Aulas passadas Células 1: Procariotos e eucariotos Células, tecidos e orgãos Reinos filogenéticos Compartimentalização em sistemas biológicos - rompimento e fracionamento celular
QBQ2451-2013 Célula 2: Marcadores químicos de organelas - microscopia Organelas: estrutura e função
Célula animal Cada organela tem uma função e produz proteínas específicas: marcadores Histonas/DNA Monômero de tubulina MAP4 (citoesqueleto) Enzima Golgi-residente humana N-acetilgalactosaminiltransferase-2 Calreticulina KDEL Hexoquinases Succinato desidrogenase (citoesqueleto) Myristoylation/palmitoylation Lck tyrosine kinase Receptores proteicos Diversas possibilidades de marcação de estruturas celulares para: 1. investigar as suas funções 2. localizá-las (identificação e isolamento) 3. acompanhar eventos celulares (influxo de Ca +2, reconhecimento, determinadas ações biológicas, p.ex.)
Técnicas de visualização/localização de estruturas celulares: microscopia Tipo de Microscopia Resolução Tipo de Feixe Ótica 0,2 Luz branca (visível) O que mede Luz absorvida ou refletida Estado da amostra Amostras molhadas ou fixadas microscopias de campo claro, campo escuro, fluorescência, contraste de fase Geralmente para células intactas Eletrônica (transmissão ou de varredura) 0,05 Feixe de elétrons Elétrons transmitidos, secundários, raios X Aumento de contraste: melhoria da imagem obtida! Amostras secas e fixadas visualizar organelas com grande definição e até mesmo estruturas intraorganelas. Também permite obter informações multidimensionais
(a) Microscópio óptico composto.(b) microscópios eletrônicos Tipos: microscopias de campo claro, campo escuro, fluorescência, invertida, de transmissão confocal (microscopia de varredura confocal) e de polarização.
Microscopia de campo claro Microscopia de contraste de fase Microscopia de campo escuro Largura média = 8-10 µm Dihidrocloreto de (4',6-diamidino-2-fenilindole: se liga a DNA
Corando/visualizando células
Marcadores químicos coloridos ou fluorescentes substituiram os radioisótopos Marcadores coloridos: aumento de contraste na microscopia de campo claro Marcadores fluorescentes fluorescência permite: maior sensibilidade variabilidade de cor possibilidade de supressão
Reveladores de organelas: corantes ou fluorescentes Compostos orgânicos que coram ou fluorescem estruturas nas células com base em suas naturezas químicas. Muitos: básicos: carregados + interação com estruturas carregadas (ác. nucleicos, carboidratos ácidos, superfícies celulares) Exemplos incluem: 1. Rastreador para mitocôndria 2. Corantes de ácidos nucleicos para núcleo 3. Lisorastreador e lisosensor para compartimentos ácidos 4. Corantes lipofílicos para membranas 5. Rastreador para retículo endoplasmático 6. Conjugados de ceramida para complexo de Golgi Células vivas LBPAE incubadas simultaneamente com: MitoTracker Deep Red FM -mitocôndrias LysoTracker Green DND-26 -lisossomas Hoechst 33342 - núcleolo
Exemplos de corantes: azul de metileno, cristal violeta, safranina Bactérias: Gram + ou -?
Para Complexo de Golgi N1154 NBD-ceramide D3521 BODIPY FL ceramide D7540 BODIPY TR ceramide Células vivas ou fixadas com aldeído
Para Mitocôndria Mais populares: M7510 MitoTracker Orange CMTMRos M7512 Mitotracker RED CMXROS 578/599 Add live and fix M22425 MitoTracker Red 580 580/644 M22426 MitoTracker Deep Red 633 640/662 Células vivas e fixáveis: M7514 MitoTracker Green FM Formas fluorogênicas reduzidas; menos retido; melhor para células vivas: M7511 MitoTracker Orange CM-H2TMRos M7513 MitoTracker Red CM-H2XRos Mais eficientes: Rhodamine 123 (R-302), TMRM (T668), TMRE (T-669). Though these remain popular. Formatted for High Content Screening/ HCS H10295 HCS Mitochondrial Health Kit
Para Retículo endoplasmático E34251 ER-Tracker Green E34250 ER-Tracker Red Boa fixação, mas sem permeabilização intensa D273 DiOC6(3) Usado para células vivas e fixadas com glutaraldeído Limitado para certos tipos de célula (corante dependente de concentração) Muito fototóxico ER-Tracker\u2122 Green
Para Núcleos celulares DAPI = Não são específicos para só um tipo de núcleo. Dependendo das condições de marcação, o corante também pode aparecer no citoplasma. Somente alguns entram em células vivas devido à polarização da membrana plasmática. H1399 Hoechst 33342 D1306 DAPI S7578 SYTO 16 S7575 SYTO 13 A1301 Acridine orange
Para Membrana Plasmática CellMask Orange CellMask Deep Red células 293 MSR marcadas por 1 min em meio completo, lavadas e submetidas à coleta de imagem ~100% de marcação do total de células após 1-10 min de incubação Aglutinina de germen de trigo AlexaFluor 594
Produção de organelas fluorescentes pq produzem proteinas recombinantes fluorescentes + 1) Experimentos de co-localização: localização de alvo intracelular de um bioativo 2) Tráfico celular 3) Indução ou repressão da expressão gênica células vivas ou mortas
Anticorpos marcados com fluorescentes (radioativos) X Etapas - Determinar sequência do antígeno/parte dela (peptídeo) produzida na célula de interesse (humana, p.ex.) - Produzir anticorpo 1º. contra o antígeno em coelho ou cavalo (o anticorpo 1o. não é marcado) -Produzir anticorpo 2º. (contra o 1º.) e marcá-lo -Ligar o 1º. com antígeno e anticorpo 2º. marcado com AF488 ao complexo (reconhece o anticorpo 1º. de coelho ou cavalo; não liga o antígeno humano) -Ligação dele ao anticorpo 1º. possibilita a visualização da organela associada ao antígeno Células mortas Anti-Calreticulina detectada com AF488 secundário, Mitotracker Red e DAPI (os últimos são referências na microscopia)
Possibilidades para estudar função ou localizar alvo de interesse em organelas celulares 1) Introdução de reveladores marcadores = corantes ou fluorescentes que reagem com proteínas específicas ou outros alvos moleculares, p. ex. ácidos nucleicos (mais indicados para localizar tais proteínas e alvos) 2) Detecção de proteínas específicas (antígenos) marcadores = anticorpos (mais indicados para entender função) 3) Uso de microscopias adequadas Células vivas ou fixadas! Cuidados para uso de células vivas (manter a sua integridade): 1) Garantir que o tecido (células) foi incubado em condições apropriadas 2) Usar o mínimo de reagente revelador 3) Se possível, não expor as células à excitação de luz, principalmente na presença de reagente revelador 4) Se não, usar a menor excitação de luz possível 5) Maximizar a sensibilidade de detecção antes de aumentar a excitação de luz.
Referências bibliográficas: 1) Invitrogen Corporation, Eugene OR. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/products-and-services/applications/cell- Analysis/Cellular-Imaging/Fluorescence-Microscopy-and-Immunofluorescence- IF/Organelle-Stains-for-Fluorescence-Imaging-Selection-Guide.html 2) http://www.sanidadanimal.info/cursos/inmun/segun2.htm 3) Nelson D.L & Cox M.M. Lenhinger Principles of Biochemistry, Fourth Edition, 2005 4) B. Alberts e col., Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 5th. Edition, Cap. 9, 2008 5) Microbiologia de Brock, M.T. Madigan, J.M. Martinko, P.V. Dunlap, D.P.Clark, 12ª. edição, 2010.