Microbiologia FFI0751 Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo Laboratório de Epidemiologia e Microbiologia Molecular (LEMiMo) Grupo de Cristalografia Profa. Dra. Nelma Regina Seginini Bossolan Grupo de Biofísica Molecular Sergio Mascarenhas
Microbiologia FFI0751 Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo LEMiMo Campus II Piso 1, sala 106 Ramal: 738654 ilanacamargo@ifsc.usp.br http://biologia.ifsc.usp.br/
Microbiologia Microbiologia como ciência; Impactos sobre o homem; Tipos de organismos estudados; Aula Parte I Células procarióticas e eucarióticas; Aula Parte II Microscopia de microrganismos
Microbiologia É a ciência que estuda os microrganismos um grande e diverso grupo de organismos microscópicos- que podem ser encontrados como células únicas ou grupamentos celulares. Diferente dos organismos macroscópicos, os microrganismos são em geral capazes de realizar seus processos vitais de crescimento, geração de energia e reprodução, sem depender de outras células. http://www.ufrgs.br/alimentus/pao/fermentacao/fer_crescimento01.htm
Microbiologia como ciência O que estuda? Como ciência biológica básica: microrganismos como modelos para estudo de funções celulares de organismos superiores; as bases físicas e químicas que permitiram o surgimento da vida provêm de estudos com microrganismos. Como ciência biológica aplicada: trata de questões práticas importantes da medicina, agricultura e indústria.
Microbiologia como ciência Meta dos microbiologistas Compreender como os microrganismos atuam Otimizar seus efeitos benéficos Minimizar atividades danosas
Impactos sobre o Homem 2004 Pearson Education, Inc.
Impactos sobre o Homem
Bactérias são usadas para recuperar metais valiosos de sucata de eletrônicos e rejeitos de minas Projeto FAPESP Coordenador Jorge Soares Tenório / USP 2010/51009-0 Recuperação de ouro de placas de circuitos impresso de computadores obsoletos através de processo bio-hidrometalúrgico Dez 2013
Impactos sobre o Homem
Tipos de organismos estudados Bactérias Anabaena sp, 600X, MEV Listeria monocytogenes (3000X, MEV) Halobacterium sp, 1600X, MEV
Fungos Aspergillus ustus, 600X, MEV Mucor sp, 400X, MEV Saccharomyces cerevisiae, 800X, MEV
Algas Volvox - Detalhe Volvox aureus, 40X, MO Spirogyra sp, 100X, MO
Protozoários Ameba - pinocitose Trypanosoma sp, 1000X, MEV Paramecium multimicronucleatum, 200X, MEV
Vírus Seres microscópios de natureza acelular Retrovirus HIV, 14.500X, TEM Vírus da hepatite B, 50.000X, MEV Vírus do mosaico do tabaco, 27.300X, MEV
Células Procarióticas e Eucarióticas Aula 1 - Parte I Microbiologia FFI0751 Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo
Procariotos x Eucariotos ribossomos Nucleóide citoplasma Membrana nuclear..... Membrana citoplasmática Complexo de Golgi Mitocôndria Membrana citoplasmática Parede celular Peroxissomo Lisossomo Espaço periplasmático Membrana externa Retículo endoplasmático rugoso Vesícula secretória Organelas estruturas delimitadas por membrana
Procariotos x Eucariotos Mitocôndrias Cloroplastos
Tamanho: 0,2 a 2 µm Procariotos
Eucariotos Eucariotos Tamanho: 10 a 100 µm Organelas delimitadas por membrana
Eucariotos Célula eucariotas (algas, fungos e plantas) parede celular: composta pelo polissacarídeo quitina além de glicana e manana (fungos), ou celulose (plantas). Protozoários não tem PC, mas tem película Animais contém o glicocálice (carboidratos adesivos)
Eucariotos
Comparação entre os tamanhos
Procariotos x Eucariotos http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter1.htm http://www.fortunecity.com/greenfield/eco/813/mod2aula4.html Trypanosoma em esfregaço sanguíneo. A membrana ondulante e o núcleo são visíveis. Rickettsia ricketsi dentro de células do sangue (bactéria). http://anhembi.br/publique/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?infoid=1758&sid=203
Procariotos x Eucariotos Células da mucosa vaginal Célula superficial, cujo citoplasma é avermelhado e cujo núcleo é picnótico, entre duas células intermediárias. Há grande quantidade de bacilos de Döederlein. http://www.pathology.com.br/papanicolaou/papanicolaou.html http://clubeaprendiz.googlepages.com/observa%c3%a7%c3%b5esmicrosc%c3%b3picas Célula da mucosa bucal
Microscopia de microrganismos Aula 1 - Parte II Microbiologia FFI0751 Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo
Microscopia de microrganismos Tabela 1. Unidades de medidas comuns 0,01 m 0,001 m 0,000001 0,000000001 m 0,0000000001m 27
O primeiro microscópico da história Ampliação de 300x e resolução de 1 m 28
Tipos de microscópios -Microscópio óptico ou de Luz -Microscópio confocal -Microscópio eletrônico -Microscópio de tunelamento -Microscópio de força atômica 30
Relações entre os tamanhos - Microscópio óptico ou de Luz -Microscópio Eletrônico Tortora, 6ª ed, 2000 31
Microscópio óptico composto MO -com várias lentes -Utiliza a luz visível como fonte de iluminação 32
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Rota de Luz no microscópio de baixo para cima Oculares Ampliação Prisma Objetivas Ampliação Amostra Condensador Iluminador 34
Laboratório
Objetivas Código de aumento Tipo de aberração corrigida Aumento Correção de curvatura de campo Comprimento do tubo/ espessura da lamínula Abertura numérica Distância de trabalho 36
Objetivas São classificadas como: Acromáticas: Ajustadas para duas cores, geralmente o vermelho e o verde (ou seja, permite que apenas algumas cores sejam observadas, selecionando a frequência de luz visível de interesse por meio de seu índice de refração durante a fase de fabricação da lente). Apocromáticas: Ajustadas para três cores, normalmente o vermelho, o verde e o violeta. Não-acromática: Não ajustada para cor alguma. Possui a característica de formar halos coloridos ao redor da imagem.
Lente objetiva Lente ocular
Ampliação total da amostra Ampliação total = potência de ampliação de lentes objetivas x da ocular Objetivas: 10X (baixa potência) 40X (alta potência) 100X (imersão em óleo) 100X 400X 1000X Ocular: Amplia a amostra por um fator de 10 40
Amplificação e resolução
Resolução ou Potência de resolução Capacidade das lentes de diferenciar detalhes finos e estruturas Capacidade de individualizar dois pontos adjacentes Diferenciar entre dois pontos com uma distância específica entre os mesmos Ex: Microscópio com resolução de 0,4 nm pode distinguir 2 pontos se eles estão no mínimo a 0,4 nm de distância um do outro. Quanto menor o comprimento de onda luminosa usado no instrumento, maior a resolução. MO Luz branca com comprimento de onda longo e não pode oferecer resolução a estruturas menores que 0,2 m Limitação da ampliação a cerca de 2000 X. Microscópio eletrônico resolução de cerca de 1000 vezes superior! 42
Limite de resolução D = 0,61 NA D = limite de resolução (diâmetro do menor objeto que pode ser distinguido) = comprimento de onda da luz visível (em geral 0,5 m) NA = Abertura numérica (medida da capacidade de concentrar a luz) NA = sen - metade do ângulo dos raios de luz extremos que ainda penetram a objetiva (> valor = 90 ) - Índice de refração do meio intercalante (espaço entre amostra e objetiva) Ar = 1 Óleo = 1,4 Luz azul com menor comprimento de onda Melhor resolução = filtro azul! 43
Limite de resolução Abertura numérica (medida da capacidade de concentrar a luz) > Largura angular e abertura numérica Melhor resolução < distância de trabalho 44
Índice de refração Obtenção de imagem clara e detalhada em MO amostra com alto contraste com seu meio Diferenciar o índice de refração das amostras daquele do seu meio Velocidade relativa com que a Luz passa através de um material Altera a direção dos raios de luz sofrendo refração e aumenta o contraste Coloração 45
Objetiva de imersão Ampliação alta (100X) com boa resolução, a lente deve ser pequena Embora necessitemos que a luz percorra a amostra e o meio para ser refratada de modo diferente, não desejamos perder os raios de luz após eles terem passado através da amostra corada óleo de imersão e a lente de imersão Mesmo índice de refração que o vidro e torna-se parte da óptica do vidro do microscópio. Para estes raios refratados sejam capturados a lente objetiva deve ter um diâmetro maior Sem óleo de imersão nessa lente, a amostra torna-se borrada 46
Objetivas Tabela 2. As propriedades das objetivas do microscópio 47
Amplificação e resolução Produto do aumento obtido com as lentes objetivas e ocular Aumento 100 X, 400X, ou 1000X 10 X 10 X, 40X, ou 100X Microscópio óptico Limite de resolução é de ~0,2 µm Aumento limite de ~1500x
Como limpar o MO Solução de limpeza e algodão Solução de limpeza: Solução de limpeza (50% éter sulfúrico PA, 50% clorofórmio PA); Cotonete caseiro ou palito isento de ferpas, com ponta envolvido com algodão; 49
Como carregar o seu microscópio 50
Como colocar a lâmina no seu microscópio Charriot Platina 51
Como utilizar o seu microscópio 52
Como utilizar o seu microscópio Ajuste as oculares quanto à distância entre seus olhos, afim de observar um só campo!! 53
Tabela 3. 54
Campo escuro Contraste de fase 56
Microscopia de Fluorescência Para visualizar compostos que fluorescem (emitem luz de uma cor quando iluminados com luz de outra cor) 57
Microscopia de Fluorescência 58
Microscópios ópticos Tipo de microscópio Características Utilização Campo brilhante Utiliza luz visível Observar espécimes corados mortos ou organismos vivos com cor natural Campo escuro Contraste de fase Usa luz visível com um condensador especial com um disco opaco que bloqueia a luz direta e impede-a de entrar na objetiva diretamente Usa luz visível com um condensador especial com um diafragma anular que permite que luz direta passe através do condensador, focalizando a luz na amostra e em uma placa de difração na lente objetiva. Os raios de luz direta e refletida ou difratada são reunidos para produzir a imagem. Não é preciso coloração Observar organismos vivos invisíveis no MO que não podem ser corados ou que são distorcidos pela coloração Observar estruturas internas das amostras vivas Fluorescência Usa luz ultravioleta para estimular moléculas fluorescentes de microrganismos para realçá-los Para técnicas de fluorescência com anticorpos para identificar ou detectar rapidamente os microrganismos em tecidos ou amostras clínicas 59
Microscopia Eletrônica de Transmissão Para estudo detalhado de estruturas celulares internas Elétrons são utilizados ao invés de raios luminosos Eletromagnetos atuam como lentes Sistema em vácuo 60
Microscopia Eletrônica de Transmissão Limite de resolução = 0,2 µm Limite de resolução = 0,2 nm Micrografia eletrônica 61
Microscopia Eletrônica de Transmissão Feixes de eletróns tem baixa penetrabilidade A célula é muito Espessa e por isso, São necessários Cortes finos (20-60nm) Nas amostras
Microscopia Eletrônica de Transmissão 63
Microscopia Eletrônica de Transmissão 64
Microscopia Eletrônica de Transmissão Ilana Camargo 65
Microscopia Eletrônica de Transmissão Staphylococcus aureus Microscópio óptico Microscópio eletrônico de transmissão Ilana Camargo 66
Microscopia Eletrônica de varredura Características externas de um organismo Cobrir com metal pesado (ouro) Aumentos de 15x a 100.000x SEM 67
Microscopia Eletrônica de varredura 68
Imagens tridimensionais Microscopia de contraste por interferência Microscopia de força atômica Laser de varredura confocal
Microscopia Confocal Raio laser acoplado ao microscópio óptico 70
Microscopia Confocal Laser é ajustado para que somente uma determinada camada do espécime torne-se visível 71
Microscopia Confocal 72
Microscopia de Tunelamento A peça básica do STM é uma finíssima ponta metálica que varre a superfície a ser analisada, mas não a toca. Fica a uma distância muito pequena, inferior a um nanômetro. O equipamento vê a estrutura da superfície por causa do efeito túnel daí a origem do seu nome. Assim, voando baixo sobre a superfície, a agulha vai registrando as rugosidades em escala atômica. O microscópio de tunelamento, conhecido pela sigla inglesa STM, valeu aos seus inventores o Prêmio Nobel de Física de 1986 http://www.funpar.ufpr.br:8080/funpar/boletim/novo2/externo/boletim.php?noticia=1811&boletim=71 73
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Bibliografia: - Madigan, M.T. et al. Microbiologia de Brock. São Paulo: Prentice-Hall, 12ª ed., 2010. - Tortora, G.J. et al. Microbiologia. Porto Alegre: ArtMed, 8ª ed., 2005.