HDL LE. 01 Português - Ref.: 98. Ref.:98 MS Instruções de Uso. Finalidade. Princípio. Metodologia. Reagente

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1 HDL LE Instruções de Uso Ref.:98 MS Finalidade. Sistema para determinação homogênea direta do colesterol HDL em soro e plasma. [Somente para uso diagnóstico in vitro.] Princípio. A seletividade do método está baseada nas tecnologias de aceleração da reação da colesterol oxidase (CO) com o colesterol livre das lipoproteínas não HDL e solubilização seletiva das partículas HDL por ação de um detergente específico. Na primeira fase da reação, o colesterol livre das partículas não HDL é submetido a uma reação enzimática catalisada pela colesterol oxidase (CO) na presença de Acelerador. O peróxido de hidrogênio produzido é consumido por uma reação da peroxidase com disulfobutilmetatoluidina sódica (DSBmT) formando um produto incolor. A segunda reação utiliza um detergente capaz de solubilizar especificamente o colesterol HDL. Com a ação das enzimas colesterol esterase (CE) e colesterol oxidase e acoplamento com 4-aminoantipirina e o cromogênio DSBmT, em reação catalisada pela peroxidase, ocorre o desenvolvimento de coloração proporcional à concentração de colesterol HDL na amostra. HDL, LDL, VLDL e Quilomicrons HDL Colesterol HDL solubilizado Acelerador +CO DSBmT+Peroxidase Detergente seletivo H O + DSBmT + 4-aminoantipirina Características do sistema. Colesterol esterase Colesterol oxidase LDL, Quilomicrons + HDL e VLDL não reagentes Colesterol HDL solubilizado Peroxidase Colestenona + H O Antipirilquinonimina + 4 H O Devido à importância da medição exata do colesterol HDL, é desejável utilizar um método de referência. O método de referência que combina a ultracentrifugação com precipitação química para separar as HDL, dosando o colesterol com o método de Abell-Kendall, é intensivo em tempo e operações e tem 6 aplicação limitada no laboratório clínico. O sistema HDL LE da Labtest Diagnóstica é um método homogêneo líquido para medição direta do colesterol HDL e consiste em um processo simples e bem definido que transmite confiança na exatidão da metodologia. O método possui excelente correlação com o Método 3 Designado de Comparação (MDC) e apresenta características de precisão e exatidão que superam significativamente os requisitos mínimos de desempenho propostos pelo Programa Nacional de Educação em Colesterol (NCEP), em vigor desde 998. A especificidade desejada é conseguida com ação do detergente presente no reagente cujas propriedades solubilizam somente o colesterol HDL. Concentrações de triglicérides até 800 mg/dl, bilirrubina até 60 mg/dl, hemoglobina até 000 mg/dl e ácido ascórbico até 00 mg/dl não interferem significativamente na reação. O sistema de calibração é referenciado ao SRM 95 do National Institute of Standards and Technology (NIST), que lhe garante característica única de rastreabilidade. A flexibilidade do método torna-o facilmente aplicável em analisadores automáticos capazes de processar reação de ponto final com dois reagentes e medição em 600 nm. Metodologia. Reagente. - Acelerador-Detergente Seletivo. Reagente - Armazenar entre - 8 ºC. Contém tampão ph 6,0; colesterol oxidase <000 U/L, peroxidase <300 U/L, DSBmT < mmol/l, acelerador < mmol/l e azida sódica 0,06%.. - Reagente - Armazenar entre - 8 ºC. Contém tampão ph 6,0; colesterol esterase <500 U/L, 4-aminoantipirina < mmol/l, ascorbato oxidase <3000 U/L, detergente <% e azida sódica 0,06% Calibrador - Concentração no rótulo do frasco. Armazenar entre - 8 ºC. Reagente liofilizado. Preparação contendo HDL humano, tampão 50 mm, cloreto de sódio >50 mm e estabilizadores <5%. Os reagentes não abertos quando armazenados nas condições indicadas são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Os Reagentes e, quando mantidos em bandeja refrigerada no equipamento, são estáveis por 4 semanas. Este período de estabilidade pode ser modificado em função das características e condições de manutenção do equipamento. Portanto, sugere-se que o controle da qualidade seja utilizado para monitorar o desempenho dos reagentes. Os reagentes após abertos quando armazenados bem vedados entre e 8 ºC e não submetidos a contaminações química ou microbiana, são estáveis até a data de validade indicada no rótulo. Precauções e cuidados especiais Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação dos reagentes, que não devem ser pipetados com a boca. 0 Português - Ref.: 98

2 O calibrador contém derivados de sangue humano e apresentou resultados negativos para a presença de HBsAg e anticorpos HCV e HIV utilizando testes aprovados. Entretanto, nenhum teste conhecido pode assegurar que produtos derivados de sangue humano não transmitam doenças infecciosas. Portanto, recomenda-se manuseá-lo como sendo potencialmente infectante, seguindo as normas estabelecidas para biossegurança. Os reagentes contêm azida sódica que é tóxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com os olhos deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água para descartar os reagentes. Materiais necessários e não fornecidos Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em 600 nm. Incubador ou banho-maria a 37 ºC. Pipetas para medir amostras e reagentes. Cronômetro. Amostra Usar soro ou plasma (heparina lítio e EDTA). Amostras com citrato ou oxalato não devem ser usadas porque produzem resultados falsamente diminuídos. As amostras de soro ou plasma não devem permanecer entre 5-30 ºC por mais de 4 horas. Quando as medições não são completadas dentro de 4 horas, as amostras podem ser armazenadas entre - 8 ºC por 7 dias e por 30 dias a 0 ºC negativos. Deve-se armazenar em temperaturas 70 ºC negativos quando houver necessidade de preservação por períodos maiores de tempo. Evitar congelamentos e descongelamentos repetidos. Amostras descongeladas devem ser bem misturadas antes da utilização. Não usar vórtex ou similar. Não usar amostras com sinais de contaminação microbiana. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue não trasmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las deve-se seguir as normas estabelecidas para biosegurança. Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Interferências Concentrações de bilirrubina total até 60 mg/dl, hemoglobina até 000 mg/dl, ácido ascórbico até 00 mg/dl, gamaglobulinas até 5000 mg/dl e triglicérides até 800 mg/dl não interferem significativamente na reação. As amostras contendo concentrações dos interferentes maiores que os acima referidos devem ser diluídas em NaCl 50 mmol/l (0,85%) antes de se realizar os ensaios. Multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Preparo do calibrador. Adicionar,0 ml de água, qualidade reagente (ver Observação no. ), ao conteúdo do frasco de calibrador. Deixar em repouso durante 5 minutos. Misturar por inversão suave evitando a formação de espuma. Estável 7 dias entre - 8 ºC e 30 dias a 0 ºC negativos em recipiente hermeticamente fechado para evitar evaporação do solvente. Para evitar congelamentos e descongelamentos repetidos, sugerimos separar o calibrador em alíquotas antes de congelar. Após descongelar, homogeneizar bem antes da utilização. Não usar vórtex ou similar. Procedimento Este procedimento não se aplica em analisadores semi-automáticos que utilizam unicamente cubeta de fluxo. Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos e semi-automáticos. Rotular tubos de ensaio e proceder como a seguir: Amostra Calibrador Reagente Misturar e incubar a 37 ºC durante 5 minutos. O nível da água no banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio. Determinar as absorbâncias A do teste e do calibrador em 600 nm, acertando o zero com água deionizada. Reagente Manter a 37 ºC durante 5 minutos. Determinar as absorbâncias A do teste e calibrador em 600 nm, acertando o zero com água deionizada. As absorbâncias são estáveis por 60 minutos. Se o fotômetro utilizado possuir recursos para leitura bicromática, utilizar um filtro primário com emissão em 600 nm e um filtro secundário com emissão entre 660 e 700 nm. Cálculos. Ver linearidade. A primeira leitura da absorbância (A ) deve ser corrigida para o volume final da reação obtendo-se A cor, antes de realizar o cálculo da concentração de HDL. A = A x 0,75 cor Colesterol HDL (mg/dl) = CC: concentração do calibrador Exemplo Teste Teste (A -A ) cor Calibrador (A -A ) cor Calibrador 0,0 ml 0,0 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,5 ml 0,5 ml x CC Os dados foram obtidos com leituras bicromáticas 600/700 nm: Teste: A = 0,004 A cor = 0,003 A = 0,080 Calibrador: A = 0,00 A = 0,005 A = 0,085 cor 0 Português - Ref.: 98

3 Concentração do Calibrador: 45,7 mg/dl 0,080-0,003 Colesterol HDL (mg/dl) = x 45,7 = 4, 0,085-0,005 Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a metodologia, o método do fator pode ser empregado. FATOR = CC Calibrador (A - A ) Colesterol HDL (mg/dl) = Teste (A -A Exemplo 45,7 Fator = = 547 0,085-0,005 ) x Fator Colesterol HDL (mg/dl) = (0,080-0,003) x 547 = 4, Calibração O calibrador é rastreável ao Standard Reference Material (SRM) 95 do National Institute of Standards and Technology (NIST). Calibrações manuais Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentes ou quando o controle da qualidade indicar. Sistemas automáticos Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio 50 mmol/l (0,85%); Padrão: usar o calibrador do produto; Intervalos de calibração; Calibração de pontos ao mudar de lote; Calibração de pontos quando o controle da qualidade indicar. Linearidade cor cor A reação é linear entre,5 e 00 mg/dl. Em casos raros de valores maiores que 00 mg/dl, diluir a amostra com NaCl 50 mmol/l (0,85%), realizar nova determinação e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Valores desejáveis ou recomendados. Os valores a seguir substituem os valores de referência e foram determinados a partir de dados epidemiológicos tratados estatisticamente, que relacionam as concentrações do colesterol com a prevalência de doença coronariana isquêmica (DCI). Adultos.Classificação ATP III - Colesterol Total, LDL e HDL (mg/dl) Colesterol Total Desejável <00 Limiar elevado Elevado 40 Colesterol LDL (mg/dl) Ótimo <00 Limiar ótimo 00-9 Limiar elevado Elevado Muito Elevado 90 Colesterol HDL (mg/dl) Baixo <40 Elevado (Desejável) 60 Crianças e Adolescentes 9 Colesterol Total (mg/dl) Idade: a 9 anos Desejável <70 Limítrofe Elevado 00 Colesterol LDL (mg/dl) Idade: a 9 anos Desejável <0 Limítrofe 0-9 Elevado 30 e interno da qualidade. O laboratório deve manter um programa de controle interno da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios para especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para avaliar a imprecisão e desvios da calibração. Recomenda-se utilizar um sistema de regras de controle para verificar a estabilidade do sistema de 7 medição. Colesterol HDL (mg/dl) <0 anos 0 a 9 anos Desejável Desejável Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linha Qualitrol e Qualitrol H da Labtest para controle interno da qualidade em ensaios de química clínica. 03 Português - Ref.: 98

4 8 Características de desempenho Exatidão. 3 Especificidade. A exatidão do método foi verificada por comparação com o MDC sendo obtidos os seguintes resultados: O erro total (aleatório + sistemático),estimado em um nível de decisão igual a 40 mg/dl, é igual a 4,39 mg/dl ou,0%. Para avaliar a especificidade do método em amostras com triglicérides elevados, foi realizado um estudo utilizando amostras com concentrações de triglicérides maiores que 400 mg/dl (43 a 807 mg/dl), sendo obtidos os seguintes resultados na 6 comparação com o método de referência do CDC : O erro total (aleatório + sistemático), estimado em um nível de decisão igual a 40 mg/dl, é igual a 4,06 mg/dl ou 0,%. Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio Amostra Amostra Amostra 3 Amostra Amostra Amostra 3 N N Método Designado de Comparação (MDC) Média 3,9 50,6 0,4 Reprodutibilidade - Imprecisão total Média 3,8 50,0 00, DP 0,3 0, 0,7 DP 0,4 0,7, HDL LE Número de amostras Intervalo (mg/dl) 5 3,0-33,0 5 33,6-33,0 Média (mg/dl) 56,3 58,3 Equação da regressão HDL LE = 0,99* (MDC)+,8 mg/dl Coeficiente de correlação 0,996 Método Referência (MR) HDL LE Número de amostras Intervalo (mg/dl) 4 6,0-47,0 4 3,7-47,4 Média (mg/dl) 37,9 35,6 Equação da regressão HDL LE =,0* (MR)-,48 mg/dl Coeficiente de correlação 0,968 CV (%) 0,9 0,4 0,7 CV (%),,4, Efeitos da diluição da matriz. Uma amostra com valor igual a 00 mg/dl foi utilizada para avaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl 50 mmol/l (0,85%). Os desvios máximos encontrados em relação à linha de linearidade foram iguais ou menores que 5%. Significado clínico. Existem fortes evidências de que o colesterol é um fator de risco direto para Doença Coronariana Isquêmica (DCI). Estudos retrospectivos e prospectivos demonstram claramente uma interrelação curvilinear entre os níveis do colesterol sérico, mais especificamente o colesterol LDL, e a prevalência de DCI. Em 977 foi demonstrado que o colesterol HDL tem um efeito protetor contra a prevalência da DCI. Os estudos de Framinghan mostraram de modo inequívoco que os níveis do colesterol HDL são inversamente proporcionais à prevalência da DCI. Esta relação inversa é claramente percebida na tabela de valores desejáveis ou recomendados. As concentrações do colesterol nas frações LDL e VLDL e na fração HDL dependem de metabolismos distintos e não se deve fazer qualquer tentativa de buscar correlação entre seus valores de concentração. Observações. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos.. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágüe final da vidraria, a água deve ter resistividade megaohm.cm ou condutividade microsiemens/cm e concentração de silicatos <0, mg/l. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. 3. Vários fatores alteram os resultados obtidos com o calibrador. Dentre estes fatores estão os erros de reconstituição, homogeneização, contaminação da água ou vidraria, controle inadequado da temperatura ou erros técnicos associados ao instrumento. Sugerimos o cumprimento das boas práticas de laboratório e a verificação das instruções do fabricante do instrumento e dos reagentes utilizados, relacionadas com as limitações do procedimento. 4. O valor do calibrador foi estabelecido utilizando o procedimento e o sistema HDL LE (Ref. 98) conforme descrito nas instruções de uso. A exatidão da calibração poderá não ser adequada quando for utilizado reagente de outro fabricante. Sensibilidade metodológica. Utilizando-se a absorbância do calibrador como parâmetro, a sensibilidade fotométrica é 0,57 mg/dl, correspondendo a uma absorbância igual a 0, Português - Ref.: 98

5 Referências. Bachorik PS, Ross JW. Clin Chem 995;4: Executive Summary of the Third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA 00;85: Kimberly MM, Leary ET, Waymack PP. Clin Chem 999;45: Pesce AJ, Kaplan LA. Methods in Clinical Chemistry, St. Louis: The C.V. Mosby Co., 987: Virella MFL, Stone P, Ellis S, Colwell G. Clin Chem 977;3: Warnick RG, Wood PD. Clin Chem 995; 4: Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 98; 7: Labtest: Dados de Arquivo. 9. Leite PF, Martinez TLR, Halpern A, Cendoroglo MS, Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Risco cardiovascular: fatores metabólicos e nutricionais: diagnóstico e tratamento. São Paulo: Loyola, 994. p.56. Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos. O número de testes em aplicações automáticas depende dos parâmetros de programação. Informações ao consumidor [Termos e condições de garantia] A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto dentro das especificações até a data de expiração indicada nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidos corretamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Serviço de Apoio ao Cliente (Ligação Gratuita) sac@labtest.com.br Apresentação Produto HDL LE Referência Conteúdo X 60 ml X 0 ml X,0 ml X 40 ml X 80 ml X,0 ml 3 X 000 ml X 000 ml X,0 ml Revisão: Março, 03 Ref.: 803 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reprodução sob prévia autorização 05 Português - Ref.: 98

6 Símbolos utilizados com produtos diagnósticos in vitro Símbolos usados con productos diagnósticos in vitro Symbols used with ivd devices Conteúdo suficiente para < n > testes Contenido suficiente para < n > tests Contains sufficient for < n > tests Risco biológico Riesgo biológico Biological risk Data limite de utilização (aaaa-mm-dd ou mm/aaaa) Estable hasta (aaaa-mm-dd o mm/aaaa) Use by (yyyy-mm-dd or mm/yyyy) Marca CE Marcado CE CE Mark Calibrator Material Tóxico Tóxico Poison Calibrator Material Reagente Reactivo Reagent Limite de temperatura (conservar a) Temperatura limite (conservar a) Temperature limitation (store at) Fabricado por Elaborado por Manufactured by Representante Autorizado na Comunidade Europeia Representante autorizado en la Comunidad Europea Authorized Representative in the European Community Número do lote Denominación de lote Batch code Consultar instruções de uso Consultar instrucciones de uso Consult instructions for use e Número do catálogo Número de catálogo Catalog Number e negativo negativo Negative control Adições ou alterações significativas Cambios o suplementos significativos Significant additions or changes e positivo positivo Positive control Produto diagnóstico in vitro Dispositivo de diagnóstico in vitro In vitro diagnostic device e Liofilizado Liofilizado Lyophilized Corrosivo Corrosivo Corrosive Período após abertura Período post-abertura Period after-opening Ref.: 0 06 Português - Ref.: 98