IBC Liquiform. 01 Português - Ref.: 92. Ref.:92 Instruções de Uso MS Capacidade de ligação do ferro 3. - Finalidade. Princípio.

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1 IBC Liquiform Ref.:9 Instruções de Uso M Capacidade de ligação do ferro Finalidade. istema bi-reagente para a determinação da capacidade de ligação do ferro em amostras de sangue por reação de ponto final. [omente para uso diagnóstico in vitro.] Princípio. Os íons férricos contidos no Reagente 1 saturam os sítios disponíveis para a ligação de ferro da proteína transportadora, a transferrina. O excesso de ferro não ligado forma com o Ferrozine presente no Reagente um complexo magenta brilhante, cuja absorbância é medida entre 40 e 80 nm. A diferença entre esta quantidade de ferro e aquela contida no Reagente 1 é a Capacidade Latente de Ligação do Ferro (CLLF). Medindo-se a concentração de ferro sérico e somando este valor a CLLF, obtém-se a Capacidade Total de Ligação de Ferro (CTLF). Características do sistema. O sistema de reagentes da Labtest consiste em um ensaio homogêneo direto que permite a medida da CLLF. Juntamente com o valor do ferro sérico pode-se obter a CTLF e o Índice de aturação da Transferrina (IT), que são importantes na avaliação dos distúrbios do metabolismo do ferro. O método é bastante preciso, apresenta especificidade e exatidão adequadas, sendo rastreável ao método proposto pelo NCCL para determinação da CTLF. Além disso, o sistema não sofre interferência significativa de bilirrubinas (até 0 mg/dl) e de triglicérides (até 1000 mg/dl). O desenvolvimento do método foi direcionado para automação, tornando-o facilmente aplicável em analisadores automáticos capazes de medir com exatidão uma reação de ponto final entre 40 e 80 nm. O sistema IBC Liquiform também pode ser utilizado com sucesso em aplicações manuais utilizando fotômetros ou instrumentos semiautomáticos. Metodologia. Reagentes Labtest-ferrozine. Reagente 1 - Armazenar entre - 8 ºC. Contém: Tampão 300 mmol/l, ph 8,4; cloreto férrico 3 µ mol/l; hidrogenocarbonato de sódio 10 mmol/l; azida sódica 7,7 mmol/l e surfactantes. Reagente - Armazenar entre - 8 ºC. Contém: Tampão 0 mmol/l, ph 4,0; Ferrozine 10 mmol/l; ácido ascórbico 3,6 mmol/l Calibrador - Concentração no rótulo do frasco - Armazenar entre - 8 ºC. Preparação de soro bovino liofilizado com valor de CLLF rastreável ao método de referência do CLI. Após manuseio sugere-se armazenar bem vedado para evitar evaporação. Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo. urante o manuseio, os reagentes estão sujeitos a contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar redução da estabilidade. A vidraria armazenada pode acumular resíduos que levam à obtenção de resultados falsamente elevados. O material usado no procedimento deve estar livre da contaminação com ferro para evitar a obtenção de resultados incorretos de CLLF. Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação dos reagentes. Não utilizar os reagentes quando se mostrarem turvos ou com sinais de contaminação. Os reagente 1 contém azida sódica que é tóxica. Não ingerir e, no caso de contato com os olhos, lavar imediatamente com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água para descartar os reagentes. Material necessário e não fornecido Precauções e cuidados especiais Banho-maria mantido à temperatura constante (37 ºC). Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre 40 e 80 nm. Pipetas para medir amostras e reagentes. Cronômetro. Influências pré-analíticas. Fatores pré-analíticos são hoje a causa mais importante de determinações incorretas de capacidade de ligação do ferro. A contaminação pode ocorrer na coleta, no transporte e no processamento da amostra. studos indicam que 60% dos erros ocorridos no ensaio são devidos a erros pré-analíticos. A amostra deve ser colhida pela manhã visando evitar as variações diurnas do ferro, que podem produzir reduções de até 30% nos resultados de ferro sérico, podendo interferir na determinação da capacidade de ligação do ferro. 01 Português - Ref.: 9

2 Idade, sexo, período de gestação, uso de contraceptivos orais e estrogênio alteram as concentrações de ferro e podem interferir na determinação da capacidade de ligação do ferro. O uso de detergente iônico para limpeza do material é outra fonte de contaminação com ferro que pode levar a resultados inconsistentes da determinação da capacidade de ligação do ferro. Amostra eve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) que estabeleça procedimentos adequados para colheita, preparação e armazenamento da amostra. nfatizamos que os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimento analítico. Usar soro obtido em jejum. O analito é estável 4 dias entre 1 - ºC e 6 dias entre - 8 ºC. Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las devem-se seguir as normas estabelecidas para biossegurança. Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental. Interferências Concentrações de bilirrubina (Conjugada ou Não Conjugada) até 0 mg/dl, triglicérides até 1000 mg/dl e hemoglobina até 00 mg/dl não produzem interferências significativas. O uso de amostras contendo heparina ou de pacientes submetidos a procedimento de hemodiálise não apresenta interferência significativa na determinação da capacidade de ligação do ferro com o sistema Labtest. Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em uma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo: iluir 0,0 ml da amostra em,0 ml de NaCl 10 mmol/l (0,8%) e medir a absorbância em 40 ou 41 nm acertando o zero com água deionizada ou destilada. Hemoglobina (mg/dl) Absorbância40 x 601 Hemoglobina (mg/dl) Absorbância x 467 Preparação dos reagentes Reagente 1 e Reagente : Prontos para uso. Calibrador: Utilizando pipeta volumétrica, adicionar 3,0 ml de água qualidade reagente ao conteúdo do frasco do calibrador. eixar em repouso durante 30 minutos. Misturar por inversão suave evitando a formação de espuma. stável dias entre - 8 ºC e 30 dias em temperatura igual ou menor que 8 ºC negativos (congelador de geladeira "duplex", ou freezer) em recipiente hermeticamente fechado. Para evitar congelamentos e descongelamentos repetidos, sugerimos separar o calibrador em alíquotas de 0, a 1,0 ml e armazenar em recipiente apropriado antes de congelar. 41 Procedimento Ver observações 1, e 3. O material usado no procedimento deve estar livre da contaminação com ferro para evitar a obtenção de resultados incorretos de CLLF. A água deionizada deve ter uma resistividade 1 megaohm ou uma condutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos <0,1 mg/l. ste procedimento não se aplica a analisadores semi-automáticos que utilizam unicamente cubeta de fluxo. stão disponíveis aplicações para sistemas automáticos. Tomar 3 cubetas do fotômetro e proceder como a seguir: Reagente 1 oro Calibrador Água deionizada Misturar e incubar em banho-maria a 37 ºC durante minutos. eterminar a absorbância do branco, teste e calibrador em 60 nm (40 a 80 nm), acertando o zero com água deionizada. Obtém-se a absorbância A. Reagente Misturar e incubar em banho-maria a 37 ºC durante minutos. O nível da água no banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio. eterminar as absorbâncias do branco, teste e calibrador em 60 nm (40 a 80 nm), acertando o zero com água deionizada. Obtémse a absorbância A. A cor é estável por 30 minutos. O procedimento sugerido para a medição é adequado para fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual ou menor que 0,8 ml. eve ser feita uma verificação da necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado. Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste e o procedimento de cálculo se mantém inalterado. m caso de redução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes da amostra menores que 0,01 ml são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a imprecisão da medição. Cálculos. Ver linearidade. A primeira leitura da absorbância (A ) do Teste, Calibrador e Branco devem ser corrigidas para o volume final da reação, obtendo-se A antes de realizar o cálculo da concentração de ferro. A = A x 0,809 1cor 1 1 Branco 0,7 ml 0,1 ml Branco 0, ml Para obter as absorbâncias do Teste e Calibrador, fazer a correção pelas leituras do branco do reagente: 1 Teste 0,7 ml 0,1 ml Teste 0, ml Calibrador 0,7 ml 0,1 ml Calibrador 0, ml 1cor 0 Português - Ref.: 9

3 Abs. do Teste = Branco (A - A ) - Teste (A - A ) Abs. do Calibrador = Branco (A - A ) - Calibrador (A - A ) CLLF ( µ g/dl) = CCal: concentração do calibrador xemplo Absorbância doteste Absorbância do Calibrador x CCal Branco: A 1 = 0,003 A 1cor = 0,003 x 0,809 = 0,00 A = 0,71 Teste: A 1 = 0,037 A 1cor = 0,037 x 0,809 = 0,030 A = 0,668 Abs. do Teste: (0,71-0,00) - (0,668-0,030) = 0,07 Calibrador: CCal: 9 µ g/dl A 1 = 0,030 A 1cor = 0,030 x 0,809 = 0,04 A = 0,61 Abs. do Calibrador: (0,71-0,00) - (0,61-0,04) = 0,119 0,07 CLLF ( µ g/dl) = x 9 = 17 0,119 evido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a metodologia, pode-se utilizar o método do fator. FATOR = CCal Absorbância do Calibrador CLLF ( µ g/dl) = Absorbância do Teste x Fator xemplo 9 Fator = = 176 0,119 CLLF ( µ g/dl) = 0,07 x 176 = 17 CTLF ( µ g/dl) = Ferro érico + CLLF Ferro érico IT (%) = x 100 CTLF Transferrina (mg/dl) = CTLF x 0,70 1cor 1cor 1cor 1cor Calibração. A concentração do calibrador é rastreável ao método de referência do CLI. Calibrações manuais Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentes ou quando o controle interno da qualidade indicar. istemas automáticos Branco de reagentes: água deionizada. Padrões: usar calibradores protéicos. Intervalo de calibrações Calibração de ou 3 pontos ao mudar de lote; Calibração de ou 3 pontos quando o controle interno da qualidade indicar. Linearidade O resultado da medição é linear até 00 µ g/dl. Para valores maiores de CLLF, diluir a amostra com água deionizada, realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Controle interno da qualidade. O laboratório deve manter um programa de controle interno da qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios para especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para avaliar a imprecisão e desvios da calibração. ugere-se que as especificações para o coeficiente de variação e o erro total sejam 7,8 baseadas nos componentes da variação biológica (VB). Intervalo de referência. stes valores devem ser usados apenas como orientação. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça sua própria faixa de valores de referência na população atendida. Capacidade de Ligação de Ferro ( µ g/dl) CLLF: Adultos: 140 a 80 µ g/dl CTLF: Crianças : 10 a 400 µ g/dl Adultos: 0 a 40 µ g/dl IT: 0 a 0% Transferrina: 00 a 300 mg/dl Conversão : Unidades Convencionais ( µ g/dl) x 0,179= Unidades I ( µ mol/l). Características do desempenho xatidão. 9,10 A exatidão do método foi demonstrada em um estudo de recuperação utilizando amostras com valores de CLLF iguais a 19 e 418 µ g/dl obtendo-se recuperações entre 101 e 104%. O erro sistemático proporcional médio foi igual a 1,48% e 4,34% em concentrações de 0 e 410 µ g/dl, respectivamente Português - Ref.: 9

4 specificidade. O método proposto foi comparado com o método de referência do CLI utilizando 80 amostras com valores situados entre 4 e 437 µ g/dl. A comparação resultou na equação da regressão: y = 0,971x + 4,980 e um coeficiente de correlação (r) igual a 0,9917. O erro sistemático total (constante e proporcional) foi igual a,7% e 8,4% em concentrações 0 e 410 µ g/dl, respectivamente, mostrando uma correlação positiva entre os dois métodos. Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio Amostra 1 Amostra ensibilidade metodológica. Uma amostra protéica não contendo transferrina foi utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontrado um valor igual a,67 µ g/dl, equivalente à média de 0 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância do padrão como parâmetro, verificou-se que o limite de detecção fotométrica é de,3 µ g/dl, correspondendo a uma absorbância igual a 0,001. feitos da diluição da matriz. N 0 0 uas amostras com valores iguais a 434 e 13 µ g/dl foram utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com água deionizada. Usando fatores de diluição que variaram de a 8 foram encontradas recuperações entre 100 e 101%. ignificado clínico. Média 389 Reprodutibilidade - Imprecisão total Amostra 1 Amostra N 0 0 Média 389 P 4,70,89 P 6,36 7,09 CV (%),34 0,7 CV (%) 3,06,06 O ferro é essencial para a maioria dos organismos vivos pois participa de numerosos processos vitais, desde os processos oxidativos celulares ao transporte de oxigênio para os tecidos. A hemostasia do ferro é regulada principalmente pela absorção e não pela excreção. O ferro é transportado no sangue por uma proteína, a transferrina, e armazenado nos tecidos ligado à outra proteína chamada ferritina. Normalmente, devido a somente um terço dos sítios de ligação para o ferro da transferrina estar ocupado pelo ferro, a transferrina do soro tem considerável reserva de capacidade de ligação do ferro, que é a capacidade latente de ligação do ferro (CLLF). A capacidade total de ligação do ferro (CLTF) no soro é a medida da concentração máxima de ferro que a transferrina pode transportar. A deficiência de ferro é conseqüência de suprimento inadequado, aumento da demanda, perda sanguínea ou a combinação destes fatores. O suprimento inadequado é característico das crianças alimentadas exclusivamente com leite. Já o aumento de demanda é característico da gravidez e das crianças nos primeiros anos de vida. Menstruação abundante, hemorragias gastro-intestinais, hemorróidas, carcinoma de cólon e parasitoses são causas comuns de deficiência de ferro sérico por perda sanguínea no adulto. A CTLF mostra-se freqüentemente aumentada na deficiência de ferro. Transfusões repetidas, hemocromatose idiopática, cirrose, talassemia e anemia sideroblástica são as causas mais comuns de aumento do ferro sérico e diminuição da CTLF. A tabela a seguir apresenta o comportamento das dosagens de Ferro érico, Capacidade Total de Ligação do Ferro (CTLF), Índice de aturação da Transferrina (IT) e Reserva de Ferro Medular (RF), avaliada pela coloração específica de esfregaço da medula óssea nas diversas situações ligadas à alteração no metabolismo do ferro. eficiência de ferro Infecções crônicas oenças malígnas Atransferrinemia Período menstrual Gravidez (3º trimestre) Hemosiderose pulmonar Nefrose Kwashiorkor Contraceptivos orais Intoxicação com ferro Anemia hemolítica Hemocromatose eficiência de piridoxina Anemia sideroblástica Talassemia major = diminuído = sem alteração Observações 1. = elevado A = ausente A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos.. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa potencial de erros analíticos. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes, usar nas medições e para uso no enxágüe final da vidraria, deve ter resistividade 1 megaohm.cm ou condutividade 1 microsiemens/cm e concentração de silicatos <0,1 mg/l. Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade saturada ocorre produção de água alcalina com liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água. 3. Ferro érico / Alterações CTLF IT RF / / / Para uma revisão das fontes fisiopatológicas de interferência nos resultados e na metodologia sugere-se consultar: A A 04 Português - Ref.: 9

5 Referências Apresentação 1. Goodwin J, Murphy B, Guillemette M. Clin Chem 1966; 1:47.. Henry RJ, Cannon C, Winkelman JW. Clinical Chemistry, Principles and Technics, nd ed. New York, Harper & Row, Produto IBC Liquiform Referência 9-/6C 1 Conteúdo X 0 ml X 1 ml 1 X 3 ml 3. tookey L. Anal Chem 1970;4: Tonks B. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott Laboratories, iagnostic Reagents ivision, carborough, Canada, NCCL, etermination of erum Iron, Total Iron-Binding Capacity and Percent Transferrin aturation; Approved tandard, NCCL document H17-A, Vol 19 No. 19, Westgard J O, Barry PL, Hunt MR. Clin Chem 1981;7: ociedad spañola de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, Base de atos de Variación Biológica. isponível em:< (acesso em 04/006). 8. Basques JC. specificações da Qualidade Analítica. Labtest iagnóstica Burtis CA, Ashwood R. Textbook of Clinical Chemistry, a. edição, Philadelphia: W.B. aunders, 1986: oldin J, Brugnara C, Wong C: Pediatric Reference Intervals, a. edição, Washington. 11. Labtest: ados de Arquivo. stão disponíveis aplicações para sistemas automáticos. O número de testes em aplicações automáticas depende dos parâmetros de programação de cada equipamento. Algumas apresentações podem ser disponibilizadas somente mediante consulta. Informações ao consumidor [Termos e Condições de Garantia] A Labtest iagnóstica garante o desempenho deste produto dentro das especificações até a data de expiração indicada nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidos corretamente. Labtest iagnóstica.a. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CP Lagoa anta. Minas Gerais Brasil - erviço de Apoio ao Cliente (Ligação Gratuita) sac@labtest.com.br Revisão: Março, 011 Ref.: 4014 Copyright by Labtest iagnóstica.a. Reprodução sob prévia autorização 0 Português - Ref.: 9

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