PS 4 Soluções Pergunta 1

PS 4 Soluções Pergunta 1 Você está estudando a síntese do aminoácido triptofano em bactérias. As enzimas TrpA, TrpB, TrpC, TrpD, TrpE e AroH são essenciais para a síntese desse aminoácido. Bactérias do tipo selvagem não sintetizam nenhuma dessas proteínas na presença do triptofano; entretanto, na ausência do triptofano todas as enzimas são sintetizadas em grandes quantidades. a) Teoricamente, se a síntese das enzimas acima for regulada de forma negativa i) que alteração na proteína repressora causaria a síntese das enzimas mesmo na presença do triptofano? Inativação do repressor funcional de forma que ele não possa se ligar ao operador. ii) que alteração na seqüência operadora causaria a síntese das proteínas mesmo na presença do triptofano? Uma mutação na seqüência do operador de forma que ele não possa mais se ligar ao repressor. iii) que alteração na proteína repressora inibiria a síntese da enzima mesmo na ausência do triftofano? Uma alteração que aumente a afinidade do repressor pelo operador, i.e., um repressor ativo. b) Se a síntese das enzimas acima for regulada de forma positiva, i) que alteração na proteína ativadora causaria a síntese das enzimas mesmo na presença do triptofano? Uma alteração que aumente a afinidade do ativador pelo operador, i.e., um ativador ativo. OU Uma alteração no ativador de forma a impedir a ligação do triptofano. ii) que alteração na proteína ativadora impediria a síntese das enzimas mesmo na ausência do triftofano? Uma mutação na seqüência do gene ativador de forma a produzir uma proteína ativadora nãofuncional. iii) que alteração na seqüência operadora impediria a síntese das enzimas mesmo na ausência do triptofano? Uma mutação na seqüência operadora impedindo a ligação do ativador. c) Por intermédio de uma análise mutacional, você identifica duas regiões do DNA que são importantes na regulação da síntese do triptofano. A primeira dessas duas regiões, trpr, é um gene que codifica a proteína de ligação ao DNA. A segunda região, chamada de trpo, é uma seqüência de DNA na qual o gene trpr produz ligações. Análises de três cepas de bactérias com genótipos diferentes nos locos trpr e trpo fornecem os seguintes resultados: Cepa trpr trpo trpr trpo Meio de crescimento com triptofano sem triptofano com triptofano sem triptofano níveis de mrnas de trpa, trpb, trpc, trpd e trpe 0,1% 100% 100% 100% 1

trpr trpo com triptofano sem triptofano 100% 100% 2

i) O controle da síntese do triptofano é um exemplo de regulação positiva ou negativa? A síntese do triptofano está submetida a uma regulação negativa. A proteína produzida pelo gene trpr é um ativador ou um repressor? A proteína trpr age como um repressor. d) Experimentos para monitorar a presença ou ausência da enzima sintetizada a partir dos genes trpc, trpd, trpe e AroH em alguns organismos mutantes isolados rendeu os seguintes resultados: nível de TrpC Nível de TrpD Nível de TrpE Nível de AroH com trp sem trp com trp sem trp com trp sem trp com trp sem trp mutante wt 1 2 3 4 5 i) Relacione todos os mutantes que apresentam mutações que afetam a produção de qualquer TrpC funcional. mutante 1, mutante 4 e mutante 5 ii) Relacione todos os mutantes que apresentam mutações que afetam a produção de qualquer TrpD funcional. mutante 2, mutante 4 e mutante 5 iii) Relacione todos os mutantes que apresentam mutações que afetam a produção de qualquer AroH funcional. mutante 3 e mutante 5 e) Os dados acima são consistentes com a teoria de que muitos desses genes estão no mesmo operon (e portanto sob o controle de um único promotor)? Por que? Quais genes estariam contidos nesse operon? A ausência de enzimas funcionais de três locos como no caso do mutante 4, sugere que diversos genes podem estar contidos dentro de um único operon. Todos os genes do operon estariam sob o controle do mesmo promotor, o que no caso do mutante 4 é mutante nãofuncional, resultando na ausência de síntese de qualquer uma das três enzimas. Esse operon conteria os genes trpc, trpd e trpe. f) Como você explicaria o mutante 5 em termos de mutações regulatórias? Apesar de estarem localizados em regiões diferentes do DNA, o operon trpc/trpd/trpe e o gene aroh poderiam estar sendo regulados pela mesma proteína repressora trpr. O mutante 5 apresentaria uma mutação no gene trpr, oposto ao repressor trpr. Dessa forma, todos os genes seriam expressos na presença ou ausência do triptofano. 3

Pergunta 2 Ao trabalhar com camundongos como UROP, você descobriu uma enzima catabólica muito importante. Você realiza mutações no gene que codifica essa enzima, de forma a tornar a enzima mutante sempre ativa. Os camundongos portadores desse gene mutante apresentam um emagrecimento permanente e rápido sem outros eventos adversos. VOCÊ ACABOU DE DESCOBRIR A PÍLULA MÁGICA QUE MILHÕES DE PESSOAS ESTÃO PROCURANDO HÁ VÁRIAS GERAÇÕES! Mas você precisa da versão mutante desse gene. Para começar, você decide criar uma biblioteca genômica de DNA do ser humano. a) No espaço abaixo, descreva sucintamente como você desenvolveria uma biblioteca genômica de DNA para bactérias. Use os termos: genômico, enzima de restrição, plasmídeo, transformação, placas de Petri, sonda e hibridação. 1. Cortar o DNA genômico humano com uma enzima de restrição. 2. Cortar o vetor do plasmídeo que possui um marcador selecionável (como a resistência à ampicilina) com a mesma enzima de restrição. 3. Ligar o DNA genômico ao vetor. 4. Transformar a mistura de ligação em E. coli. 5. Semear a E. coli modificada em placa de Petri com meio de cultura sólido contendo ampicilina. 6. Fazer uma sonda e hibridizar com o DNA da biblioteca. Você conseguiu descobrir o análogo humano. Você encontrou a colônia que contém um plasmídeo, chamado \ \ plib1, com homólogo humano. Você isola o plasmídeo, clona o gene ao qual dá o nome de gene svelte. Idealmente, você deseja expressar grande quantidade da enzima humana, de modo a poder fazer um estudo bioquímico completo da proteína. Consequentemente, você precisa mover o gene svelte dos plasmídeo plib1 para um vetor de expressão. Você tem um vetor de expressão grande, p7.01mit, para ser usado em E. coli. Um diagrama do vetor de expressão p701mit e do plib1 é fornecido a seguir, ilustrando os sites únicos das enzimas de restrição. b) Você deseja inserir um fragmento de DNA contendo o gene svelte e o gene de resistência à kanamicina (kanr) no vetor de expressão p701mit. 4

i) Qual (is) enzima(s) você usaria para cortar plib1 para obter um único fragmento contendo o gene svelte e o gene de resistência à kanamicina (kanr)? Qual seria o tamanho dos fragmentos? Escolha 1: SalI e BamHI: 1129 650 Escolha 2: StyI e BamHI: 1028 751 5

ii) Qual (is) enzima(s) você usaria para cortar p701mit? Qual seria o tamanho dos fragmentos? Escolha 1: SalI e BamHI: 2996 205 Escolha 2: StyI e BamHI: 2495 706 c) Após a ligação, você transforma o novo vetor p701mit contendo os genes svelte e kan R em uma cepa de E. coli. i) Antes da transformação, essa cepa de E. coli deveria ser... sublinhe a alternativa que se aplica). resistente à ampicilina sensível à ampicilina. resistente à kanamicina sensível à kanamicina. ii) Como você detectaria quais células possuem um vetor contendo o gene svelte? Semeie as células transformadas em placas com meio contendo ampicilina e kanamicina. iii) Qual é a vantagem de incluir o gene kanr no fragmento clonado em p701mit? Isso permite que você realize a seleção em comparação com qualquer célula que sofreu transformação apenas com o vetor (i.e., com um vetor que não carregava nenhum implante) ou com o vetor carregando o implante errado. Pergunta 3 a) Marque no gel abaixo os locais onde você espera encontrar bandas. Identifique cada banda com o número de bases que o fragmento pode conter. A partir da clonagem de BamHI e StyI: 6

A partir da clonagem de SalI e BamHI: b) promotor: 5 GAGTATCAGT 3 c) Qual é a seqüência do DNA recentemente sintetizado? 5 GAGTATCAGTAGCGGGCCTTTACGCCCAGCAT promotor 7

Pergunta 4 Você é assessor de genética em um grande hospital de Boston. Um casal (representado na árvore genealógica a seguir como 1 e 2) quer saber quais são as probabilidades de que o filhos que estão esperando tenham orelhas grandes. Recentemente, o gene responsável pelas orelhas grandes foi clonado e sequenciado. A região com o gene para tamanho de orelhas é mostrada a seguir. a) Você deseja amplificar esse gene de cada um dos pais por intermédio do PCR. Forneça a seqüência dos dois promotores para essa reação de PCR. Identifique as pontas 5 e 3. promotor A: 5 GTCCTGATTT 3 promotor B: 5 ATTGGACCTA 3 b) O esquema a seguir ilustra a mesma região. Na diagrama abaixo, identifique o sítio de ligação de cada promotor. c) Em um esquema semelhante ao b) ilustre os filamentos de DNA que estariam presentes após dois testes de PCR. Inclua promotores nos locais adequados em cada filamento. 8

Pergunta 4, continuação Um mapa de restrição dessa região é fornecido a seguir: O DNA amplificado por PCR de cada membro da família foi submetido à digestão com Hind III, Nde I e Bgl II. O DNA digerido foi separado por uma eletroforese em gel e os resultados são fornecidos a seguir. 9

d) O fenótipo orelha grande é dominante ou recessivo em relação ao fenótipo normal? Como você chegou a essa conclusão? O fenótipo de orelhas grandes é recessivo em relação ao fenótipo normal. A partir do gel, é possível observar que o indivíduo dois possui o gene selvagem e o gene mutante. O indivíduo dois não possui o fenótipo de orelhas grandes. e) Em posse da árvore genealógica dessa família e gel, quais são as chances de que os indivíduos 1 e 2 tenham um filho com orelhas grandes? Por favor explique. Os indivíduos 1 e 2 possuem uma chance de 50% de terem um filho com orelhas grandes. Ee X ee: 1ee (afetado) : 1Ee (portador, orelhas normais) 10