Actividade prática: Constrói os teus Kits de Genética! Mais uma vez vais vestir a tua bata de cientista e investigador e preparar o teu dia a dia no laboratório. Hoje é um dia especial, vais receber a visita de uma turma do secundário para dares a conhecer todas as técnicas de Eng.ª. Genética com que estás habituado(a) a trabalhar. Para isso tens de preparar vários kits com o material pronto a usar, para lhes dares as indicações do que eles precisam para cada uma dessas técnicas. Depois não te podes esquecer de lhes explicar o procedimento, para eles poderem realizar a actividade sozinhos. Como vês, não há tempo a perder! Nota - Fotografa todos os teus kits quando estiverem completos!
*Isolamento de DNA de uma célula eucariota (Taq) 1º Introduzem-se células eucariotas dentro de um tubo de ensaio com água (de modo a fazer uma suspensão), faz-se o abaixamento da temperatura com gelo para inibir as enzimas celulares (de restrição, ou outras, uma vez que a única defesa do DNA nuclear é a membrana nuclear) e promove-se a lise celular das células (rebentamento da membrana celular e nuclear). 2º Faz-se o mesmo procedimento que para o isolamento do DNA eucariota, mas com a finalidade de isolar o RNA: Introduz-se à suspensão fenol e clorofórmio para permitir a separação química dos vários componentes celulares (enzimas, proteínas, RNA e DNA), aquando da centrifugação. No final da centrifugação os componentes celulares vão encontrar-se separados no tubo de ensaio, distribuindo-se em 3fases distintas: Fase aquosa, interface e fase orgânica. Sendo a fase aquosa a menos densa, é aí que vamos encontrar o DNA, mais abaixo na interface vamos encontrar o RNA e na fase mais densa ou fase orgânica vamos ter as proteínas. Isola-se o RNA por decantação.
*Isolamento de DNA de uma célula procariota (Taq) 1º Introduzem-se células procariotas com plasmídeos (bactérias) dentro de um tubo de ensaio com água (de modo a fazer uma suspensão), e promove-se a lise celular das bactérias. Como o DNA destas bactérias está protegido com grupos metilo, não é digerido por enzimas de restrição (daí não ser necessária a inibição enzimática). 2º Introduz-se à suspensão fenol e clorofórmio para permitir a separação química dos vários componentes celulares (enzimas, proteínas, RNA, DNA do cromossoma principal e DNA do cromossoma secundário - plasmídeo), aquando da centrifugação. 3º No final da centrifugação os componentes celulares vão encontrar-se separados no tubo de ensaio, distribuindo-se em 3fases distintas: Fase aquosa, interface e fase orgânica. Sendo a fase aquosa a menos densa, é aí que vamos encontrar o DNA do cromossoma principal, e mais abaixo, na fase mais densa ou fase orgânica vamos ter o nosso DNA plasmídico e as proteínas. Na interface vamos encontrar o RNA. 4º Isola-se o DNA plasmídico por fraccionação (Outra forma de separação, de modo a isolar os plasmídeos das proteínas).
rdna CaCl 2 (com choque térmico) (Taq) 1º Isolamento do DNA eucariota*. 2º Isolamento do DNA plasmídico (procariota)*. 3º Adiciona-se uma enzima de restrição A ao DNA eucariota que vai segmentar todas as zonas de restrição A existentes, formando no final vários fragmentos de diversos tamanhos. 4º Adiciona-se a mesma enzima de restrição A, ao DNA plamídico, que só apresenta uma zona de restrição, apresentando no final apenas uma abertura. 5º Selecciona-se o segmento que contém o gene de interesse a clonar. 6º Coloca-se o plasmídeo aberto em contacto com o fragmento que se pretende clonar. Visto que ambos apresentam as mesmas extremidades coesivas, uma vez que formam cortados com a mesma enzima de restrição, apresentam extremidades complementares entre si, que se unem por complementaridade, no entanto, as ligações adjacentes (lado a lado) não se conseguem ligar uma vez que são ligações covalentes, muito fortes, necessitando de uma enzima interveniente, como a DNA ligase, uma enzima reparadora do DNA. Temos agora o nosso plasmídeo recombinado. 7º Coloca-se o plasmídeo recombinado em contacto cm bactérias sem plasmídeo e induz-se a sua entrada para dentro da célula através da adição de CaCl 2 com choque térmico e espera-se que a replicação celular ocorra, havendo clonagem de todos os genes existentes no interior destas bactérias com DNA recombinado.
cdna CaCl 2 (com choque térmico) (Taq) 1º Faz-se o mesmo procedimento que para o isolamento do DNA eucariota, mas com a finalidade de isolar o RNA: Introduzem-se células eucariotas dentro de um tubo de ensaio com água (de modo a fazer uma suspensão), faz-se o abaixamento da temperatura com gelo para inibir as enzimas celulares (de restrição, ou outras, uma vez que a única defesa do DNA nuclear é a membrana nuclear) e promove-se a lise celular das células (rebentamento da membrana celular e nuclear). Introduz-se à suspensão fenol e clorofórmio para permitir a separação química dos vários componentes celulares (enzimas, proteínas, RNA e DNA), aquando da centrifugação. No final da centrifugação os componentes celulares vão encontrar-se separados no tubo de ensaio, distribuindo-se em 3fases distintas: Fase aquosa, interface e fase orgânica. Sendo a fase aquosa a menos densa, é aí que vamos encontrar o DNA, mais abaixo na interface vamos encontrar o RNA e na fase mais densa ou fase orgânica vamos ter as proteínas. Isola-se o RNA por decantação. 3º A partir do RNA isolado vamos proceder à síntese da primeira cadeia de DNA complementar: Necessitamos da enzima, para fazer o processo inverso ao da transcrição, mas uma vez que esta não se consegue ligar a uma cadeia simples de RNA, vamos necessitar de um iniciador/primer para se ligar por complementaridade à extremidade 3 do RNA (como esta extremidade tem sempre uma sequência poli Adenínica, este segmento vai ser complementar, e portanto, constituído por várias Timinas), formando um pequeno fragmento de cadeia dupla, onde a Transcriptase já terá a capacidade de se ligar. Para a síntese desta cadeia necessitamos ainda de material nucleotídico (T, A, G, C), de forma à Transcriptase conseguir por deslizamento unir nucleótido a nucleótido, a cadeia de DNA oposta à do RNA. 4ºFaz-se a digestão da cadeia de RNA. 5ºFaz-se a síntese da 2ªcadeia de cdna: Para esta 2ª cadeia necessitamos de outra enzima - - que faz a síntese de uma cadeia de DNA a partir de outro molde de DNA. Esta enzima apresenta a mesma dificuldade da Transcriptase, não se pode ligar a uma cadeia simples, dessa forma também necessita de um iniciador que ao complementar-se com a extremidade 3 do DNA constitui a cadeia dupla necessária para a ligação da polimerase. Tal como na 1ªcadeia, também são necessários nucleótidos, para a construir a nova cadeia, complementar à cadeia oposta, e finalmente temos o cdna concluído.
Biblioteca Genómica (Taq) 1º Isolamento do DNA eucariota* de todo o genoma. 2º Isolamento do DNA plasmídico (procariota)*. 4º Faz-se a técnica do rdna* para todos os fragmentos de DNA resultantes do corte das enzimas de restrição (que podem apresentar vários tamanhos). 5º Colocam-se todas as bactérias expostas à absorção dos plasmídeos recombinados num meio com o antibiótico Ampicilina (ou outro, que também sirva de marcador ou seleccionador), de modo a eliminar todas as bactérias que não apresentam plasmídeos (só os plasmídeos é que apresentam os genes de resistência ao antibiótico, e permitem às células que os absorveram, sobreviver). 6º Colocam-se as bactérias em condições ideais para se multiplicarem (clonagem).
Biblioteca de cdna (Taq) 1º Faz-se a técnica do cdna* com todo o genoma. 2º Faz-se o isolamento do DNA plasmídico (procariótico)*. 3º Faz-se a técnica do rdna* mas com o cdna, e com todos os fragmentos resultantes do corte da enzima de restrição. 4º Colocam-se todas as bactérias expostas à absorção dos plasmídeos recombinados num meio com o antibiótico Ampicilina, de modo a eliminar todas as bactérias que não apresentam plasmídeos (só os plasmídeos é que apresentam os genes de resistência ao antibiótico, e permitem à células que os absorveram sobreviver). 5º Colocam-se as bactérias em condições ideais para se multiplicarem (clonagem) e fazerem a síntese proteica a dos genes de interesse.
Impressão Digital Genética (DNA fingerprint) (Taq) 1º Isolamento do DNA eucariota*. 2º Na suspensão com o DNA isolado de todo o genoma, introduz-se um único tipo de enzimas de restrição (por vezes pode ser utilizado mais do que um tipo, para melhorar a comparação entre duas impressões digitais genéticas), resultando em segmentos de vários tamanhos. 3ºIntroduz-se a suspensão com os fragmentos de DNA num dos poços de um campo de Electroforese (com pólos eléctricos), e espera-se que estes se distribuam nessa coluna de acordo com o seu tamanho e cargas iónicas. Os fragmentos maiores vão encontrar-se mais próximos das zonas dos poços e os tamanhos mais pequenos vão migrar para zonas mais afastadas. Nota Cada indivíduo vai apresentar fragmentos de tamanhos distintos, uma vez que o número e o local das zonas de restrição variam entre indivíduos. Nota 2 Esta técnica é utilizada acima de tudo para a comparação de DNA entre indivíduos, sendo possível saber a paternidade de um determinado indivíduo.
Reacção de Polimerização em cadeia (PCR) (Taq) 1º Faz-se o isolamento do DNA eucariota*. 2º Procede-se ao aquecimento da suspensão com uma pequena amostra de DNA, de modo a permitir a desnaturação do DNA (1ªetapa), ou seja, as quebras das ligações por pontes de hidrogénio entre as duas cadeias complementares anti paralelas, originando duas cadeias simples. 3º Necessitamos fazer a síntese das cadeias opostas, e tal como no caso da síntese da 2ªcadeia do cdna, vamos necessitar de uma enzima que a partir de uma cadeia de DNA, faça a síntese da sua cadeia oposta (de DNA). Para tal utilizamos a que necessita de uma cadeia dupla para se ligar ao DNA e fazer a síntese da nova cadeia. Para isso adicionamos 2iniciadores complementares às extremidades 3 das duas cadeias simples, de forma a formar um pequeno segmento de cadeia dupla para esta se poder ligar. A esta 2ªetapa denominamos de emparelhamento dos primers. 4º Como último material vamos necessitar de nucleótidos essenciais para última etapa do PCR, a polimerização, onde ocorre a síntese das cadeias opostas aos moldes de DNA de cadeia simples desnaturados inicialmente. 5º Este processo será repetido várias vezes até haverem materiais em suspensão e se estabelecerem as temperaturas ideais para cada etapa do ciclo.