CREATININA ENZIMÁTICA

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1 CREATININA ENZIMÁTICA Instruções de Uso Ref.:17 MS Finalidade. Sistema para a determinação da creatinina em soro, plasma e urina por reação de ponto final. [Somente para uso diagnóstico in vitro.] Princípio. A creatinina presente na amostra é convertida a creatina pela ação da enzima creatinina amidohidrolase. A creatina produzida é hidrolisada a sarcosina e uréia pela ação da enzima creatina amidinohidrolase. Em seguida, a enzima sarcosina oxidase promove a desmetilação oxidativa da sarcosina, levando à produção de glicina, formaldeído e peróxido de hidrogênio. Na presença de peroxidase, o peróxido de hidrogênio formado reage com o N-ethyl-N-sulfopropyl-mtoluidina (ESPMT) e 4-aminoantipirina, produzindo uma quinoneimina que tem máximo de absorbância em 546 nm. A intensidade da cor do produto da reação é diretamente proporcional à concentração de creatinina na amostra. + H O Creatina + H O Características do sistema. amidohidrolase Creatina amidinohidrolase Creatina Sarcosina + Uréia Sarcosina oxidase Sarcosina + H O + O Glicina + Formaldeído + H O Peroxidase H O + ESPMT + 4-aminoantipirina Quinoneimina + 4 H O O sistema Enzimática da Labtest utiliza as enzimas creatinina amidohidrolase, creatina amidinohidrolase e sarcosina oxidase em conjunto com a reação de Trinder, para determinar a concentração de creatinina em amostras de soro, plasma e urina. A metodologia enzimática confere uma maior especificidade à determinação do analito, eliminando a interferência de proteínas plasmáticas e outros cromógenos, comumente observada com 1 os métodos diretos que utilizam a reação de Jaffé. O material calibrador indicado é calibrado com o SRM 914 do National Institute of Standards and Technology (NIST) e torna os resultados rastreáveis ao método definitivo IDMS (diluição isotópica, espectrometria de massa), atendendo as recomendaçãoes do National Kidney Disease Education Program (NKDEP) para padronização da dosagem da creatinina no soro. Metodologia. Reagentes Materiais necessários e não fornecidos Enzimático -Trinder Reagente 1 - Armazenar entre - 8 ºC. Contém tampão ph 7,4, creatina amidinohidrolase 60 UI/mL, sarcosina oxidase 17 UI/mL, ascorbato oxidase 7 UI/mL e N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3 m-toluidina 0,1 mg/ml. Reagente - Armazenar entre - 8 ºC. Contém tampão ph 7,3, creatinina amidohidrolase 670 UI/mL, peroxidase 91 UI/mL, 4 aminoantipirina 0,9mg/mL e azida sódica <0,1%. Os reagentes devem permanecer fora da temperatura de armazenamento somente pelo tempo necessário para se obter o volume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta. Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes e o calibrador estão sujeitos a contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. Precauções e cuidados especiais Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação dos reagentes, os quais não devem ser pipetados com a boca. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com os olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. O Reagente contêm azida sódica que é tóxica. Não ingerir e, no caso de contato com os olhos, lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água para descartar os reagentes. Analisador capaz de medir com exatidão a absorbância em 546 nm (540 a 550 nm). Calibrador da linha Calibra H - Labtest. Pipetas para medir amostras e reagentes. 01 Português - Ref.: 17

2 Amostra Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) para colheita, preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimento analítico. Soro ou plasma (heparina, EDTA, fluoreto, oxalato e citrato). O analito é estável 7 dias entre - 8 ºC. O anticoagulante Glistab - Labtest (Ref. 9) permite a colheita de uma só amostra de sangue para as dosagens de creatinina, glicose e uréia. Parâmetros para realização do teste. Para a dosagem de creatinina na urina, diluir a amostra 1:5 (0,mL de urina + 0,8mL de NaCl 150 mmol/l). Multiplicar o resultado obtido por 5. Parâmetros Tipo de Reação Direção da Reação de Onda primário de Onda secundário Temperatura Aplicação Birreagente Ponto final Crescente 546 nm 800 nm 37 ºC Urina de 4 horas deve ser centrifugada. A amostra de urina não deve receber preservativos ou conservantes e deve ser refrigerada durante o período da colheita e depois de recebida no laboratório. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de material biológico humano não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseálas, devem-se seguir as normas estabelecidas para biossegurança. Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Calibração Modelo da Calibração Volume de Amostra* Volume de R1* Leitura 1 (Absorbância 1) pontos Ponto 0: Branco (NaCl 0,85% ou água deionizada) Ponto 1: Calibra H Linear 6 L 70 L Interferências Concentrações de triglicérides até 1000 mg/dl, bilirrubina (livre e conjugada) até 16 mg/dl, hemoglobina até 400 mg/dl, ácido ascórbico até 40 mg/dl, creatina até 0 mg/dl, cefpiramida até 100 mg/dl, cefotaxima até 100 mg/dl e ceftriaxona até 100 mg/dl não interferem significativamente na reação. Dobutamina e metildopa interferem negativamente na reação. Amostras com bilirrubina, hemoglobina e triglicérides em concentrações maiores que as acima referidas devem ser diluídas em NaCl 150 mmol/l (0,85%) antes de se realizar os ensaios. Multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Amostras que contém azida podem apresentar resultados inexatos para a concentração de creatinina, provocados pela conversão insuficiente de creatina. Para avaliar a concentração aproximada de hemoglobina em uma amostra, proceder do seguinte modo: diluir 0,05 ml da amostra em,0 ml de NaCl 150 mmol/l (0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm, acertando o zero com água deionizada ou destilada. Hemoglobina (mg/dl) Absorbância405 x 601 Hemoglobina (mg/dl) Absorbância x Volume de Reagente * 90 L Leitura (Absorbância ) *Os volumes de amostra e reagentes podem ser modificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste. Em caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimo necessário para a medição fotométrica. Calibração Após 300 segundos de incubação a 37 ºC de R1 + amostra + R Sistema automático Calibração de pontos Ponto 0: Branco de reagentes - água deionizada ou solução de cloreto de sódio 150 mmol/l (0,85%); Ponto 1: Calibrador - usar calibrador da linha Calibra H - Labtest; A concentração de creatinina no Calibra H é rastreável ao Standard Reference Material (SRM) 914 do National Institute of Standards and Technology (NIST). Intervalos de calibração Quando o controle interno da qualidade indicar. Quando utilizar novo lote de reagente; Quando utilizar novos frascos de reagente de um mesmo lote, caso uma nova calibração tenha sido realizada durante a utilização do frasco anterior. 0 Português - Ref.: 17

3 Cálculos. Segundo recomendações do NKDEP os resultados devem ser reportados com duas casas decimais para evitar erros sistemáticos provocados por arredondamentos, que podem chegar a 6%. Abs doteste ou Calibrador = Abs - Abs 1 Abs do Teste (mg/dl) = x Concentração do Calibrador mg/dl Abs do Calibrador urinária urinária (mg/dl) Urinária = x Volume de urina (mg/4 h) 100 (ml/4 h) mg/kg peso = mg/4 horas dividido pelo peso corporal. Depuração da creatinina endógena. Instruir o paciente para que faça corretamente a coleta da urina de 4 horas. Dosar a creatinina no soro e na urina. O soro pode ser obtido em qualquer momento durante o período de coleta da urina. Aplicar os resultados obtidos na equação abaixo: Depuração = U S x VM (ml/minuto) U: creatinina na urina (mg/dl) S: creatinina no soro (mg/dl) VM: volume minuto (Volume urinário de 4 horas, em ml, dividido por 1440). OBS.: A depuração deverá ser corrigida para a superfície corporal do paciente, que é obtida através do nomograma correlacionando peso e altura, ou usando a equação abaixo: 0,45 0,75 A = P x H x 0, A = superfície corporal (m ) P = peso (kg) H = altura (cm) Multiplicar o valor da depuração por 1,73 e dividir pela superfície corporal do paciente. Ritmo de filtração glomerular. O NKDEP recomenda fortemente que os laboratórios reportem a estimativa do ritmo de filtração glomerular (erfg) em todos os laudos contendo resultados de creatinina (ver Significado Clínico). Quando os resultados da creatinina plasmática são rastreáveis ao método IDMS, utilizam-se as seguintes equações que aplicam creatinina (CREA), idade (18 a 70 anos) e sexo. Mulheres -1,1154 erfg ( ml/min/1,73m ) = 175 * (CREA) * (Idade) -0,03 * 0,74 Segundo recomendações do NKDEP, o erfg deve ser reportado como valor calculado quando o resultado for igual ou menor que 60 ml/min/1,73m. Quando o valor calculado for maior que 60, deve ser reportado da seguinte forma: Maior que 60 ml/min/1,73m ou >60 ml/min/1,73m. Intervalo operacional. A reação é linear entre 0,0 mg/dl e 150 mg/dl. Para valores maiores diluir a amostra com NaCl 150 mmol/l (0,85%) e repetir a determinação. Multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. e interno da qualidade. O laboratório deve manter um programa de controle interno da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios para especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para monitorizar a imprecisão da medição e desvios da calibração. Recomenda-se utilizar os produtos da linha Qualitrol H - Labtest para controle interno da qualidade em ensaios de química clínica. Sugere-se procurar atender as especificações propostas pelo NKDEP para o coeficiente de variação 4% e erro sistemático (bias) 5%. Intervalos de referência. 1,3,4 Os intervalos devem ser usados apenas como orientação. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça na população atendida seu próprio intervalo de referência. * Intervalos estabelecidos para resultados rastreáveis ao método IDMS. Soro/Plasma (mg/dl)* Recém-nascido 0,31-0,9 semanas - 1 ano 0,16-0, <3 anos 0,17-0, <5 anos 0,6-0,4 5 - <7 anos 0,9-0, <9 anos 0,34-0, <11 anos 0,3-0, <13 anos 0,4-0, <15 anos 0,46-0,81 Adultos (mulheres) anos 0,53-1,00 Adultos (homens) anos 0,70-1,0 Não existem intervalos estabelecidos para faixa etária 15 - <18 anos. Sugere-se utilizar os intervalos de mulheres e homens adultos. Conversão de mg/dl para Unidades SI: mol/l = mg/dl x 88,4 Urina (mg/kg/4 horas) - 3 anos 6 - > 3 anos 1-30 Adulto (mulheres) 16 - Adulto (homens) 1-6 Homens erfg ( ml/min/1,73m ) = 175 * (CREA) * (Idade) -1,1154-0,03 03 Português - Ref.: 17

4 Depuração da (ml/min/1,73m )** Crianças Adulto (mulheres) Adulto (homens) ** Intervalos estabelecidos para resultados não rastreáveis ao método IDMS. O NKDEP recomenda calcular o ritmo de filtração glomerular (erfg) em substituição à Depuração da, utilizando o resultado da creatinina rastreável ao método IDMS. Características do desempenho Estudos de recuperação. Em duas amostras com concentrações de creatinina iguais a 0,3 mg/dl e 40,64 mg/dl foram adicionadas 0,3 mg/dl do analito, obtendo-se recuperações entre 99,5 e 100,3%. O erro sistemático proporcional médio estimado no nível de decisão (1,0 mg/dl) é igual a 0,001 mg/dl ou 0,1%. Estudos de comparação de métodos. O método Enzimática foi comparado com outro método enzimático, sendo obtidos os seguintes resultados: Para amostras de soro: Utilizando a equação da regressão foram encontrados os seguintes erros sistemáticos para o método Enzimática: 5 Método comparativo Enzimática Natureza da amostra Soro Número de amostras Intervalo de concentrações (mg/dl) Média das estimativas (mg/dl) Equação da regressão Coeficiente de correlação 0,47-4,4 0,46-4,4 1,0 1,0 Enzimática = 0,9974* Comparativo + 0,0055 0,9996 Para amostras de urina: Método comparativo Enzimática Natureza da amostra Urina Número de amostras Intervalo de concentrações (mg/dl) Média das estimativas (mg/dl) Equação da regressão Coeficiente de correlação Utilizando a equação da regressão foram encontrados os seguintes erros sistemáticos para o método Enzimática: Níveis de decisão para avaliação da creatinina estimada com equação 11,73-146,6 11,79-146, 134,87 134,41 Enzimática = 0,9956* Comparativo + 0,1070 0,9998 Erros sistemáticos estimados nos níveis de decisão da creatinina mg/dl mg/dl mg/dl % ,05 0, ,333 0, ,093 0,419 Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio N Média DP CV (%) Amostra 1 0 1,10 0,0144 1,31 Amostra 0 4,66 0,0397 0,85 Reprodutibilidade - Imprecisão total N Média DP CV (%) Amostra 1 1 0,56 0,0053 0,96 Amostra 1 1,19 0,0146 1,3 Amostra 3 1 5,66 0,0339 0,60 Níveis de decisão para avaliação da creatinina estimada com equação Erros sistemáticos estimados nos níveis de decisão da creatinina mg/dl mg/dl mg/dl % 1,00 1,00 0,009 0,9 1,0 1,0 0,004 0,0,00,00 0,0003 0,015 Sensibilidade metodológica. Uma amostra não contendo creatinina foi utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio, tendo sido encontrado um valor igual a 0,19 mg/dl, equivalente à média de 09 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância do padrão como parâmetro verificou-se que o limite de detecção fotométrica foi 0,04 mg/dl, correspondendo a uma diferença de absorbância igual a 0,001. Efeitos da diluição da matriz. Uma amostra com valor igual a 101,60 mg/dl foi utilizada para avaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl 150 mmol/l (0,85%). Utilizando fatores de diluição que variaram de 1,5 a 5 foram encontradas recuperações entre 99,5 e 100,7%. 04 Português - Ref.: 17

5 Significado clínico. A constância na formação e excreção faz da creatinina um marcador muito útil de função renal, principalmente da filtração glomerular, em virtude da sua relativa independência de fatores como dieta, grau de hidratação e metabolismo protéico. Assim, a determinação da creatinina plasmática é um teste de função renal mais seguro do que a uréia. A creatinina não deve ser usada isoladamente para avaliar o ritmo de filtração glomerular ou detectar a presença de doença renal crônica porque ela é afetada pela taxa de filtração glomerular e por fatores independentes como idade, sexo, raça, dieta, massa muscular, drogas e métodos analíticos laboratoriais. Estimativas mais precisas e exatas do erfg podem ser obtidas com equações que combinam empiricamente todos os efeitos médios de fatores que afetam a creatinina com exceção da própria filtração glomerular. A equação atualmente recomendada foi desenvolvida a partir do estudo Modification of Diet Renal Disease (MDRD) utilizando o clearance do iotalamato como método de referência, e fornece resultados normalizados para a superfície corporal padrão 1,73m (ver Ritmo de Filtração Glomerular). A equação MDRD deve ser usada somente em indivíduos maiores de 18 anos e não foi avaliada nas seguintes situações: indivíduos com idade superior a 70 anos, mulheres grávidas, portadores de morbidades graves, indivíduos com extremos de massa corporal ou massa muscular ou com estado nutricional fortemente comprometido. O NKDEP desenvolveu um documento que proporciona informações que podem ajudar os laboratórios nos seguintes pontos (< acesso em 0/09/011): 1. Reportar resultados exatos da estimativa da filtração glomerular baseados na medição da creatinina sérica;. Compreender as iniciativas do NKDEP para padronizar as medições da creatinina sérica; 3. Comunicar apropriadamente aos provedores de serviços de saúde sobre as implicações nas mudanças dos resultados da creatinina sérica que serão resultantes das iniciativas de padronização na medição da creatinina. Observações 1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos.. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágüe final da vidraria, a água deve ter resistividade 1 megaohm.cm ou condutividade 1 microsiemens/cm e concentração de silicatos <0,1 mg/l. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. Referências 1. JUNGE, W. et. al. Determination of reference intervals for serum creatinine, creatinine excretion and creatinine clearance with an enzymatic and a modified Jaffé method. Clinica Chimica Acta, v. 344, n. 1-, p , MYERS. G. L. et al. Recommendations for Improving Serum Creatinine Measurement: A Report from the Laboratory Working Group of the National Kidney Disease Education Program. Clinical Chemistry, v. 5, n. 1, p. 5-18, MARTENSSON, A. et. al. Creatininium reference intervals for corrected methods. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, v. 64, p , CERIOTTI, F. et. al. Reference Intervals for serum Creatinine Concentrations: Assessment of Available Data for Global Application. Clinical Chemistry, v.54, n. 3, p , Labtest: Dados de Arquivo. Apresentação Produto Referëncia Conteúdo Enzimática Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos e semiautomáticos. Informações ao consumidor [Termos e Condições de Garantia] A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto dentro das especificações até a data de expiração indicada nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidos corretamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Serviço de Apoio ao Cliente (Ligação Gratuita) [email protected] Edição: Dezembro, 011 Ref.: / X 16 ml 1 X 54 ml Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reprodução sob prévia autorização 05 Português - Ref.: 17

6 Símbolos utilizados com produtos diagnósticos in vitro Símbolos usados con productos diagnósticos in vitro Symbols used with ivd devices Conteúdo suficiente para < n > testes Contenido suficiente para < n > tests Contains sufficient for < n > tests Risco biológico Riesgo biológico Biological risk Data limite de utilização (aaaa-mm-dd ou mm/aaaa) Estable hasta (aaaa-mm-dd o mm/aaaa) Use by (yyyy-mm-dd or mm/yyyy) Marca CE Marcado CE CE Mark Calibrator Material Tóxico Tóxico Poison Calibrator Material Reagente Reactivo Reagent Limite de temperatura (conservar a) Temperatura limite (conservar a) Temperature limitation (store at) Fabricado por Elaborado por Manufactured by Representante Autorizado na Comunidade Europeia Representante autorizado en la Comunidad Europea Authorized Representative in the European Community Número do lote Denominación de lote Batch code Consultar instruções de uso Consultar instrucciones de uso Consult instructions for use e Número do catálogo Número de catálogo Catalog Number e negativo negativo Negative control Adições ou alterações significativas Cambios o suplementos significativos Significant additions or changes e positivo positivo Positive control Produto diagnóstico in vitro Dispositivo de diagnóstico in vitro In vitro diagnostic device e Liofilizado Liofilizado Lyophilized Corrosivo Corrosivo Corrosive Ref.: Português - Ref.: 17