repetir a medição. Multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situe entre 4,0 e 8,0 g/dl. Sugerimos a verificação da linearidade metodológica e fotométrica, no mínimo semestralmente, utilizando amostras com valores até 14,0 g/dl. Controle interno da qualidade. O laboratório deve manter um programa de controle interno da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios para especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para avaliar a imprecisão e desvios da calibração. Sugere-se que as especificações para o coeficiente de variação e o erro total sejam 8,9 baseadas nos componentes da variação biológica (VB). Intervalo de referência. Os intervalos devem ser usados apenas como orientação. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, na população atendida, seus próprios intervalos de referência. Idade Prematuro Recém-nascido a termo 7 dias a 1 ano 1 a 2 anos Acima de 3 anos Crianças e Adolescentes 1 g/dl 3,6 a 6,0 4,6 a 7,0 4,4 a 7,6 5,6 a 7,5 6,0 a 8,0 Exatidão. Em duas amostras com concentração de Proteína igual a 6,3 g/dl foram adicionadas quantidades diferentes do analito, obtendose recuperações entre 99,4 e 99,6%. O erro sistemático proporcional médio obtido em um valor de 6,0 g/dl é igual a 0,03 g/dl ou 0,5%. Estudos de comparação de métodos. O método Proteínas Totais Labtest foi comparado com outro método utilizando tecnologia similar, sendo obtidos os seguintes resultados: Número de amostras Intervalo de concentração (g/dl) Média das estimativas (g/dl) Equação da regressão Coeficiente de correlação Erro sistemático médio (g/dl) O erro sistemático médio é igual a 1,75% no nível de decisão 6,0 g/dl e 0,44% no nível de decisão 8,0 g/dl. Os erros são menores que o erro sistemático analítico da especificação baseada na variação biológica que é 1,8%. Confirma-se a hipótese nula de que as diferenças entre o método Proteínas Totais Labtest e o método comparativo não se desviam em mais que o desvio provocado pelas imprecisões inerentes, caracterizando a identidade ou relação funcional entre os métodos. O erro total (erro aleatório + erro sistemático) estimado em um nível de decisão igual a 6,0 g/dl, é igual a 0,11 g/dl ou 3,55%. O método Labtest é substancialmente equivalente ao método comparativo. O coeficiente de correlação (0,999) confirma a força da relação entre os métodos. Repetitividade - imprecisão intraensaio Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 N N Método Comparativo 2,53-12,45 Média 4,68 6,40 8, Reprodutibilidade - imprecisão total 7,72 7,77 Método Labtest = 0,965x Comparativo + 0,315 g/dl 0,999 0,05 Média 4,68 6,40 8, DP 0,03 0,04 0,05 DP 0,05 0,07 0,06 Proteínas Totais Labtest 2,68-12,35 CV (%) 0,64 0,63 0,61 CV (%) 1,07 1,09 0,73 03 Português - Ref.: 99
Sensibilidade metodológica. Utilizando-se a absorbância do padrão como parâmetro, o limite de detecção fotométrica é 0,0168 g/dl, correspondendo a uma absorbância igual a 0,001. Efeitos da diluição da matriz. Duas amostras com valores iguais a 12,3 e 15,1 g/dl foram utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl 150 mmol/l. Usando um fator de diluição igual a 2, foram encontradas recuperações entre 100,5% e 101,3%. Os erros sistemáticos encontrados são significativamente menores que o bias analítico da especificação baseada nos componentes da variação biológica. Significado clínico. A dosagem isolada da proteína total tem pouco valor, porque a alteração em uma das frações pode ser compensada por alteração oposta de outra fração, como ocorre nas doenças crônicas em que há diminuição de albumina com aumento de gamaglobulina. Ocorrência similar pode ser observada em respostas de fase aguda, tais como infecções ou traumas, ocasião em que muitas proteínas plasmáticas produzidas no fígado aumentam sua concentração, enquanto a albumina se reduz, mantendo a concentração protéica total praticamente inalterada. As proteínas estão aumentadas em algumas neoplasias, especialmente em mieloma múltiplo; na macroglobulinemia; doenças autoimunes, como artrite reumatóide e lupus eritematoso sistêmico; doenças granulomatosas como a sarcoidose, leishmaniose visceral; endocardite bacteriana sub-aguda e linfogranuloma; em alguns casos de doença hepática crônica, como hepatite autoimune e na desidratação. As proteínas estão diminuídas na gravidez; hiperhidratação, desnutrição grave, cirrose e outras doenças hepáticas, incluindo alcoolismo crônico; imobilização prolongada; insuficiência cardíaca; nefrose e insuficiência renal; hipertireoidismo; deficiência de cálcio e vitamina D e na síndrome de má absorção. A dosagem de proteína no líquido sinovial tem sensibilidade de 52% e especificidade de 56% nas doenças inflamatórias. A determinação da concentração de proteínas no líquido pleural é de pouco valor, exceto quando combinada com outros parâmetros que permitam fazer a diferença entre exsudato e transudato. Em 15 a % dos indivíduos com hepatopatias acompanhadas de ascite, a concentração de proteína no líquido ascítico é superior a 2,5 g/dl. Nos pacientes com ascite de etiologia neoplásica, as concentrações de proteínas são menores que 2,5 g/dl. Observações 1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. 2. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água deionizada ou destilada utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágue final da vidraria, deve ter resistividade 1 megaohm.cm ou condutividade 1 microsiemens/cm e concentração de silicatos <0,1 mg/l. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre produção de água alcalina com liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. 3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e medicamentosas de interferência nos resultados e na metodologia sugere-se consultar: www.fxol.org/ Referências 1. Burtis CA, Ashwood ER. Textbook of Clinical Chemistry, 4a. edição, Philadelphia: W.B. Saunders, 1986:695-700;2175-2211. 2. Faulkner WR, Meites S. Selected Methods for the Small Clinical Chemistry Laboratory, AACC:Washington,1982;9:317-3. 3. Henry RJ, Cannon DC, Winkelman JW. Clinical Chemistry, Principles and Technics, 2a. Edição. Harper & Row:New York, 1974,405-435. 4. Inmetro - Boas Praticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualitymark eds:rio de Janeiro, 1997. 5. Meulemans O. Clin Chim Acta 1960;5:757. 6. Pennock CA., Passant LP, Bolton FG. J Clin Path 1968;21:518. 7. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27:493-501. 8. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Base de Datos de Variación Biológica. Disponível em:<http://www.seqc.es/article/articleview/330/1/170> (acesso em 04/06). 9. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. Labtest Diagnóstica 05. 10. Labtest: Dados de Arquivo. Apresentação Produto Proteínas Totais Proteínas Totais Labmax 560/400 Referência 99-100 99-250 99-4/18 Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos. Conteúdo 1 X 100 ml 1 X 3 ml 1 X 250 ml 1 X 3 ml 4 X 18 ml 1 X 3 ml O número de testes em aplicações automáticas depende dos parâmetros de programação. 1 1 1 04 Português - Ref.: 99
Informações ao consumidor [Termos e Condições de Garantia] A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto dentro das especificações até a data de expiração indicada nos rótulos desde que os cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidos corretamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: 16.516.296 / 0001-38 Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista Alegre - CEP 33400-000 Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - www.labtest.com.br Serviço de Apoio ao Cliente 0800 031 34 11 (Ligação Gratuita) e-mail: sac@labtest.com.br Revisão: Maio, 14 Ref.: 260117 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reprodução sob prévia autorização 05 Português - Ref.: 99
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