Biologia IV. Microbiologia

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1 Biologia IV Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo Laboratório de Epidemiologia e Microbiologia Molecular (LEMiMo) Grupo de Cristalografia Microbiologia Microbiologia como ciência; Impactos sobre o homem; Tipos de organismos estudados; Aula Parte I Células procarióticas e eucarióticas; Aula Parte II Biossegurança 1

2 Microbiologia É a ciência que estuda os microrganismos um grande e diverso grupo de organismos microscópicos- que podem ser encontrados como células únicas ou grupamentos celulares. Diferente dos organismos macroscópicos, os microrganismos são em geral capazes de realizar seus processos vitais de crescimento, geração de energia e reprodução, sem depender de outras células. Microbiologia como ciência O que estuda? Como ciência biológica básica: microrganismos como modelos para estudo de funções celulares de organismos superiores; as bases físicas e químicas que permitiram o surgimento da vida provêm de estudos com microrganismos. Como ciência biológica aplicada: trata de questões práticas importantes da medicina, agricultura e indústria. 2

3 Microbiologia como ciência Meta dos microbiologistas Compreender como os microrganismos atuam Otimizar seus efeitos benéficos Minimizar atividades danosas Impactos sobre o Homem 2004 Pearson Education, Inc. 3

4 Impactos sobre o Homem Impactos sobre o Homem 4

5 Células Procarióticas e Eucarióticas Aula 1 - Parte I Microbiologia FFI0751 Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo Procariotos x Eucariotos Mitocôndrias Cloroplastos 5

6 Procariotos Tamanho: 0,2 a 2 µm Membrana citoplasmática Procariotos 6

7 Procariotos Membrana citoplasmática proteínas de transporte Procarioto Parede celular Procariotos 7

8 Procariotos Procarioto Divisão por fissão binária DNA livre no citoplasma Ribossomo (70S) (Síntese de proteínas) Eucariotos Eucariotos Tamanho: 10 a 100 µm Organelas delimitadas por membrana 8

9 Eucariotos Núcleo: maior estrutura da célula e contém quase toda a informação hereditária (DNA). Eucariotos Fitas de DNA enoveladas em proteínas chamadas Histonas 9

10 Eucariotos Retículo endoplasmático: sacos membranosos achatados contínuo com o envelope nuclear. Sintetiza lipídeos, armazena lipídeos e proteínas e fornece rota de transporte daquelas moléculas para outras partes da célula através de vesículas secretoras. Ribossomos (80S) Eucariotos Complexo de Golgi: próximo ao núcleo, consiste de vários sacos achatados empilhados. Recebem proteínas e lipídeos do RE e os distribui, armazena ou entrega-os em vesículas secretoras. Transportam lipídeos para Membrana e enzimas aos lisossomos. Lisossomo: formados a partir do complexo de Golgi, contém enzimas digestivas e estão envolvidos na digestão 10

11 Eucariotos Citoesqueleto: suporte e auxilia no transporte de substâncias através da célula Eucariotos Mitocôndrias: esférica ou cilíndrica que consiste de membrana dupla, com cristas internas, onde há a substância semifluida chamada matriz. Nas cristas ocorre reações químicas que fornecem energia para célula (ATP). Por isso, a mitocôndria é chamada de gerador da célula. Contém ribossomos 70S, DNA e toda maquinaria para se replicar, transcrever e traduzir as informações do seu DNA. 11

12 Eucariotos Flagelos e cílios: envolvidos no movimento Eucariotos Célula eucariotas (algas, fungos e plantas) parede celular: composta pelo polissacarídeo quitina além de glicana e manana (fungos), ou celulose (plantas). Protozoários não tem PC, mas tem película Animais contém o glicocálice (carboidratos adesivos) 12

13 Eucariotos Cloroplasto: estrutura revestida por membranas que contém clorofila e enzimas necessárias para as fases de captação da luz da fotossíntese. Também possuem ribossomo 70S, DNA e enzimas envolvidos na síntese de proteínas. Se multiplicam por si só dentro das células (aumentam de tamanho e se dividem em dois). Tilacóides (clorofila) Eucarioto: homem Cromossomo nuclear - 46 cromossomos Grande 1,8m - 6 x 10 6 Kb Eucariotos Cromossomo mitocondrial DNA dupla fita 13

14 DNA, RNA, Proteína Transcrição Tradução DNA RNA Proteína Ribossomos de procarioto e de eucarioto Ribossomos de procarioto e de eucarioto Ribossomos são caracterizados pelo coeficiente de sedimentação, expresso em unidades Svedberg (S). Procariotos: 70S contém uma subunidade grande (50S) e uma pequena (30S) Eucariotos: 80S contém uma subunidade grande (60S) e uma pequena (40S) 14

15 Ribossomos de procarioto e de eucarioto Diferenças entre ribossomos: procarioto x eucarioto Organelas Membrana citoplasmática Citoplasma Microfilamentos, filamentos intermediários e microtúbulos Retículo endoplasmático ribossomos Complexo de Golgi Lisossomo mitocôndria Funções Eucariotos Limite mecânico da célula, barreira seletiva com sistemas de transporte, permite interação entre as células e adesão à superfície, secreção Ambiente para as organelas, local de muitos processos metabólicos Estrutura para células e movimentos, forma o citoesqueleto Transporte de materiais, participa da síntese de proteínas e lipídeos Síntese de proteínas Empacotamento e secreção de materiais para várias propostas, formação de lisossomo Digestão intracelular Produção de energia através do ciclo do ácido tricarboxílico, transporte de elétrons, fosforilação oxidativa e outras vias Cloroplastos Fotossíntese (obtém energia da luz e libera CO 2 e H 2 O) Núcleo Nucléolo Parede celular e película Flagelos e cílios vacúolo Local onde se encontra as informações genéticas, centro de controle da célula Síntese de RNA ribossômico Forma e rigidez á célula Movimento Armazento e transporte temporário, digestão, equilíbrio osmótico (vacúolo contrátil) 15

16 Comparação entre os tamanhos 22/08/2016 Procariotos x Eucariotos Trypanosoma em esfregaço sangüíneo. A membrana ondulante e o núcleo são visíveis. Rickettsia ricketsi dentro de células do sangue (bactéria). 16

17 Procariotos x Eucariotos Células da mucosa vaginal Célula superficial, cujo citoplasma é avermelhado e cujo núcleo é picnótico, entre duas células intermediárias. Há grande quantidade de bacilos de Döederlein. Célula da mucosa bucal O primeiro microscópico da história Ampliação de 300x e resolução de 1 m 34 17

18 Principais marcos da evolução biológica 36 18

19 Teoria da Endossimbiose 37 Aquisição de bactéria quimiorganotrófica (metabolismo aeróbio facultativo) mitocôndria; Cianobactéria fotossíntese oxigênica cloroplasto FORMAÇÃO DA CÉLULA Núcleo surgiu espontaneamente em resposta ao tamanho do genoma do eucarioto remoto; Hipótese do Hidrogênio: Primeiro Bacteria (consumidor de O 2 e produtor de H 2 ) foi incorporado em Archaea; Núcleo surge após passagem dos genes que produzem lipídeos para o hospedeiro sistema membranoso Replicação e expressão mais eficientes 19

20 Comparação de células Procarióticas e organelas Eucarióticas Célula procariótica Célula Eucariótica Organelas Eucarióticas DNA Circular Linear Circular Histonas Proteínas semelhantes às Sim Não Ribossomos histonas 70S 80S Semelhantes na sequência e São inibidos pelos mesmos antibiótico 70S Crescimento Fissão Binária Mitose Fissão Binária Sec. XIX Duas grandes questões biológicas levaram ao desenvolvimento de técnicas laboratoriais essenciais: O debate sobre a geração espontânea (Louis Pasteur) A natureza das doenças infecciosas (Robert Koch) 20

21 Geração espontânea prós e contras Francesco Redi (1668): experimentos com carne apodrecidas. John Needham (1745): o aquecimento de caldos nutrientes (de galinha ou milho) não prevenia o aparecimento de microrganismos. Lazaro Spallanzani (1765): refutou experimentos de Needham. A fervura de frascos previamente lacrados impedia o crescimento de microrganismos. (crítica de Needham: o lacre impedia a entrada da força vital necessária). Rudolf Wirchow (1858): introduziu conceito da biogênese ( células vivas somente podem surgir de células vivas préexistentes ). Louis Pasteur (1861): experimentos que refutaram definitivamente a teoria da geração espontânea. O experimento de Pasteur 2004 Pearson Education, Inc. 21

22 O experimento de Pasteur 2004 Pearson Education, Inc. O experimento de Pasteur 2004 Pearson Education, Inc. 22

23 Teoria do germe da doença Experimentos de Pasteur: base das técnicas de assepsia. Pasteurização: para resolver problema de vinhos e cervejas que azedavam por causa das bactérias (álcool ácido acético) C por segundos. Relação entre deterioração dos alimentos e os microrganismos colaborou para a Teoria do germe da doença. Teoria do germe da doença Doenças: punição para os pecados individuais ou crimes. Causa: demônios nos detritos ou nos vapores dos pântanos. 1865: Pasteur descobre a causa da doença do bichoda-seda (protozoário). 1860: Joseph Lister tratou ferimentos cirúrgicos com fenol redução drástica de infecções e mortes. 23

24 Teoria do germe da doença Robert Koch, médico prático alemão, 1876: comprovou a teoria do germe da doença. Koch estudou o antraz (carbúnculo) doença de gado e ovelhas e descobriu o agente causador Bacillus anthracis. Problema! Como afirmar que a bactéria presente no sangue do animal afetado é o agente causador da doença? Postulados de Koch 1. O organismo patogênico suspeito deve estar presente em todos os casos da doença e ausente em animais sadios. 2. O organismo suspeito deve ser cultivado em cultura pura. 3. Células de uma cultura pura do organismo suspeito devem provocar a doença em um animal sadio. 4. O organismo deve ser isolado e caracterizado como o mesmo encontrado originalmente. 24

25 Exceções aos postulados de Koch 1) Nem todos os microrganismos crescem em meios de cultura; Não são cultivados em meio artificial: Treponema pallidum: sífilis Mycobacterium leprae: lepra Riquétsias e vírus: multiplicam-se somente dentro das células 2) Um conjunto de sinais e sintomas podem ser os mesmos em várias doenças; 3) Um microrganismo pode causar várias doenças. Como controlar os microrganismos? Edward Jenner - ( ), que graças a sua observação segura e sem preconceito, seguida de uma análise metódica e eficiente, mesmo trabalhando numa localidade rural da Inglaterra, conseguiu imunizar as pessoas contra a nefasta varíola humana. O método terapêutico realizado pelo Dr. Jenner recebeu o nome de vacina ( do latim vacca). Apesar da prática empírica de Jenner ter iniciado em 1773 somente em 1975, após 200 anos, que a varíola foi totalmente erradicada do mundo. 25

26 Como controlar os microrganismos? 1910 Paul Ehrlich Bala Mágica para combater um patógeno sem prejudicar o hospedeiro Dentre várias substâncias testadas salvarsan (derivado de arsênico) para o combate à Sífilis Antes disso, a única substância utilizada pelos Europeus era a quinina, extraída de casca de árvore sul-americana para o tratamento da malária Como controlar os microrganismos? -Alexander Fleming, médico e bacteriologista escocês Contaminação por fungo em placa alerta para substância inibidora do crescimento bacteriano 1928, Penicillium notatum Penicilina 1940 Importância médica da Penicilina 26

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28 Sistemas de classificação 1735 Carolus Linnaeus (botânico sueco) Propôs 2 Reinos: Animalia e Plantae; introduziu latim como língua comum Carl von Nägeli (botânico suíço): bactérias e fungos no reino Plantae Robert Whittaker (botânico americano) Criou o sistema de 5 Reinos Monera, Protista, Fungi, Plantae e Animalia Carl Woese (microbiologista americano) Propôs o sistema de 3 Domínios (um nível acima de Reino): Bacteria, Archea e Eucarya, a partir da análise comparativa de sequências de RNA ribossômico

29 Classificação Carl Woese, 1978, baseada na organização celular. Três Domínios: 1. Bacteria (paredes celulares contêm peptideoglicanos) 2. Archaea (paredes celulares, se presentes, não contém peptideoglicanos) 3. Eucarya Protista (fungos gelatinosos, protozoários e algumas algas) Fungi (leveduras unicelulares, bolores multicelulares e cogumelos) Plantae (musgos, samambaias, coníferas e plantas com flores) Animalia (esponjas, vermes, insetos e vertebrados, entre outros) Classificação 4 Reinos dentro do Domínio Eucarya!! Tortora et al., Microbiologia 6ª Edição,

30 Ribossomos de procarioto e de eucarioto Diferenças entre ribossomos: procarioto x eucarioto rrna 16S: várias regiões altamente conservadas (facilita alinhamento preciso de sequências) e variabilidade suficiente em outras regiões, tornando-o um excelente cronômetro filogenético

31 Regiões altamente conservadas que permitem alinhamento preciso das sequências Variabilidade suficiente em outras regiões cronômetro evolutivo 61 Árvore filogenética universal Análise do rrna 16S rrna 18S 62 31

32 63 Tipos de organismos estudados Bactérias Anabaena sp, 600X, MEV Saccharomyces cerevisiae, 800X, MEV Mucor sp, 400X, MEV Fungos Listeria monocytogenes (3000X, MEV) Halobacterium sp, 1600X, MEV Aspergillus ustus, 600X, MEV Vírus Seres microscópios de natureza acelular Vírus da hepatite B, X, MEV Vírus do mosaico do tabaco, X, MEV Retrovirus HIV, X, TEM 32

33 Tipos de organismos estudados Protozoários Ameba - pinocitose Trypanosoma sp, 1000X, MEV Paramecium multimicronucleatum, 200X, MEV Tipos de organismos estudados Volvox aureus, 40X, MO Algas Volvox - Detalhe Spirogyra sp, 100X, MO 33

34 Vírus Depende do ponto de vista agregações extremamente complexas de substâncias químicas ou microrganismos extremamente simples. -Possuem um único tipo de ácido nucléico (DNA e RNA) e uma cobertura protéica envolvida por um envelope composto de lipídeos, proteínas e carboidratos; -São parasitas intracelulares obrigatórios; 34

35 Instrumentação e técnicas básicas de assepsia Sobre as aulas práticas Profa. Dra. Ilana Camargo Biossegurança Conjunto de procedimentos adotados com o objetivo de dar proteção e segurança ao profissional e à sua equipe. Para evitar disseminação e contaminações devem ser empregadas medidas de controle de infecção como a utilização de equipamento de proteção individual (EPI), esterilização de materiais, desinfecção de ambiente e equipamentos. 35

36 Equipamentos de Proteção Individual (EPI) Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC) Todo dispositivo ou produto de uso individual ou coletivo, utilizado pelo trabalhador destinados a proteção de riscos que podem ameaçar a segurança e a saúde no trabalho 36

37 Equipamentos de Proteção Individual (EPI) Gorro Óculos de proteção máscara Jaleco branco Luvas A importância do Jaleco 37

38 Níveis de Biossegurança Nível de Biossegurança (NB) NB é o nível de contenção que permita o trabalho em laboratório com materiais infecciosos de forma segura e com risco mínimo Existem quatro níveis de biossegurança: NB-1, NB-2, NB-3 e NB-4, crescentes no maior grau de contenção e complexidade do nível de proteção. O NB será determinado segundo o organismo de maior classe de risco envolvido no experimento. Biossegurança em Laboratórios de Pesquisa 38

39 Níveis de Biossegurança Designados em ordem crescente, pelo grau de proteção proporcionado ao pessoal do laboratório, meio ambiente e à comunidade: O nível de Biossegurança 1, é o nível de contenção laboratorial que se aplica aos laboratórios de ensino básico, onde são manipulados os microrganismos pertencentes a classe de risco 1 (não causam doenças nos homens ou outros animais). Não é requerida nenhuma característica de desenho, além de um bom planejamento espacial e funcional e a adoção de boas práticas laboratoriais. Exemplos: Bacillus subtilis O nível de Biossegurança 2 diz respeito ao laboratório em contenção, onde são manipulados microrganismos da classe de risco 2 (causam doenças nos homens ou outros animais). Se aplica aos laboratórios clínicos ou hospitalares de níveis primários de diagnóstico, sendo necessário, além da adoção das boas práticas, o uso de barreiras físicas primárias (cabine de segurança biológica e equipamentos de proteção individual) e secundárias (desenho e organização do laboratório). Exemplos: Vírus da Febre Amarela e Schistosoma mansoni. Centers for Disease Control and Prevention - CDC. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 4a. ed. U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, p. Níveis de Biossegurança NB-1 39

40 Níveis de Biossegurança NB-2 Níveis de Biossegurança O nível de Biossegurança 3 é destinado ao trabalho com microrganismos da classe de risco 3 (causam graves doenças nos homens ou outros animais) ou para manipulação de grandes volumes e altas concentrações de microrganismos da classe de risco 2. Para este nível de contenção são requeridos além dos itens referidos no nível 2, desenho e construção laboratoriais especiais. Deve ser mantido controle rígido quanto a operação, inspeção e manutenção das instalações e equipamentos e o pessoal técnico deve receber treinamento específico sobre procedimentos de segurança para a manipulação destes microrganismos. Exemplo: Mycobacterium tuberculosis O nível de Biossegurança 4, ou laboratório de contenção máxima, destina-se a manipulação de microrganismos da classe de risco 4 (causam doenças nos homens ou outros animais representando grande risco para os trabalhadores de saúde, sendo alto o risco de transmissibilidade na comunidade), onde há o mais alto nível de contenção, além de representar uma unidade geográfica e funcionalmente independente de outras áreas. Esses laboratórios requerem, além dos requisitos físicos e operacionais dos níveis de contenção 1, 2 e 3, barreiras de contenção (instalações, desenho equipamentos de proteção) e procedimentos especiais de segurança. Exemplo: Vírus Ebola. Centers for Disease Control and Prevention - CDC. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 4a. ed. U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, p. 40

41 Níveis de Biossegurança NB-3 Fluxo de ar sempre de fora para dentro; Filtro de ar para troca de ar do ambiente; Usar equipamento de contenção de bioaerossol Níveis de Biossegurança NB-3 Respirador Com filtro HEPA Biossegurança em Laboratórios de Pesquisa Laboratório NB3 41

42 Níveis de Biossegurança NB-4 Níveis de Biossegurança NB-4 42

43 Níveis de Biossegurança NB-4 Níveis de Biossegurança NB-4 43

44 Níveis de Biossegurança NB-4 Sala de troca de roupas 44

45 NUNCA PIPETE COM A BOCA!!! Instrumentos Pipetas e pipetadores 45

46 Pipetas automáticas Pipeta Pastuer Ponteiras Conceitos importantes!! Tortora, et al, 6ª ed,

47 Limpar a bancada com álcool 70% ANTES E DEPOIS dos experimentos!! O bico de Bunssen e a zona asséptica/de segurança Zona Asséptica Bico de Bunssen 47

48 Materiais Cabo Haste Agulha Alça Materiais Fechar com tampão de algodão e cobrir com papel alumínio 48

49 Instrumentos Câmara de biossegurança / fluxo laminar Autoclave Esterilização pelo calor úmido (vapor sob pressão) Em geral: 15 a 20 minutos a 121ºC Equipamentos 49

50 Equipamentos Uma vez cultivado o microrganismo no meio de cultura, deve-se incubá-lo a uma temperatura ótima de crescimento por pelo menos 24h! Geralmente: Bactérias : C Fungos: C Estufa Como cultivar os microrganismos?? 50

51 Onde isolar? Meios de cultura: Material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de microrganismos. Fazer a partir de pós desidratados; Comprar meios preparados (prontos para o uso) Onde colocar? Placas de Petri; Tubos de ensaio. Como escolher o meio para o isolamento? A) origem do material a ser analisado; B) A espécie que se imagina estar presente; C) Necessidades nutricionais dos organismos. Meios Líquidos, semi-sólidos e sólidos Agar foi descoberto no Japão (Kanten) a partir de algas marinhas e é utilizado em comidas. Holandeses passaram a usar agar em alimentos; Fannie Hess, esposa do pesquisador Walter Hess utilizava agar em geléias. Walter testou em meios de cultura e escreveu para Robert Koch Até cerca de 1880, as culturas eram todas líquidas. Koch havia tentado usar gelatina, mas esta derretia a 37 C. Ao ver a utilidade do agar, Robert Koch passou a utilizá-lo em meios de cultura para o cultivo de bacilos da tuberculose. AGAR Sem cor Sem gosto Sem odor Gelatinoso Bactérias não o degradam! 51

52 Diferentes concentrações de ágar diferentes estados físicos Sólidos contém agentes solidificantes, principalmente ágar (cerca de 1 a 2,0 %); Semi-sólidos a quantidade de ágar é de 0,075 a 0,5 %, dando uma consistência intermediária, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas; Líquidos sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para ativação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros. H 2 O H 2 O H 2O H 2 O Autoclavar 121 C por 20 minutos Distribuir em placas estéreis 52

53 Meio autoclavado = Calor!! Materiais Tubos de ensaio Placas de Petri 53

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55 Placas de Richard Petri Placas de Petri

56 Isolamento de microrganismos em Cultura Pura Inóculo: material a ser semeado, colocado no meio de cultura. Incubação: bactérias 37 C / 24 horas; Fungos C / HORAS A DIAS! Durante a incubação as células individuais se multiplicam e produzem um grande número de células = Colônia - visível a olho nu. Cada colônia é uma cultura pura com ancestral único. Colônia Todas as células em uma colônia têm o mesmo parentesco. Isolamento de colônias para posteriormente obter cultura pura Objetivo dos métodos: Diminuir a população microbiana, assim as células individuais estarão localizadas a uma certa distância umas das outras. Para obter uma cultura pura, uma colônia individual da cultura mista é transferida de um meio para outro em placa ou tubo. Cultura pura Cultura mista 56

57 Lavagem das mãos 57

58 Lavagem das mãos Indicação de lavagem das mãos: Sempre Que as mãos estiverem sujas Antes e após Preparo de materiais e/ou equipamentos O uso de luvas A aula de microbiologia Com o uso concomitante de luvas Após coleta de sangue Administração de hemoderivados Higienização de paciente O uso das luvas não substitui a lavagem das mãos!!! Lavagem das mãos 58

59 Lavagem das mãos - Retirar jóias, relógio, pulseiras (acúmulo de bactérias não removidas) - Abrir a torneira com a mão dominante quando não houver pedal - Molhar as mãos - Aplicar de 3 a 5 ml de sabão líquido nas mãos - Ensaboar as mãos, formando espuma, friccionando-as por 15 a 30 segundos, atingindo todas as suas faces - Enxaguar, deixando a água penetrar nas unhas e espaços interdigitais (mão em forma de concha). Retirar toda a espuma e os resíduos de sabão, sem deixar respingar água na roupa e no piso. - Secar as mãos com papel toalha descartável. Se a torneira for manual, usar o mesmo papel-toalha para fechá-la Lavagem das mãos HOJE: LAVAR AS MÃOS COMO ESPECIFICADO E PASSAR ÁLCOOL 70%!! Álcool 70% X X Peça para um amigo 59

60 Verificação das lavagens das mãos Antes Depois Diminuição do número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) Placas com 24h a 37 C e 5 dias a 4 C Bibliografia: - Madigan, M.T. et al. Microbiologia de Brock. São Paulo: Prentice-Hall, 10ª ed., (ou mais recente!) - Tortora, G.J. et al. Microbiologia. Porto Alegre: ArtMed, 8ª ed., (ou mais recente!) 60