RUBELLA IgG. Finalidade do teste

TM RUBELLA IgG REF 34430 Finalidade do teste Resumo e explicação do teste Princípios do teste O teste Access Rubella IgG é um imunoensaio quimioluminescente com partículas paramagnéticas para a determinação qualitativa e quantitativa dos anticorpos IgG dirigidos contra o vírus da rubéola no soro humano utilizando os Sistemas de Imunoensaio Access. O teste Access Rubella IgG ajuda no diagnóstico da infecção de rubéola e na determinação da imunidade. A rubéola é uma doença viral difusa no mundo inteiro. A infecção é normalmente benigna, sendo até mesmo assintomática em crianças ou adultos. As manifestações clínicas incluem uma erupção cutânea generalizada em todo o corpo, febre baixa, dor de cabeça e, às vezes, dor de garganta. As infecções in utero, sobretudo durante os primeiros quatro meses de gravidez, podem provocar malformações congénitas tais como surdez, cardiopatias, catarata ou glaucoma e, por vezes, a morte do feto 1,2. A detecção dos anticorpos específicos da rubéola é de grande importância por causa do risco teratogénico relacionado com a infecção primária de rubéola no início da gravidez. Os métodos anteriores utilizados para a detecção dos anticorpos incluíam a neutralização do soro, a fixação do complemento ou a imunofluorescência. Estes testes são difíceis de se realizar e apresentaram problemas inerentes à reprodutibilidade. Posteriormente, as técnicas de inibição da hemoaglutinação permitiram um diagnóstico mais rápido quer da infecção aguda, quer do estado imunitário do doente 3,4,5. Em 1971, Engvall e Perlmann descreveram os primeiros procedimentos de ensaio imunoenzimático. O desenvolvimento de tais métodos contribuíram para melhorar a especificidade e a sensibilidade das técnicas de investigação com antigénios e anticorpos, incluído o campo de diagnóstico da rubéola 5. A presença de anticorpos IgG anti-rubéola nas mulheres antes da concepção garante a protecção fetal contra uma possível infecção viral por rubéola durante a gravidez. A eficácia da vacinação é demonstrada pela detecção de anticorpos IgG anti-rubéola após a imunização. O aparecimento ou um aumento significativo da concentração de IgG específicas em duas amostras séricas colhidas pelo menos a duas semanas de distância uma da outra indica uma infecção por rubéola, mesmo quando os sintomas típicos não estiverem presentes 5. O teste Access Rubella IgG é um ensaio imunoenzimático que utiliza uma técnica indirecta. Quando uma amostra é adicionada a um recipiente de reacção contendo partículas paramagnéticas revestidas com antigénio viral de membrana da rubéola 6,7,8,9, os anticorpos anti-rubéola ligam-se ao antigénio. Após a incubação num recipiente de reacção, os materiais ligados à fase sólida são retidos num campo magnético, enquanto os materiais não ligados são removidos por lavagem. Depois disso, o conjugado fosfatase alcalina anticorpo monoclonal anti-igg humanas é adicionado, ligando-se aos anticorpos IgG capturados nas partículas. Uma segunda fase de separação e lavagem remove o conjugado não ligado. De seguida, o substrato quimioluminescente, Lumi-Phos* 530, é adicionado ao recipiente e a luz gerada pela reacção é medida com um luminómetro. A produção de luz é directamente proporcional à concentração de anticorpos IgG dirigidos contra o vírus da rubéola na amostra. A quantidade de analito presente na amostra é determinada a partir duma curva de calibração multiponto armazenada no sistema e padronizada consoante a 2ª Preparação Padrão Internacional para o Soro Anti-rubéola da OMS. 2004 Beckman Coulter, Inc. 386841A Access Rubella IgG Página 1

Informações sobre o produto Kit de reagentes Access Rubella IgG Nº Cat. 34430: 100 determinações, 2 embalagens, 50 testes/embalagem Fornecido pronto para utilizar. Armazenar em posição vertical e refrigerar a 2 10 C. Manter refrigerado a 2 10 C por no mínimo duas horas antes de usar no aparelho. Estável até ao vencimento do prazo de validade marcado na etiqueta quando armazenado a 2 10 C. Estável a 2 10 C por 28 dias após utilização inicial. Uma possível degradação pode ser indicada pela ruptura da camada de elastómero da embalagem ou por valores de controlo de calidad fora do intervalo de variação. Abrir a embalagem de reagente caso tenha sofrido prejuízos (p.ex. ruptura da camada elastomérica). R1a: R1b: Partículas paramagnéticas revestidas com antigénio de rubéola (cepa HPV 77) purificado em gradiente de sacarose suspensas em solução salina tamponada TRIS, com albumina sérica bovina (BSA), < 0,1% de azida sódica e 0,1% de ProClin** 300. Solução salina tamponada TRIS com surfactante, BSA, < 0,1% de azida sódica e 0,1% de ProClin 300. R1c: Conjugado anticorpo monoclonal de rato anti-igg humanas (clone 125 A 15) fosfatase alcalina (bovina) em solução salina tamponada TRIS com surfactante, glicerol, BSA, proteínas murinas, < 0,1% de azida sódica. Avisos e precauções Colheita e preparação da amostra Para utilização em diagnóstico in vitro. As amostras dos doentes e os produtos hemoderivados podem ser analisados rotineiramente com riscos mínimos utilizando o procedimento descrito. Contudo, deve manusear estes produtos como potencialmente infecciosos de acordo com as precauções gerais e os métodos adequados de laboratórios clínicos, independentemente da origem, tratamento ou certificação anterior. Usar um desinfectante apropriado para a descontaminação. Armazenar e eliminar estes materiais e os respectivos contentores segundo o regulamento e as normas locais. A azida sódica pode reagir com as canalizações de chumbo ou cobre formando azidas metálicas altamente explosivas. Portanto, deixar fluir água em abundância nos tubos durante a eliminação de líquidos para prevenir a acumulação de azidas 10. O ProClin 300 pode causar sensibilização cutânea. Evitar entornar ou salpicar este reagente sobre a pele ou as roupas. Em caso de contacto com este reagente, lavar com abundante água e sabão. O antigénio de rubéola que reveste as partículas paramagnéticas foi submetido a um processo de purificação. Contudo, manusear e eliminar as embalagens de reagentes como material potencialmente infeccioso. A concentração de IgG anti-rubéola determinada numa dada amostra mediante ensaios fornecidos por diversos fabricantes pode variar por causa das diferenças dos métodos de ensaio e da especificidade dos reagentes. A Folha dos Dados de Segurança do Material (MSDS) está disponível a pedido. 1. Soro é a amostra aconselhada. Para a avaliação do estado imunológico, colher uma única amostra de soro. Para a avaliação da seroconversão causada por infecção recente (a conversão do soro dum único doente de negativa para positiva), colher duas amostras de soro a três semanas de distância uma da outra e testar ambos os soros na mesma execução. 2. Seguir as recomendações abaixo para manusear, analisar e armazenar amostras de sangue 11 : Colher todas as amostras de sangue tomando as precauções habituais para a colheita venosa. Access Rubella IgG 386841A 2004 Beckman Coulter, Inc. Página 2

Deixar as amostras de soro coagularem completamente antes da centrifugação. Manter as provetas sempre fechadas. Dentro de duas horas após a centrifugação, transferir no mínimo 500 µl de amostra isenta de células para uma proveta de armazenamento. Tapar imediatamente a proveta com a rolha, apertando bem. Armazenar as amostras hermeticamente fechadas à temperatura ambiente (a 15 30 C) durante o máximo de oito horas. Se o ensaio não estiver pronto dentro de oito horas, refrigerar as amostra a 2 8 C. Se o ensaio não estiver pronto dentro de 48 horas, ou no caso de amostras a serem expedidas, congelar a -20 C ou a temperatura mais baixa. 3. Seguir as instruções abaixo para preparar as amostras, excepto quando indicado em contrário no folheto do produto: Certificar-se de que a fibrina e a matéria celular residuais tenham sido removidas antes da análise. Para a centrifugação, seguir as instruções do fabricante das provetas de colheita de sangue. Cada laboratório deve determinar a aceitabilidade das próprias provetas de colheita de sangue e dos produtos de separação do soro. Estes produtos podem variar entre fabricantes diferentes e, às vezes, de um lote para o outro. 4. Evitar ciclos repetidos de congelação e descongelação das amostras. Um estudo de 10 amostras séricas na faixa de 0 73 UI/mL (com seis amostras próximas do valor de cut-off) indica que as amostras podem ser congeladas e descongeladas no máximo três vezes. Materiais fornecidos R1 Kits de reagentes Access Rubella IgG Materiais necessários mas não fornecidos Comentários sobre o procedimento 1. Calibradores: Access Rubella IgG Calibrators Fornecido em zero e aproximadamente 10, 25, 50, 200 e 500 UI/mL. Nº Cat. 34435 2. Access Rubella IgG QC ou outro material de controlo de calidad disponível no mercado. Fornecido como um controlo negativo e um controlo positivo baixo (média objectivo de 22 43 UI/mL). Nº Cat. 34439 3. Substrato: Access Substrate Nº Cat. 81906 4. Tampão de lavagem: Access Wash Buffer Nº Cat. 81907 (Access, Access 2, SYNCHRON LX i) Nº Cat. 8547197 (UniCel DxI) 1. Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para uma descrição específica da instalação, inicialização, princípios de funcionamento, características de desempenho do sistema, instruções de funcionamento, procedimentos de calibração, limitações operacionais e precauções, riscos, manutenção e solução de problemas. 2. Misturar o conteúdo das embalagens novas (vedadas) de reagentes invertendo delicadamente a embalagem várias vezes antes de carregá-la no aparelho. Não inverter embalagens abertas (perfuradas). 3. Usar vinte (20) µl de amostra para cada determinação além dos volumes mortos do recipiente da amostra e do sistema. Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para o volume mínimo de amostra necessário. 4. Indicar os resultados das amostras em UI/mL ou como reactiva ou não reactiva. Consultar a secção Resultados para maiores informações sobre como indicar os resultados. 2004 Beckman Coulter, Inc. 386841A Access Rubella IgG Página 3

Procedimento Detalhes de calibração Controlo de qualidade Resultados Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para obter informações sobre a gestão das amostras, a configuração dos testes, a solicitação de testes e a visualização dos resultados dos testes. Para todos os testes, é necessário ter uma curva de calibração activa. Para o ensaio Access Rubella IgG, a calibração é necessária a cada 28 dias. Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para obter informações sobre os métodos de calibração, a configuração de calibradores, a introdução de solicitações de testes dos calibradores e a visualização de dados de calibração. Os materiais de controlo de qualidade simulam as características das amostras dos doentes e são fundamentais para a monitorização do desempenho do sistema de análises imunoquímicas. Dado que as amostras podem ser analisadas a qualquer momento utilizando um formato de acesso aleatório em vez dum formato por lote, é aconselhável utilizar os materiais de controlo de qualidade a cada 24 horas 12. Utilizar controlos de qualidade Access Rubella IgG QC ou outros materiais de controlo de qualidade disponíveis no mercado que cubram pelo menos dois níveis de analito. Se o programa de controlo de qualidade do laboratório o exigir, acrescentar outros controlos de qualidade como indicado pelos órgãos de regulamentação competentes. Utilizar os controlos de qualidade de acordo com os requisitos das respectivas organizações de credenciamento (para as definições adequadas dos QC nos E.U.A., consultar o NCCLS, documentos C24-A2, I/LA18-A e I/LA6-A). Os utilizadores devem consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para informações sobre o uso das funções do Controlo de Qualidade e para a selecção das regras de QC. Nos E.U.A., sugere-se o uso da regra 1-3s de QC para um controlo de qualidade reactivo baixo. Os resultados do controlo de qualidade que não estiverem dentro dos limites aceitáveis, podem indicar resultados de testes não válidos. Examinar todos os resultados dos testes obtidos desde o último ponto de teste de controlo de qualidade aceitável para este analito. Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para informações sobre como visualizar os resultados do controlo de qualidade. Os resultados dos testes dos doentes são determinados automaticamente pelo software do sistema utilizando um modelo matemático smoothing spline. A quantidade de analito na amostra é determinada a partir da produção de luz medida através dos dados de calibração armazenados no sistema. Os resultados dos testes dos doentes podem ser visualizados através do ecrã apropriado. Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para as instruções completas sobre como visualizar os resultados das amostras. O valor de cut-off de 15 UI/mL foi obtido através da calibração com a Segunda Preparação Padrão Internacional da OMS e de um estudo comparativo de 212 amostras caracterizadas pelo teste HAI. Dado que a detecção do estado de não imunidade é, clinicamente, mais importante, um valor de cut-off de 15 UI/mL foi seleccionado para garantir a especificidade necessária para a determinação da imunidade. Curvas Receptor-Operador (ROC) características foram utilizadas para a selecção do valor de cut-off de 15 UI/mL. Todas as amostras de teste < 10 UI/mL são consideradas não reactivas para a presença de anticorpos IgG anti-rubéola. Os pacientes que apresentarem estes resultados são considerados sem imunidade. Concentrações entre 10 UI/mL e < 15 UI/mL são consideradas duvidosas para a determinação da imunidade à rubéola. Alguns estudos indicam que os indivíduos vacinados que apresentam estes níveis baixos de IgG anti-rubéola demonstram, efectivamente, uma resposta imunitária secundária após a revacinação, mas não entraram em contacto com o vírus livre da rubéola 5. Neste caso, é aconselhável colher uma amostra de follow-up para uma avaliação mais aprofundada do estado imunitário. Se esta amostra ainda resultar duvidosa, pode ser necessário testá-la com outros métodos. Todas as amostras de teste 15 UI/mL são consideradas reactivas para a presença de Access Rubella IgG 386841A 2004 Beckman Coulter, Inc. Página 4

anticorpos IgG anti-rubéola e indicam infecção aguda ou pregressa, ou vacinação. O método seguinte é o recomendado para o registo dos resultados obtidos: Os seguintes resultados foram obtidos com o teste EIA Access Rubella IgG. Apesar da calibração ser realizada através duma preparação de referência, os valores obtidos com métodos de análise de fabricantes diferentes não podem ser alternados. A grandeza do nível de IgG indicado não pode estar relacionada com um título de ponto final. As amostras podem ser medidas com precisão dentro do intervalo de variação linear do ensaio (aproximadamente 10 500 UI/mL). Se uma amostra contém < 10 UI/mL, registe os resultados como não reactivos. Se uma amostra contém 15 UI/mL, registe o resultado como positivo (ou reactivo) para a IgG anti-rubéola. Se uma amostra contém mais do que o valor estabelecido do calibrador Access Rubella IgG Calibrator (S5) mais alto, registe o resultado como maior que o valor (isto é, aproximadamente > 500 UI/mL). Em alternativa, diluir um volume de amostra com 9 volumes do calibrador Access Rubella IgG Calibrator S0 (zero). Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou sistema de Ajuda para informações sobre como introduzir uma diluição de amostra numa solicitação de teste. O sistema indicará os resultados ajustados para a diluição. O significado dos valores de UI/mL acima do valor de cut-off e o que constitui um aumento significativo no nível de anticorpos entre amostras de doentes agudos e convalescentes não foi determinado. Para os doentes com suspeita de seroconversão no estádio inicial ou recente, deve-se colher uma segunda amostra sérica três semanas mais tarde e avaliá-la juntamente com a primeira amostra sérica para o título de anticorpos IgG contra o vírus da rubéola. Para as amostras séricas emparelhadas ou em série, uma conversão da concentração de anticorpos IgG anti-vírus da rubéola de não reactiva para reactiva entre a primeira e a segunda amostra de soro deve ser considerada como evidência de seroconversão causada por infecção recente. Para amostras emparelhadas com valores > 200 UI/mL, pré-diluir ambas as amostras a < 200 UI/mL antes da interpretação dos resultados. O laboratório também deve avaliar as amostras para a presença dum nível significativo de anticorpos IgM anti-rubéola para obter dados serológicos adicionais que auxiliem o diagnóstico duma infecção recente. Durante o follow-up serológico de mulheres grávidas negativas para as IgG anti-rubéola, também é recomendado medir as IgM anti-rubéola, já que é possível que o aparecimento das IgG anti-rubéola possa ser ligeiramente retardado em relação ao aparecimento das IgM anti-rubéola durante ou após uma infecção recente. Níveis estáveis de anticorpos IgG entre duas amostras não excluem a possibilidade duma seroconversão recente. Tabela 1: Exemplos de resultados do teste Rubella IgG com soros simples. Amostra sérica Resultado (UI/mL) Interpretação Soro 1 0,4 Não reactivo; não imune. Soro 2 13,3 Duvidoso: anticorpo específico da rubéola presente, fazer outras avaliações para determinar o estado imunitário do paciente. Soro 3 21,5 Reactivo. Soro 4 264,3 Reactivo. Soro 5 > 470,0 Reactivo. 2004 Beckman Coulter, Inc. 386841A Access Rubella IgG Página 5

Tabela 2: Exemplos de resultados de testes com amostras emparelhadas ou em série. Paciente Amostra Resultado (UI/mL) Interpretação 1 1 0,1 Evidência de seroconversão. 2 310,1 2 1 0,1 Evidência de seroconversão. 2 9,5 3 65,7 4 116,2 3 1 0,2 Nenhuma evidência de seroconversão. 2 1,0 4 1 55,6 No Evidence of Seroconversion. 2 57,8 5 1 0,4 Evidência de seroconversão. 2 58,9 3 118,9 Limitações do procedimento 1. O intervalo de variação linear do ensaio é de aproximadamente 10-500 UI/mL. Consultar a secção Resultados para informações sobre a interpretação e a indicação de resultados. 2. Nos ensaios que utilizam anticorpos murinos, podem ocorrer interferências com os anticorpos anti-rato humanos (HAMA) contidos na amostra. Os anticorpos anti-rato humanos (HAMA) podem estar presentes nas amostras de doentes submetidos a imunoterapia ou procedimentos de diagnóstico que utilizam anticorpos monoclonais 13,14 ou em indivíduos que tiveram contacto regular com animais. Além disso, outros anticorpos heterófilos, tais como os anticorpos anticabra humanos podem estar presentes nas amostras dos doentes. 3. Os resultados do Access Rubella IgG devem ser interpretados baseando-se no quadro clínico geral do doente, incluindo: os sintomas, a anamnese clínica, os dados de outros testes e outras informações apropriadas. O diagnóstico duma infecção recente pelo vírus da rubéola pode ser estabelecido apenas com base na combinação de critérios clínicos e serológicos. O resultado duma única amostra de soro não constitui prova suficiente para o diagnóstico duma infecção recente. 4. A presença de anticorpos IgM dirigidos contra o vírus da rubéola deve também ser avaliada como parte do controlo serológico de indivíduos com suspeita de infecçáo pelo vírus da rubéola, pois o aparecimento de anticorpos IgG anti-rubéola pode ocorrer ligeiramente mais tarde do que o dos anticorpos IgM anti-rubéola. 5. No caso de indivíduos imunocomprometidos e de algumas condições, tais como infecção grave e terapêutica com medicamentos imunossupressores, pode ocorrer o abaixamento dos níveis de anticorpos abaixo do limiar de detecção do ensaio. 6. As características de desempenho do ensaio não foram estabelecidas para os testes realizados em recém-nascidos ou com sangue do cordão umbilical. 7. As características de desempenho do ensaio não foram estabelecidas usando soros emparelhados (de doentes agudos ou convalescentes) para determinar uma mudança significativa no título das IgG. Para resultados melhores, pré-diluir os soros emparelhados com valores maiores que 200 UI/mL para obter valores menores que 200 UI/mL. 8. O significado dos valores UI/mL acima do cut-off e o que constitui um aumento significativo de anticorpos entre as amostras de doentes na fase aguda e em convalescença não foi determinado. 9. As características de desempenho do ensaio ainda não foram definidas para soros contendo factor reumatóide ou ANA. Valores esperados A rubéola tem uma difusão mundial e, em geral, ocorre com mais frequência nos meses do Inverno e da Primavera. As taxas de incidência variam com o ciclo epidémico, o número de indivíduos susceptíveis duma população e o contacto interpessoal no interior do grupo. A Access Rubella IgG 386841A 2004 Beckman Coulter, Inc. Página 6

doença é mais difusa entre as crianças de 5 a 9 anos de idade 2. Estudos serológicos em algumas áreas demonstram que até a 95% das mulheres grávidas são seropositivas. Muitos países já implementaram um programa de imunização de rotina para crianças de aproximadamente 15 meses de idade. A prevalência de resultados reactivos para anticorpos IgG anti-rubéola foi de 85% como determinado a partir de 414 amostras séricas provenientes de uma população saudável dadora de sangue da cidade de Memphis (E.U.A.) utilizando o ensaio Access Rubella IgG. A distribuição dos resultados é fornecida no seguinte histograma. 120 100 Access Rubella IgG: Rastreio duma população de dadores de sangue americana. Frequência 80 60 40 20 0 Características específicas de desempenho 0 1 2 4 6 8 10 11 12 13 Access Rubella IgG UI/mL Comparação de métodos Na França, dois centros independentes avaliaram o desempenho clínico do ensaio Access Rubella IgG em comparação com o teste HAI utilizando o Sistema de Imunoensaio Access, testando um total de 784 pacientes. Para o centro 1, 399 das amostras eram de mulheres grávidas acompanhadas no âmbito da investigação serológica obrigatória para mulheres grávidas em França que inclui a monitorização mensal das gestantes que resultam seronegativas. Onze das amostras do centro 1 (todas provenientes de gestantes) resultaram equívocas e foram excluídas dos cálculos dos resultados. Para o centro 2, 290 amostras eram de mulheres grávidas. Dez das amostras do centro 2 (todas mulheres, 8 grávidas) resultaram equívocas e foram excluídas dos cálculos dos resultados. As amostras prospectivas provinham duma população normal consistindo em 28 mulheres grávidas, 18 mulheres não grávidas e 4 homems. Nestes estudos, foram utilizadas amostras retrospectivas (congeladas) para obter mais rapidamente o número desejado de amostras reactivas e não reactivas e, assim, obter dados suficientes para avaliar o ensaio. Estas amostras podem ter sido submetidas a ciclos repetidos de congelação/descongelação. Num estudo interno, verificou-se que o desempenho do ensaio não foi afectado pelo uso de amostras recém-colhidas em relação às congeladas/descongeladas (no máximo três vezes). As sensibilidades e as especificidades relativas e os respectivos intervalos de confiança de 95% são fornecidos na Tabela 3 para as amostras recém-colhidas e congeladas. As estimativas indicadas para a sensibilidade são as melhores estimativas das sensibilidades relativas deste produto de acordo com os dados recolhidos. Dum intervalo de confiança de 95% elaborado a partir desses dados, pode-se esperar a sensibilidade relativa com uma probabilidade de 95%. As amplitudes dos intervalos de confiança de 95% indicados para a sensibilidade dependem quase exclusivamente do número de positivos tomados como amostra. 14 15 16 18 20 25 50 75 100 200 300 2004 Beckman Coulter, Inc. 386841A Access Rubella IgG Página 7

Tabela 3: Access comparado com HAI. HAI + + + n Access + EQ EQ + Sensibilidade relativa (%) 95% Int. de confiança Especificidade relativa (%) 95% Int. de confiança Centro 1 385 Congeladas 280 0 1 10 1 93 100 98,7 100 99 94,2 100 Centro 1 25 Recém-colhidas 22 0 0 0 0 3 100 84,6 100 100 29,2 100 Centro 2 349 Congeladas 264 10 10 0 0 65 96 93,4 98,2 100 94,5 100 Centro 2 25 Recém-colhidas 20 0 0 0 0 5 100 83,2 100 100 47,8 100 TOTAL 784 586 10 11 10 1 166 98 96,9 99,2 99 96,7 100 A Tabela 4 mostra os resultados das populações grávidas e não grávidas (homens e mulheres) de ambos os centros. No centro 1, havia um paciente recém-nascido e um paciente de sexo desconhecido que não foram incluídos. Estas duas amostras não apresentaram discordância e eram reactivas quer ao teste Access, quer ao HAI. Tabela 4: População grávida/não grávida. HAI + + + n Access + EQ EQ + Sensibilidade relativa (%) 95% Int. de confiança Especificidade relativa (%) 95% Int. de confiança Centro 1 399 Grávida 291 0 1 10 1 96 100 98,7 100 99 94,4 100 Centro 2 290 Grávida 216 10 8 0 0 56 96 92 97,9 100 93,6 100 Centro 1 5 Mulheres 5 0 0 0 0 0 100 47,8 100 NA NA Centro 1 4 Homens 4 0 0 0 0 0 100 39,8 100 NA NA Centro 2 75 Mulheres 64 0 2 0 0 9 100 94,4 100 100 66,4 100 Centro 2 9 Homens 4 0 0 0 0 5 100 39,8 100 100 47,8 100 TOTAL 782 584 10 11 10 1 166 98 96,9 99,2 99 96,7 100 A distribuição de todas as 784 amostras clínicas da comparação com o teste HAI é fornecida no histograma abaixo. Verificaram-se 177 amostras negativas e 607 amostras positivas ao teste HAI. 100 90 80 Distribuição das amostras do estudo clínico (2 centros) Comparação com HAI 144 172 HAI negativo HAI positivo Freqüência 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 4 6 8 9 10 11 12 Rubella IgG (UI/mL) O teste Access Rubella IgG foi comparado com um outro teste EIA disponível no comércio utilizando 306 amostras retrospectivas num centro do oeste americano. Destas amostras, 181 13 14 15 16 18 20 25 50 75 100 200 300 Access Rubella IgG 386841A 2004 Beckman Coulter, Inc. Página 8

foram identificadas como reactivas por ambos os testes e 79 foram identificadas como não reactivas por ambos os testes. As restantes 46 amostras resultaram reactivas ao teste EIA e não reactivas ao teste Access. Das 44 amostras discordantes, analisadas posteriormente com um ensaio de aglutinação do látex, 25 corresponderam com o teste Access. Resultados do painel CDC As seguintes informações referem-se a um painel de soros proveniente do Center for Desease Control e testado por um centro externo utilizando o ensaio Access Rubella IgG. Os resultados são apresentados com o objectivo de fornecer maiores informações sobre o desempenho deste ensaio com um painel de soros caracterizado e mascarado. Isto não significa que o CDC reconheça o ensaio. O painel consiste em 82 soros positivos e 18 soros negativos. O ensaio Access Rubella IgG demonstrou 100% de concordância total com os resultados do CDC, houve 100% de concordância com as amostras positivas e 100% de concordância com as amostras negativas. Resultados do Padrão Biológico CDC O padrão biológico CDC do soro de referência humano anti-rubéola de baixo título (21,0 UI/mL) foi testado puro e diluído 1:2 como descrito no documento I/LA6-A do NCCLS em três centros externos. A média dos resultados dos três centros utilizando o ensaio Access Rubella IgG foi de 25,1 UI/mL para a amostra pura e 11,8 UI/mL para a diluição 1:2. Estudos sobre a Resposta Imunitária Para avaliar a resposta imunitária, foram testadas amostras múltiplas colhidas de pacientes afectados por uma infecção recente de rubéola ou vacinados. A evidência duma infecção aguda por rubéola foi confirmada em 38 dos 44 indivíduos por um resultado reactivo do teste dos anticorpos IgM anti-rubéola. O centro 1 testou 23 amostras provenientes de 15 pacientes com infecção de rubéola recente e 22 amostras provenientes de pacientes recentemente vacinados. O centro 2 testou 21 amostras provenientes de 10 pacientes com infecção de rubéola recente e 15 amostras provenientes de pacientes recentemente vacinados. O centro 3 testou 21 amostras em seroconversão provenientes de 3 painéis de pacientes adquiridos de fornecedores de soro. O aumento na IgG anti-rubéola, medido pelo ensaio Access Rubella IgG, coincidiu com os títulos em aumento de IgG anti-rubéola detectados por um teste de comparação. Das 74 amostras reactivas, como determinado pelo método de comparação, o teste Access Rubella IgG identificou 67 como reactivas, um como duvidosa e seis como não reactivas. Das 28 amostras não reactivas, como determinado pelo método de comparação, o teste Access Rubella IgG identificou dos duvidosos e 26 não reactivos. As informações clínicas e outros resultados do teste disponíveis sobre as nove amostras discordantes são apresentados na Tabela 5. 2004 Beckman Coulter, Inc. 386841A Access Rubella IgG Página 9

Tabela 5: Amostras discordantes Paciente Informazioni cliniche Titolo HAI* Resultado do teste EIA Access Rubella IgG Resultado do segundo teste EIA das IgG anti-rubéola Resultado das IgM anti-rubéola Resultado do teste de Aglutinação do látex* 455 3 giorni dopo l eruzione cutanea 1:32 positivo 12,1 IU/mL duvidoso 35 IU/mL positivo positivo > 10 positivo BOU Tinha erupção cutânea 1:32 positivo não reactivo não efectuado positivo > 10 positivo 456 Antes da erupção cutânea 1:8 positivo não reactivo não efectuado negativo < 10 negativo 461 Antes da erupção cutânea 1:8 positivo não reactivo 4,5 IU/mL negativo negativo < 10 negativo 450 Não disponível 1:8 positivo não reactivo não efectuado negativo > 10 positivo 458 Antes da erupção cutânea 1:32 positivo não reactivo 0,8 IU/mL negativo duvidoso < 10 negativo 447 Antes da vacinação 1:128 positivo não reactivo 0,0 IU/mL negativo negativo < 10 negativo T37581 Não disponível não efectuado 13,8 IU/mL duvidoso G40955 Não disponível não efectuado 13,6 IU/mL duvidoso negativo positivo não efectuado negativo positivo não efectuado * Os testes HAI e de Aglutinação do látex detectam quer as IgM, quer as IgG As amostras BOU e 455 provêm de pacientes com erupção cutânea ou apenas três dias após a erupção. Estas amostras resultaram positivas às IgM, mas a seroconversão era demasiado recente para serem reactivas às IgG. Como o resultado Access era não reactivo na amostra antes da erupção para o paciente 455, o resultado Access duvidoso na amostra três dias após erupção cutânea indica um aumento do título de IgG. As amostras 456, 461, 458 e 447 provêm de pacientes antes da erupção cutânea ou da vacinação. Nenhum outro resultado de análise destas amostras confirma o resultado positivo no teste HAI. A amostra 450 deriva duma seroconversão muito precoce como indicado pelos resultados positivos (com valor de cut-off de 1:8) dos testes HAI e de aglutinação do látex. Os níveis de IgG estão a aumentar (9,1 UI/mL) mas ainda não são positivos. A colheita posterior deste indivíduo efectuada dois meses mais tarde resultou definitivamente positiva com um título HAI de 1:256 e um valor de 210 UI/mL ao teste Access Rubella IgG. Para as amostras T37581 e G40955, esta colheita é a realizada logo antes da colheita na qual o segundo teste EIA converte de negativo para positivo. Os resultados IgM são positivos indicando que a seroconversão está em realização. Considerando que a seroconversão nesta população de amostras foi muito precoce e o facto que os níveis de IgG aparecem após os níveis de IgM, detectados pelo teste HAI, o desempenho do ensaio Access Rubella IgG para a determinação da resposta imunitária em amostras de soro foi muito bom. Recuperação da diluição (linearidade) Linearidade com o Padrão da OMS Cinco diluições do segundo Padrão Internacional da OMS para o soro anti-rubéola foram testadas em triplicado. Um dos três replicados da diluição de 400 UI/mL estava acima do intervalo de variação. Para evitar influenciar a regressão linear, nenhum dos replicados desta diluição foram incluídos no gráfico linear mostrado abaixo. Access Rubella IgG 386841A 2004 Beckman Coulter, Inc. Página 10

Access Rubella IgG: Diluição com Padrão da OMS 500 450 400 350 Access UI/mL 300 250 200 150 100 50 Inclinação = 0,97 Interceptação = 3,23 r 2 = 0,98 Access Regressão Amostras acima do intervalo 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 OMS (UI/mL) Linearidade com as Amostras de pacientes Acima do intervalo Cinco amostras de pacientes acima do intervalo foram diluídas 1:2, 1:4 e 1:8 e testadas em triplicado em três ensaios diferentes. Os valores esperados para cada amostra de paciente eram a média da diluição 1:2. Todos os valores observados para as cinco amostras são apresentados abaixo. A linha de regressão é calculada usando dados exclusivamente das diluições que não apresentaram resultados de amostras acima do intervalo. Access Rubella IgG: Cinco amostras e diluições 500 450 400 350 Inclinação = 0.95 Interceptação = 7.84 r 2 = 0.90 Observado UI/mL 300 250 200 150 100 50 Access Regressão Amostras acima do intervalo Intervalo de confiança 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Esperado UI/mL 2004 Beckman Coulter, Inc. 386841A Access Rubella IgG Página 11

Imprecisão Três centros (um interno e dois externos) testaram dois controlos de qualidade e quatro amostras em triplicado, duas vezes por dia por três dias utilizando o Sistema de Imunoensaio Access. Realizou-se uma calibração no início do estudo. A imprecisão da amostra não reactiva foi calculada a partir das unidades relativas de luz (URL), enquanto todos os outros cálculos utilizaram os valores UI/mL. Os resultados são resumidos na Tabela 6.. Tabela 6: Imprecisão dos três centros para o teste Access Rubella IgG. Intra-execução Intra-centro Imprecisão total Nível n Média DP %CV DP %CV DP %CV QC1 (RLU) 54 44139 6514 14,8 6426 14,6 7178 16,3 QC2 54 43,9 2,5 5,7 2,6 5,9 2,6 5,9 P2 53 286,5 26,0 9,1 30,7 10,7 33,3 11,6 P3 54 416,4 27,7 6,7 45,6 11,0 48,4 11,6 P4 54 16,8 0,6 3,8 1,0 6,0 1,4 8,2 P6 54 75,6 2,5 3,2 4,1 5,4 4,4 5,8 Reprodutibilidade de lote a lote Para cada lote do produto abaixo, foram testados um replicado de 20 amostras de pacientes não reactivas (seleccionadas num banco de 60 amostras de pacientes não reactivas) e duplicados de cinco amostras de pacientes reactivas. Todas as 60 amostras de pacientes não reactivas testadas resultaram não reactivas no ensaio Access Rubella IgG. Os resultados para as amostras de pacientes reactivas (em UI/mL) são apresentados abaixo. Tabela 7: Reprodutibilidade de lote a lote Amostra do paciente Lote P16 P2 P3 P9 P13 490211 14 52 119 280 > 459 16 52 126 245 > 459 490213 13 47 123 225 > 458 12 49 111 251 > 458 490214 13 45 106 195 450 12 46 102 202 > 458 490215 15 60 129 283 > 458 15 59 138 306 > 458 590216 17 65 199 373 > 500 14 56 156 364 > 500 Especificidade analítica / Interferências Amostras com adições artificiais que indicam até a 9 g/dl de albumina, 20 mg/dl de bilirrubina, 3600 mg/dl de trioleína e 2000 mg/dl de hemoglobina não afectam a concentração medida dos anticorpos IgG anti-rubéola detectados. As seguintes amostras foram avaliadas e consideradas não reactivas no ensaio Access Rubella IgG indicando a ausência de reactividade cruzada e/ou reactividade não específica com estas amostras. Os resultados não reactivos do teste Access Rubella IgG foram confirmados com um outro método EIA para a determinação das IgG anti-rubéola. Access Rubella IgG 386841A 2004 Beckman Coulter, Inc. Página 12

Tabela 8: Reactividade cruzada e interferência Número Tipo de amostra 16 amostras de IgG anti-cmv 17 amostras de IgG anti-ebv-vca 2 amostras de IgM anti-ebv-vca 16 amostras de IgG anti-hsv 1 12 amostras de IgG anti-hsv 2 5 amostras de IgG anti-sarampo 7 amostras de IgM anti-sarampo 7 amostras de IgG anti-toxoplasmose Comparação do Access Rubella IgG no UniCel DxI e no Sistema Access 2 Um estudo comparou o desepenho do teste Access Rubella IgG no sistems DxI e no Sistema Access 2. 136 amostras séricas, incluindo amostras reactivas e não reactivos situadas em todo o intervalo de análise, foram analisadas em duplicado. Os resultados deste studo estão resumidos na Tabela 9. Tabela 9: UniCel DxI versus Access 2 Access 2 + ± - Total + 75 1 0 76 Precentagem de concodância positiva= 100% (75/75) DxI ± 0 7 4 11 Percentagem de concordância negativa = 92,5% (49/53) - 0 0 49 49 Precentagem de concordância total = 96,3% (131/136) Total 75 8 53 136 2004 Beckman Coulter, Inc. 386841A Access Rubella IgG Página 13

TM RUBELLA IgG CALIBRATORS REF 34435 Finalidade do produto Resumo e explicação do produto Padronização Informações sobre o produto Os calibradores Access Rubella IgG Calibrators devem ser utilizados para calibrar o ensaio Access Rubella IgG para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos IgG dirigidos contra o vírus da rubéola no soro humano utilizando os Sistemas de Imunoensaio Access. A calibração dum ensaio quantitativo é o processo pelo qual as amostras com concentrações conhecidas de analito (por ex., calibradores de ensaio) são testadas como amostras de doentes a fim de medir a sua resposta. A relação matemática entre as respostas medidas e as concentrações conhecidas de analito define a curva de calibração. Esta relação matemática, ou curva de calibração, é utilizada para converter as medições URL (Unidade Relativa de Luz) de amostras de doentes em concentrações quantitativas específicas de analito. A substância a ser medida (analito) nos calibradores Access Rubella IgG Calibrators tem como referência a Segunda Preparação Padrão Internacional da OMS para o Soro anti-rubéola (2º ISP). O processo de padronização baseia-se na norma pren ISO 17511. Os valores atribuídos foram estabelecidos usando amostras representativas deste lote de calibrador e são específicos para as metodologias de ensaio dos reagentes Access. Os valores atribuídos por outras metodologias podem ser diferentes. Tais diferenças, se presentes, podem ser causadas por desvios entre os métodos. Access Rubella IgG Calibrators Nº Cat. 34435: S0 S5, 1,0 ml/recipiente Fornecidos prontos para utilizar. Armazenar em posição vertical e refrigerar a 2 10 C. Misturar o conteúdo invertendo delicadamente antes da utilização. Evitar a formação de bolhas. Estável até ao vencimento do prazo de validade marcado na etiqueta quando armazenado a 2 10 C. Em geral, a estabilidade do recipiente aberto dura até ao vencimento do prazo de validade marcado na etiqueta do recipiente, quando armazenado e manuseado de maniera adequada. Uma possível degradação pode ser indicada por valores de controlo fora do intervalo de variação.. S0: Soro equino contendo 0 UI/mL de IgG anti-rubéola e < 0,1% de azida sódica. S1, S2,S3, S4, S5: Cartão de calibração Soro equino e soro humano contendo aproximadamente 10, 25, 50, 200 e 500 UI/mL de IgG humanas anti-rubéola e < 0,1% de azida sódica. 1 Avisos e precauções Para utilização em diagnóstico in vitro. O material de origem humana utilizado na preparação do reagente foi testado e considerado não reactivo ao antigénio de superfície da Hepatite B (HBs Ag), aos anticorpos do vírus da Hepatite C (HCV) e aos anticorpos do vírus da Imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2). Access Rubella IgG 386841A 2004 Beckman Coulter, Inc. Página 14

Dado que nenhum método de ensaio conhecido pode oferecer a segurança completa da ausência de agentes infecciosos, manusear os reagentes e as amostras dos doentes como potencialmente infecciosos 15. A azida sódica pode reagir com as canalizações de chumbo ou cobre formando azidas metálicas altamente explosivas. Portanto, deixar fluir água em abundância nos tubos durante a eliminação de líquidos para prevenir a acumulação de azidas 10. A Folha dos Dados de Segurança do Material (MSDS) está disponível a pedido. Procedimento Detalhes da calibração Limitações do procedimento Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para obter informações sobre os métodos de calibração, a configuração de calibradores, a introdução de solicitações de testes dos calibradores e a visualização de dados de calibração. Os calibradores Access Rubella IgG Calibrators são fornecidos em seis níveis - zero e aproximadamente 10, 25, 50, 200 e 500 UI/mL ml preparados a partir de soro equino e soro humano positivos para as IgG anti-rubéola. Os dados de calibração do ensaio são válidos por 28 dias. Os calibradores são analisados em duplicado. Se forem notados sinais de contaminação microbiana ou excesso de turvação num reagente, rejeitar o recipiente. 2004 Beckman Coulter, Inc. 386841A Access Rubella IgG Página 15

TM RUBELLA IgG QC REF 34439 Finalidade do produto Resumo e explicação do produto Informações sobre o produto Os controlos de qualidade Access Rubella IgG QC são utilizados para monitorizar o desempenho do sistema do ensaio Access Rubella IgG. Os materiais dos controlos de qualidade simulam as características das amostras dos doentes e são fundamentais para a monitorização do desempenho do sistema do imunoensaio Access Rubella IgG. Para além disso, estes são uma parte integral das boas práticas de laboratório 12,16,17,18,19,20,21. Ao realizar testes com os reagentes Access para anticorpos IgG dirigidos contra o vírus da rubéola, utilizar materiais de controlo de qualidade para validar a integridade dos ensaios. Se o sistema de análise funciona correctamente, os valores testados devem estar dentro dos intervalos de variação aceitáveis. Access Rubella IgG QC Nº Cat. 34439: 2,5 ml/recipiente, 3 recipientes por nível Fornecidos prontos para utilizar. Armazenar em posição vertical e refrigerar a 2 10 C. Misturar o conteúdo invertendo delicadamente antes da utilização. Evitar a formação de bolhas. Estável até ao vencimento do prazo de validade marcado na etiqueta quando armazenado a 2 10 C. Depois de abertura, os recipientes permanecem estáveis por 30 dias, quando manuseados e armazenados correctamente. Uma possível degradação pode ser indicada por valores de controlo fora do intervalo de variação. Consultar o cartão de valores QC para os valores médios e os desvios padrão (DP).. QC 1: QC 2 Cartão de valores QC: Soro humano com < 0,1% de azida sódica; contém níveis não detectáveis de IgG anti-rubéola testados utilizando o ensaio Access Rubella IgG. Soro humano com < 0,1% de azida sódica; contém níveis baixos de IgG anti-rubéola (média objectivo de 22 43 UI/mL) testados utilizando o ensaio Access Rubella IgG. 1 Avisos e precauções Para utilização em diagnóstico in vitro. O material de origem humana utilizado na preparação do reagente foi testado e considerado não reactivo ao antigénio de superfície da Hepatite B (HBs Ag), aos anticorpos do vírus da Hepatite C (HCV) e aos anticorpos do vírus da Imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2). Dado que nenhum método de ensaio conhecido pode oferecer a segurança completa da ausência de agentes infecciosos, manusear os reagentes e as amostras dos doentes como potencialmente infecciosos 15. A azida sódica pode reagir com as canalizações de chumbo ou cobre formando azidas metálicas altamente explosivas. Portanto, deixar fluir água em abundância nos tubos durante a eliminação de líquidos para prevenir a acumulação de azidas 10. Access Rubella IgG 386841A 2004 Beckman Coulter, Inc. Página 16

A Folha dos Dados de Segurança do Material (MSDS) está disponível a pedido. Procedimento Limitações do procedimento Valores esperados Determinar a concentração de anticorpos IgG dirigidos contra o vírus da rubéola nos materiais do controlo de qualidade Access Rubella IgG QC usando o Sistema de Imunoensaio Access da mesma forma utilizada para uma amostra do doente. Consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para obter informações sobre os métodos dos controlos de qualidade, a configuração de controlos, a introdução de solicitações de testes de amostras de controlo de qualidade e a visualização dos dados dos controlos de qualidade. 1. Os controlos de qualidade devem ser executados dentro dum período de 24 horas antes da análise das amostras dos pacientes. 2. Se o programa de controlo de qualidade do laboratório o exigir, acrescentar outros controlos de qualidade como indicado pelos órgãos de regulamentação competentes. Utilizar os controlos de qualidade de acordo com os requisitos das respectivas organizações de credenciamento (para as definições adequadas dos QC nos E.U.A., consultar o NCCLS, documentos C24-A2, I/LA18-A e I/LA6-A). Os utilizadores devem consultar os respectivos manuais de sistema e/ou o sistema de Ajuda para informações sobre o uso das funções do Controlo de Qualidade e para a selecção das regras de QC. 3. Nos E.U.A., sugere-se o uso da regra 1-3s de QC para um controlo de qualidade reactivo baixo. 4. Os resultados do controlo de qualidade que não estiverem dentro dos limites aceitáveis, podem indicar resultados de testes não válidos. Examinar todos os resultados dos testes obtidos desde o último ponto de teste de controlo de qualidade aceitável para este analito. 5. Se forem notados sinais de contaminação microbiana ou excesso de turvação num reagente, rejeitar o recipiente. As médias esperadas (0) e os DP (σ) para os controlos Access Rubella IgG QC (QC1 e QC2) são fornecidos no cartão dos valores QC contido no kit para a configuração inicial do sistema de controlo de qualidade do ensaio Access Rubella IgG. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios critérios de aceitabilidade seleccionando as regras QC a serem aplicadas aos resultados dos controlos de qualidade. Os resultados de cada controlo de qualidade devem estar dentro do intervalo de variação inicial de aceitabilidade. Contudo, cada laboratório deve actualizar a média e o DP depois de ter recolhido dados suficientes 20,21. 2004 Beckman Coulter, Inc. 386841A Access Rubella IgG Página 17

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