2. Reagente Armazenar entre 2-8ºC. 3. Calibrador - - Armazenar entre 2-8ºC.
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- Maria Clara Amorim Brandt
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1 HDL Instruções de Uso Ref.:45 MS Finalidade. Sistema para determinação quantitativa e direta da lipoproteína de alta densidade (HDL) em amostras de soro e plasma (heparina e EDTA). Uso profissional. [Somente para uso diagnóstico in vitro.] Princípio. Na primeira etapa da reação, o poliânion e o composto catiônico interagem eletrostaticamente com a lipoproteína de baixa densidade (LDL), a lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) e os quilomícrons (CM); o que impedirá a reação das partículas não HDL com as enzimas colesterol oxidase (CHOD) e colesterol esterase (CHER). Na segunda etapa, as enzimas CHER e CHOD reagem especificamente com a lipoproteína de alta densidade (HDL) presente na amostra, produzindo peróxido de hidrogênio (H O ) que é detectado pela reação de 2 2 Trinder. A intensidade da cor formada é diretamente proporcional à concentração de colesterol HDL na amostra. Poliânion HDL+(LDL+VLDL+CM) HDL+LDL+VLDL+CM poliânion/composto catiônico Composto catiônico HDL CHOD + CHER Colest-4-en-ona + Ácido graxo + H O 2 2 Peroxidase 2 H O + 4-AA + EMSE Quinoneimina + 5 H O Características do sistema. Devido à importância da medição exata do colesterol HDL, é desejável utilizar um método de referência. O método de referencia que combina a ultracentrifugação com a precipitação química para separar HDL dosando o colesterol com o método de Abell-Kendall é intensivo em tempo e operações e tem aplicação limitada no laboratório clínico. O sistema HDL é um método homogêneo líquido para medição direta do colesterol HDL e consiste em um processo simples, de fácil execução e apresenta características de precisão e exatidão que atendem aos requisitos de desempenho propostos pelo Programa Nacional de Educação em Colesterol (NCEP-EUA), em vigor desde 988. A especificidade é conseguida pela ação seletiva do poliânion juntamente com o composto catiônico presente no Reagente que resulta em inacessibilidade do LDL, VLDL e quilomícrons para as enzimas colesterol oxidase (CHOD) e colesterol esterase (CHER), as quais irão reagir especificamente com o colesterol HDL. Valores de triglicérides até 2000 mg/dl, bilirrubina não conjugada até 50 mg/dl, bilirrubina conjugada até 50 mg/dl, hemoglobina até 500 mg/dl e ácido ascórbico até 50 mg/dl não interferem significativamente na reação. A flexibilidade do método torna-o facilmente aplicável em analisadores automáticos capazes de processar reação de ponto final com dois reagentes e medição em 600 nm. Metodologia. Surfactante seletivo Reagente. Reagente - - Armazenar entre 2-8ºC. Pronto para uso. Contém tampão 62 mm ph 7,8; N-etil-N-(3-metilfenil)- N'-succinil-etilenodiamina (EMSE) 0,53 a 2,3 mmol/l; dextran sulfato,25 g/l; composto catiônico 0,05 g/l e azida sódica <0,%. 2. Reagente Armazenar entre 2-8ºC. Pronto para uso. Contém tampão 20 mm ph 6,7; colesterol oxidase 0,48 a 7,2 U/mL; colesterol esterase 0,4 a 0,54 U/mL; peroxidase 6 a 24 U/mL; 4 aminoantipirina 0,6 a 2,92 mmol/l e azida sódica <0,%. 3. Calibrador - - Armazenar entre 2-8ºC. Reagente liofilizado. Concentração no rótulo do frasco. Contém HDL humano; tampão 50 mm; cloreto de sódio >50 mm e estabilizadores <5%. Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Os Reagentes e 2, quando mantidos em bandeja refrigerada no equipamento são estáveis por 5 semanas. Este período de estabilidade pode ser modificado em função das características e condições de manutenção do equipamento. Portanto, sugere-se que o controle da qualidade seja utilizado para monitorar o desempenho dos reagentes. Após abertos, os reagentes são estáveis até a data de validade indicada no rótulo, mas somente quando armazenados bem vedados em temperatura entre 2-8ºC e não estejam submetidos a contaminações química ou microbiana. Precauções e cuidados especiais Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação dos reagentes, os quais não devem ser pipetados com a boca. 0 Português - Ref.: 45
2 O Calibrador contém derivados de sangue humano e apresentou resultados negativos para a presença de HBsAg e anticorpos HCV e HIV utilizando testes aprovados. Entretanto, nenhum teste conhecido pode assegurar que produtos derivados de sangue humano não transmitam doenças infecciosas. Portanto, recomenda-se manuseá-lo como sendo potencialmente infectante, seguindo as normas estabelecidas para biossegurança. Materiais necessários e não fornecidos. Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre 600 e 700 nm. 2. Incubador ou banho-maria a 37ºC. 3. Pipetas para medir amostras, calibrador, controles e reagentes. 4. Cronômetro. Amostra Usar soro ou plasma (EDTA e heparina lítio). Usar preferencialmente amostra que não foi refrigerada ou congelada. As amostras de soro ou plasma não devem permanecer entre 5-30ºC por mais de 4 horas. Quando não for possível realizar as medições em até 4 horas após a coleta, as amostras podem ser armazenadas entre 2-8ºC por 7 dias e por 30 dias a 20ºC negativos. Quando houver necessidade de preservação por períodos mais longos, as amostras devem ser armazenadas em temperaturas 70ºC negativos. Evitar congelamentos e descongelamentos repetidos. Amostras descongeladas devem ser bem misturadas antes da utilização. Não usar vórtex ou similar. Não usar amostras com sinais de contaminação microbiana. Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) para colheita, preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimento analítico. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las devem-se seguir as normas estabelecidas para biossegurança. Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Interferências Concentrações de bilirrubina não conjugada até 50 mg/dl, bilirrubina conjugada até 50 mg/dl, hemoglobina até 500 mg/dl, ácido ascórbico até 50 mg/dl e triglicérides até 2000 mg/dl não interferem significativamente na reação. Preparo do calibrador. Adicionar,0 ml de água deionizada ou destilada (ver Observação no. 2), ao conteúdo do frasco do Calibrador. Deixar em repouso durante 5 minutos. Misturar por inversão suave evitando a formação de espuma. O calibrador reconstituído é estável 7 dias entre 2-8ºC e 30 dias a 5ºC negativos em recipiente hermeticamente fechado para evitar evaporação do solvente. A fim de evitar congelamentos e descongelamentos repetidos, sugerimos separar o calibrador em alíquotas antes de congelar. Após descongelamento das alíquotas, estas devem ser bem homogeneizadas antes da utilização. Não utilizar vórtex ou similar. Uma vez descongelado, não congelar novamente. Calibração. O Calibrador é rastreável ao método de referência CDC (Centers for Disease Control and Prevention). Intervalos de calibração. Calibração de 2 pontos ao mudar de lote ou quando o controle da qualidade indicar. Parâmetros para sistemas automáticos Parâmetros Tipo de Reação de Onda (primário) de Onda (secundário) Temperatura Calibração Modelo da Calibração Volume de Amostra* Volume de R* Volume de R2* Leitura (A) Adição de R2 Leitura 2 (A2) Aplicação Ponto final 600 nm 700 nm 37ºC 2 pontos Ponto : Branco (água deionizada ou solução de cloreto de sódio 50 mmol/l (0,85%)) Ponto2: Calibrador Ref Linear 4,5 L 20 L 70 L Após 300 segundos de incubação a 37ºC de R + amostra Após 300 segundos decorridos da adição de R + amostra Após 300 segundos de incubação a 37ºC de R + amostra + R2 *Os volumes de amostra e reagentes podem ser modificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimo necessário para a medição fotométrica Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e medicamentos de interferência nos resultados e na metodologia, sugere-se consultar Young, DS. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3ª edição, Washington: AACC Press, Português - Ref.: 45
3 Esquema da reação R: 20 L Amostra: 4,5 L R2: 70 L Colesterol LDL (mg/dl) < Ótimo Limiar ótimo Limiar elevado Muito elevado 0 min 5 min 37ºC 37ºC 0 min Colesterol HDL (mg/dl) <40 60 Baixo (desejável) Cálculos. Ver item Intervalo Operacional A=A2-A A (600/700 nm) A2 (600/700 nm) Classificação ATP III - Crianças e Adolescentes 3 Colesterol Total (mg/dl) - Idade: 2 a 9 anos <70 70 a Limítrofe Concentração de Colesterol HDL na amostra : A amostra - A branco A calibrador - A branco Calibrador X (mg/dl) 4 Características de desempenho. Estudos de comparação de métodos. A exatidão do método foi verificada por comparação com o método similar disponível no mercado, sendo obtidos os seguintes resultados: Intervalo operacional. A reação é linear entre,00 e 50 mg/dl. Para concentrações superiores a 50 mg/dl, diluir a amostra com NaCl 50 mmol/l (0,85%), realizar nova determinação e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Controle interno da qualidade. O laboratório deve manter um programa de controle interno da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios para especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para monitorar a imprecisão da medição e desvios da calibração. Recomenda-se utilizar as preparações estabilizadas da Linha Qualitrol da Labtest para controle interno da qualidade em ensaios de química clínica. Valores desejáveis ou recomendados. Os valores a seguir substituem os valores de referência e foram determinados a partir de dados epidemiológicos tratados estatisticamente, que relacionam as concentrações do colesterol com a prevalência de Doença Coronariana Isquêmica (DCI) Classificação ATP III - Adultos 2 Colesterol Total (mg/dl) < Limiar elevado Colesterol LDL (mg/dl) - Idade: 2 a 9 anos < Colesterol HDL (mg/dl) - Idade: <0 anos 40 Utilizando a equação da regressão, o erro sistemático total (bias) estimado é igual 5,2%, -,4% e -2,% para amostras de 30,9; 65, e 73,6 mg/dl respectivamente. Estudos de precisão. Os estudos de precisão foram realizados utilizando-se três amostras. Número de amostras Equação da regressão Coeficiente de correlação Método Comparativo Limítrofe Colesterol HDL (mg/dl) - Idade: 0 a 9 anos 35 Método Labtest Método Labtest (%) = 0,9274 x Comparativo + 3,8359 0, Português - Ref.: 45
4 Repetitividade - Imprecisão intraensaio Amostra Amostra 2 Amostra 3 Amostra Amostra 2 Amostra 3 N N Média (mg/dl) Reprodutibilidade - Imprecisão total Média (mg/dl) DP CV (%) 03 30,9 0,6 0, , 0,92 0, ,6 0,304 0,4 DP CV (%) 30 30,9 0,245 0, , 0,606 0, ,6 0,548 0,74 A imprecisão encontrada atende a especificação do National Cholesterol Education Program (NCEP) que é 4,0%. O erro total (erro aleatório + erro sistemático) estimado é igual a 6,5%, 2,9% e 3,3% para amostras de 30,9; 65, e 73,6 mg/dl respectivamente. Os resultados indicam que o método atende à especificação do NCEP para erro total ( 2,0%). Sensibilidade metodológica ou analítica. Limite de detecção: 0,36 mg/dl Efeitos da diluição da matriz. Uma amostra com concentração igual 59,3 mg/dl foi utilizada para avaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com solução de NaCl 50 mmol/l (0,85%). Usando fatores de diluição de 2 e 5, foi encontrada uma recuperação média de 98,3%, que corresponde a um erro sistemático médio igual a,7%. Observações. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos. 2. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água deionizada ou destilada utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágüe final da vidraria, a água deve ter resistividade megaohm.cm ou condutividade microsiemens/cm e concentração de silicatos <0, mg/l. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. Referências. Bachorik PS, Ross JW. Clin Chem 995;4: Executive Summary of the Third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA 200;285: Leite PF, Martinez TLR, Halpern A, Cendoroglo MS, Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Risco cardiovascular: fatores metabólicos e nutricionais: diagnóstico e tratamento. São Paulo: Loyola, 994. p Labtest: Dados de Arquivo. Significado clínico. Existem fortes evidências de que o colesterol é um fator de risco direto para Doença Coronariana Isquêmica (DCI). Estudos retrospectivos e prospectivos demonstram claramente uma interrelação curvilinear entre os níveis do colesterol sérico, mais especificamente o colesterol LDL e a prevalência de DCI. O HDL compõe uma das maiores classes de lipoproteínas plasmáticas. Elas são sintetizadas no fígado sob a forma de complexos de apolipoproteínas e fosfolipídeos, e são capazes de se ligar ao colesterol e transportá-lo das artérias para o fígado, onde o colesterol é convertido em bile e excretado para o intestino. Em 977 foi demonstrado que o colesterol HDL tem efeito protetor contra a prevalência da DCI. Os estudos de Framingham mostraram de modo inequívoco que os níveis do colesterol HDL são inversamente proporcionais à prevalência da DCI. Esta relação inversa é claramente percebida na tabela de valores desejáveis ou recomendados. Apresentação Produto HDL HDL Labmax 560/400 Referência 45-/80 45-/ /80 Informações ao consumidor 2 CAL 2 CAL 2 CAL Conteúdo X 60 ml X 20 ml X,0 ml X 60 ml X 20 ml X,0 ml 4 X 60 ml 4 X 20 ml X,0 ml As concentrações do colesterol nas frações LDL e VLDL e na fração HDL dependem de metabolismos distintos e não se deve fazer qualquer tentativa de buscar correlação entre seus valores de concentração. [Termos e Condições de Garantia] A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto dentro das especificações até a data de expiração indicada nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidos corretamente. 04 Português - Ref.: 45
5 Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Serviço de Apoio ao Cliente (Ligação Gratuita) sac@labtest.com.br Edição: Julho, 206 Ref.: 2607 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reprodução sob prévia autorização 05 Português - Ref.: 45
6 06 Português - Ref.: 45
2. Reagente Armazenar entre 2-8 ºC. 3. Calibrador - - Armazenar entre 2-8 ºC.
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