Detecção e Quantificação Viral

Detecção e Quantificação Viral Análise e Tratamento de Dados

Citomegalovirus i Carga Viral Vírus Epstein Barr Vírus a DNA Amplificação de fragmento de 74 pb Região BNRF1 (LMP2) Extracção do DNA Viral: Equipamento automático Amplificação e Detecção: ABI 7300 ABI 7900 2 1º Curso de Virologia Molecular em

PCR em Tempo Real PCR Quantificação Absoluta: Uso de calibradores(4 diluições, em triplicado) Expresso em Cópias/ml Controlo Negativo: NTC (Non Template Control) Controlo Interno Extracção: Fluoróforo de normalização: ROX 3 1º Curso de Virologia Molecular em

Validação da corrida Calibrador: com amplificação especifica (valor de Ct em função da Concentração) NTC: sem amplificação especifica Controlo Interno Extracção: controla INIBIÇÃO Quantificação: Avaliar Regressão Linear 4 1º Curso de Virologia Molecular em

Validação da corrida 5 1º Curso de Virologia Molecular em

Quantificação Quantificação Absoluta: Recta com padrões (diluições logaritmicas em série) Dt Determinação da equação da recta através de Regressão Linear Cl Calcula-se l a quantidade tidd de cópias ói de DNA presente na amostra 9 1º Curso de Virologia Molecular em

Quantificação Absoluta Em condições ideiais, o número de moleculas é duplicado em cada ciclo. Se inicialmente, tivermos uma quantidade N 0 de DNA dupla cadeia, após x ciclos teremos: N = N 2 C 0 c 10 1º Curso de Virologia Molecular em

Eficiência iê i PCR Numa reacção de PCR, não há duplicação do nº de moléculas de DNA em todos os ciclos, uma vez que a Eficiência é inferior a 100% Eficiência: fracção de moléculas que são copiadas por ciclo: il 0 E 1. A Eficiência depende do gene-alvo (t) e do tipo de amostra (s): Após C ciclos, o nº de moléculas dupla cadeia é de: 0 E + c t ts N = N ( 1 ) C 11 1º Curso de Virologia Molecular em

Eficiência iê i PCR A quantidade N c depende de N 0, apos um determinado nº de ciclos de amplificação Rearranjando a equação: a quantificação de N C permite o calculo do N 0 caso se conheça a eficiência de amplificação 0 t N = N /( E +11 ) = C ts c 12 1º Curso de Virologia Molecular em

Eficiência iê i PCR Aplicando o método do Threshold, desenvolvido por Higuchi et al, temos a seguinte equação: 0 t N = N /( E + 1) T em que Ct corresponde a um ponto teórico em que cada ciclo il de ampliação (amostra) atinge um determinado d nível de fluorescência Threshold ts C t 13 1º Curso de Virologia Molecular em

14 1º Curso de Virologia Molecular em

Eficiência iê i PCR 15 1º Curso de Virologia Molecular em

Eficiência iê i PCR Quantificação Absoluta pode ser obtida através de uma curva padrão, construída através da amplificação de [DNA] conhecidas - valores de Ct em função da [DNA] Aplicando logaritmos, temos a seguinte equação: 0 Log ( N ) = Log ( E + 1)* C + Log ( N t ts t T ) Uma vez que E e N 0 são constantes, t esta equação tem a estrutura geral de uma recta: Y=mX+b 16 1º Curso de Virologia Molecular em

Eficiência iê i PCR Representando graficamente Log (N 0 ) em função do C t, temos uma equação com o declive: Declive = 1 1 l ( Declive log( E +1) E t =10 1 t 17 1º Curso de Virologia Molecular em

Eficiência iê i PCR 18 1º Curso de Virologia Molecular em

45,0 40,0 35,0 30,0 Eficiência iê i PCR EBV y = -3,256x + 40,661 R² = 0,998 Valor de Ct 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 EBV 19 1º Curso de Virologia Molecular em

Regressão Linear O objectivo da Regressão Linear consiste no ajuste do declive e da ordenada na origem de modo a encontrar uma linha que preveja o mais correctamente possivel os valores de Y (Ct) a partir de X (log[dna]): Minimiza a Soma dos Quadrados dos desvios verticais dos pontos à linha y = a + bx 20 1º Curso de Virologia Molecular em

Regressão Linear Assumimos que: O erro está associado aos valores de Ct medidos. Não há erro associado às concentrações A variação dos valores de Ct obedece a uma distribuição normal O erro nos valores de Ct é independente da concentração 21 1º Curso de Virologia Molecular em

Validação corrida Avaliar os seguintes elementos: NTC Controlo Interno de Extração (amostras) Representar graficamente valores de Ct das diluições seriadas do calibrador vs o logaritmo da concentração das diluições em série Parâmetros de Regressão Linear: Declive: eficiência de amplificação Ord. Origem: R 2 : 22 1º Curso de Virologia Molecular em

Eficiência iê i Amplificação Teoricamente, uma eficiência de 100% corresponde a um declive de -3,32 (FAM 1 cópia detectada ao ciclo 33.3-36.5) Deve estar compreendida entre 90 e 105% Valores superiores a 100% revelam amplificações inespecificas 23 1º Curso de Virologia Molecular em

Declive: Parâmetros Regressão Linear Valores entre -3.1 e -3.6 Od Ordenada d Origem: Oi Variável de acordo com o ensaio Entre 36 e 40 R 2 : 0.98 24 1º Curso de Virologia Molecular em

Parâmetros Regressão Linear 25 1º Curso de Virologia Molecular em

Limite it Detecção/ Quantificação Limite Detecção: Quantidade mais baixa de um dado analito, numa amostra, que pode ser detectado mas não necessariamente quantificado Limite it Quantificação: É a menor concentração do analito que pode ser determinada com um nivel aceitavel de precisão e veracidade. 26 1º Curso de Virologia Molecular em

Limite it Detecção/ Quantificação Metodologia mais comum: LD: Regressão Logistica por software (MultiD) ou avaliação de amostras com baixa quantidade de DNA/ RNA LQ: Desvio Padrão da resposta σ LQ = 10x ( σ ) Slope σ= Residual Standard Deviation of the Regression (Excel) 27 1º Curso de Virologia Molecular em

Expressão de Resultados Não Detectado: Amostras sem cópias detectadas Controlo Interno detectado (Ct do CI Amostra Ct NTC ± 4) Inibido Amostras sem cópias detectadas Controlo Interno não detectado (Ct da Amostra Ct NTC ± 4) ) Detectado (> Limite Quantificação, nº de réplicas > 1): Amostras acelulares: Detectado (indicar o nº cópias/ml) Amostras celulares: Detectado (indicar o nº cópias/µg DNA) Detectado (> Limite Quantificação, nº de réplicas = 1): Detectado e colocar em observação: Por favor enviar nova amostra para confirmação da quantificação Detectado (< Limite Quantificação): Detectado com nº de cópias inferior ao Limite Quantificação 31 1º Curso de Virologia Molecular em

Quantificação Relativa Determina razão entre a quantidade de um dado DNA e uma amostra de referência Et Esta referência pode ser: Amostra ao tempo zero Amostra não tratada (vs amostra tratada) Linha celular normal Análise realizada por software 32 1º Curso de Virologia Molecular em