O Proteoma da MADEIRA. O uso da proteômica no estudo da formação da madeira. Introdução

O Proteoma da Pesquisa MADEIRA O uso da proteômica no estudo da formação da madeira Alexander de Andrade Engenheiro Agrônomo Doutor em Genética e Melhoramento de Plantas Pesquisador, ESALQ, USP andrade@esalq.usp.br Paola A. F. Celedón Bióloga, Doutora em Genética e Melhoramento de Plantas, Pesquisadora, ESALQ, USP Carlos Alberto Labate Engenheiro Agrônomo Professor Dr. Departamento de Genética ESALQ, USP. Imagens cedidas pelos autores Introdução O setor florestal contribui de forma relevante para o desenvolvimento de vários países, em termos de geração de renda, tributos, empregos, divisas e na promoção do desenvolvimento regional. No Brasil o setor de base florestal oferece cerca de 3 milhões de empregos diretos e indiretos, participando com 4% do PIB nacional e 7,3% do total exportado (LEITE, 2005). A madeira é o quinto mais importante produto do comércio mundial (PLOMION et al., 2001). Além Figura 1 Tecidos que compõem a madeira. (A) Corte transversal do caule de Eucalyptus grandis; (B) Esquema dos tecidos que formam a madeira de ser uma formidável fonte natural e renovável de energia e fibras (papel e celulose), durante a sua formação ocorre uma grande incorporação de CO 2, contribuindo com a redução do aquecimento global (PLOMION et al., 2001). A expectativa de crescimento do consumo da madeira para a próxima década é de 20%, enquanto que a cobertura florestal natural mundial declina a uma média anual de 9,4 milhões de hectares (BOERJAN, 2005). Para atender a esta demanda e reduzir a pressão sobre as florestas nativas é necessária a obtenção de árvores mais produtivas, resistentes a fatores bióticos e abióticos e com madeira de alta qualidade, conforme a finalidade de seu uso. Dentro deste contexto, diferentes programas de pesquisa estão sendo desenvolvidos por instituições públicas e privadas, utilizando técnicas como o mapeamento genético, transgenia, genômica, transcrissoma e proteômica, aliadas ao melhoramento convencional, buscando compreender os mecanismos envolvidos com o desenvolvimento da madeira. A formação da madeira é um processo complexo que envolve muitos eventos biológicos os quais são coordenados por uma ampla variedade de fatores endógenos (fitohormônios), exógenos (fotoperíodo e temperatura) e pela interação entre ambos. O processo é dirigido pela expressão ordenada de numerosos genes estruturais e regulatórios (muitos dos quais ainda não conhecidos) envolvidos nos diferentes estádios de sua formação. A expressão destes genes é responsável pela formação dos dife- 10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

no caule que por diferenciação celular forma as células especializadas que compõem os tecidos vasculares (Figura 1) do xilema e do floema. O câmbio é uma excelente fonte de células para estudos, pois o tecido é rico em proteínas e ácidos nucléicos e ainda não é lignificado. A zona cambial já foi utilizada para identificar genes (SCHARADER et al., 2004) e mais recentemente proteínas consideradas importantes para a formação da madeira de Populus (VANDER-MIJNSBRUGGE et al., 2000), Pinus (GION et al., 2005) e Eucalyptus (ANDRADE, 2006; CELEDÓN, 2006; MEIRELES, 2006). Figura 2 Fluxo experimental usado pela proteômica na identificação de proteínas e genes envolvidos na formação da madeiras rentes tecidos que compõem as árvores. Apesar de sua importância o conhecimento das principais etapas envolvidas com a formação da madeira ainda está distante de ser completo. Com raras exceções, muito pouco é conhecido sobre os processos celulares, moleculares e bioquímicos responsáveis pelo seu desenvolvimento (PLOMION, 2001; CHAFFEY, 2002). A Biotecnologia e o desenvolvimento da madeira A análise molecular de espécies florestais apresenta dificuldades devido a aspectos de sua biologia como o longo ciclo de vida, falta de mutantes e de linhagens puras (DU et al., 2006). Mesmo assim grupos de pesquisa nacionais e internacionais têm dedicado esforços à compreensão dos mecanismos genéticos e moleculares envolvidos na formação da madeira em árvores. Por sua importância, principalmente para a indústria de papel e celulose, uma grande atenção vem sendo destinada à compreensão das vias metabólicas envolvidas na síntese da celulose e lignina (POKE et al., 2005), e na identificação dos vários genes envolvidos nesses processos. A descoberta de genes relacionados principalmente com a síntese destes dois polímeros abre novas perspectivas para a manipulação genética com a finalidade de alterar suas concentrações na madeira, tornado-a mais produtiva e atrativa para a indústria. Estudos com árvores transgênicas de álamo têm demonstrado que a alteração da expressão de genes relacionados com a rota metabólica da lignina pode alterar a sua composição e quantidade na madeira. A principal conseqüência da redução da quantidade e composição da lignina na madeira é a diminuição do uso de produtos químicos empregados durante o processo de sua extração na produção de papel e celulose, reduzindo custos e minimizando os impactos ambientais (BAUCHER et al., 2003). Dentre as tecnologias mais utilizadas no estudo do desenvolvimento da madeira estão os microarranjos de cdnas ou oligonucleotídeos, os quais têm identificado genes preferencialmente expressos em tecidos como xilema (HERTZBERG et al., 2001). Normalmente estes estudos têm utilizado como sistema modelo à comparação entre madeiras juvenil e adulta (EGERTSDOTTER et al., 2004) e submetidas a diferentes condições como a madeira normal e de tensão (PLOMION et al., 2003). Uma região considerada como uma importante fonte de informações é a zona cambial, formada por um tecido meristemático localizado A era Pós-Genômica Os dados gerados pelo sequenciamento do genoma, embora relevantes, são limitados, tornando necessária a integração com outras técnicas que permitam estudar tanto os processos de transcrição das informações contidas nos genes quanto os seus produtos; as proteínas. Esta constatação deu início a uma nova etapa na pesquisa biológica conhecida como Era Pós- Genômica, promovendo o desenvolvimento e o aperfeiçoamento de técnicas utilizadas no estudo de transcritos (transcrissoma), proteínas (proteômica) e metabólitos (metabolômica), todas integradas pela bioinformática (PALSSON, 2002; WECKWERTH et al., 2004). A proteômica tem ganhado destaque por complementar e ser complementada pelos dados gerados pela genômica e pela transcrissoma, representando uma ponte de ligação entre os genes e os seus produtos, as proteínas. Os recentes avanços na proteômica, como a introdução da espectrometria de massas para a análise de macromoléculas, unidos a técnicas analíticas bem conhecidas como a eletroforese bidimensional, eletroforese capilar e a cromatografia líquida e a gasosa, possibilitaram o estudo de processos fisiológicos complexos e dinâmicos (PATTERSON e AEBERSOLD, 2003), como a formação da madeira em árvores. Atual- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 11

mente a eletroforese bidimensional combinada com a espectrometria de massas (Figura 2) são as técnicas mais usadas na análise do proteoma de árvores. A proteômica permite conhecer o produto final de um gene, suas propriedades químicas e locais de atuação na célula, o que é impossível prever a partir de seqüências de DNA devido às etapas de processamento pós-transcricional e pós-traducional (glicosilação, fosforilação, acetilação, etc.) que modulam a atividade de uma proteína. Por outro lado, um produto gênico muitas vezes não atua isoladamente, estando com freqüência envolvido em interações com o produto de outros genes para a formação de complexos moleculares funcionais. Desta maneira, para os estudos de expressão gênica fazem-se necessárias estratégias que desvendem a regulação da funcionalidade das proteínas e sua influência no metabolismo da planta, permitindo esclarecer se a regulação de um determinado gene ocorre durante as etapas de transcrição ou tradução (VAN WIJK, 2001). O conhecimento do controle da expressão gênica está sendo complementado pela proteômica e abre a possibilidade de identificar novos genes alvos, os quais podem ser usados na manipulação genética de plantas (PANDEY e MANN, 2000; PIMENTA, 2003). Extração de proteínas da madeira A chave do sucesso na análise de qualquer proteoma está relacionada primeiramente com uma boa etapa de extração e purificação das proteínas do material analisado. A melhor preparação da amostra é aquela que utiliza um menor número possível de reagentes com a mínima manipulação. Além disso, deve extrair o maior número de proteínas com a mínima perda e modificação das moléculas durante o preparo da amostra, para evitar interferências nas etapas de separação e identificação (DUNN, 1993; GÖRG et al., 2004). Normalmente tecidos de plantas apresentam baixas concentrações de proteínas e são ricos em compostos que interagem com as proteínas durante a extração (como proteases, compostos fenólicos, pigmentos e carboidratos), interferindo e reduzindo a reprodutibilidade durante a análise (CARPENTIER et al., 2005). Em plantas lenhosas, estes compostos são ainda mais abundantes, especialmente em tecidos lignificados como a madeira (VÂLCU e SCHLINK 2006). Os compostos que interferem na extração e purificação das proteínas são específicos para cada espécie, tecido ou ainda o estádio de desenvolvimento, por isso existe a necessidade de otimizar o processo de acordo com a amostra analisada (GÖRG et al 2004). Além disso, fatores ambientais, como a seca, podem alterar as características de um tecido, necessitando de preparos adicionais durante a extração. Dentre os diferentes métodos de extração utilizados na análise do proteoma de plantas, a extração com TCA e acetona (DAMERVAL et al., 1986) é a mais difundida. O método possibilitou a obtenção de bons resultados na extração de proteínas da madeira em desenvolvimento e de tensão de Pinus pinaster (GION et al., 2005). Uma vantagem do método é a imediata precipitação das proteínas com simultânea inativação de compostos envolvidos em sua degradação, como as proteases (VÂLCU e SCHLINK, 2006). Outro método envolve a solubilização das proteínas com fenol misturado a uma fase aquosa e subseqüente precipitação com metanol e acetato de amônio (HURKMAN e TANAKA, 1986). Neste método de extração, os ácidos nucléicos e carboidratos solubilizam-se preferencialmente na fase aquosa, enquanto as proteínas permanecem no fenol, com a vantagem da proteólise ser minimizada na presença do solvente. Este método já foi utilizado para a extração de proteínas da casca e da madeira de álamo (VANDER- MIJNSBRUGGE et al., 2000), e de tecidos da madeira de Eucalyptus grandis em diferentes estádios do desenvolvimento (ANDRADE, 2006; CELEDÓN, 2006; MEIRELES, 2006). É uma estratégia bastante eficiente, porém deve ser usada com precaução devido à toxidez do fenol. O uso de detergentes como o SDS (sodium dodecyl sulfate) pode ser uma estratégia alternativa quando deseja-se favorecer o enriquecimento de proteínas citosólicas e de membrana. A comparação entre os três métodos de extração (Figura 3), com tecidos da zona cambial de árvores de 3 anos de eucalipto, demonstrou que diferentes grupos de proteínas foram favorecidos conforme a estratégia adotada. Separação das proteínas A principal estratégia usada pela proteômica durante a etapa de separação de proteínas é a eletroforese bidimensional (2D-PAGE). A técnica permite a separação, detecção e quantificação de milhares de proteínas simultaneamente presentes em uma amostra complexa, através da combinação da focalização isoelétrica e da eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. A eletroforese bidimensional separa as proteínas pela sua carga (focalização isoelétrica ou IEF) na primeira dimensão e pelo seu peso molecular (SDS-PAGE) na segunda dimensão (Figura 4). Quando realizadas isoladamente, as técnicas de IEF e de SDS-PAGE permitem a separação de aproximadamente 100 proteínas de uma amostra heterogênea, porém, quando combinadas permitem a separação teórica de cerca de 10000 spots individuais. Na prática um gel de 2D-PAGE com alta resolução permite a visualização de aproximadamente 3000 proteínas dependendo da amostra e da sensibilidade da técnica de revelação, embora já tenham sido descritos géis com 10000 spots (KLOSE e KOBALZ, 1995). Nos últimos anos com o desenvolvimento de novas técnicas analíticas e com o aperfeiçoamento da preparação das amostras, a técnica 2D-PAGE sofreu uma evolução surpreendente, aumentando a sua resolução, sensibilidade e repetibilidade, tornando-se amplamente usada na separação e identificação de proteínas. Entretanto, existem ainda dificuldades associadas a esta técnica 12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

Figura 3 Avaliação dos métodos de extração por eletroforese bidimensional das proteínas do caule de Eucalyptus grandis com 3 anos. Em (a) foi realizada extração com fenol, (b) extração com TCA e na (c) com SDS. A focalização foi realizada em um gradiente de ph linear de 4-7. Coloração com coomassie brilhante blue G250 como baixa resolução dos spots em algumas faixas de PM e pi, pouca sensibilidade para detecção de proteínas de baixa concentração e pequena representação de proteínas hidrofóbicas. Estas dificuldades técnicas vêm sendo superadas, com um maior número de repetições por tratamento (RUBINFELD et al., 2003), uso de sofisticados programas de imagem de géis (ROGER et al., 2003), seleção de faixas de ph estreitas as quais aumentam a resolução da amostra (GÖRG et al., 1999), enriquecimento de frações de proteínas baseado em características químicas (CORTHALS et al., 2000) e aplicação de protocolos específicos para recuperação de proteínas de baixa solubilidade (MÉCHIN et al., 2003). A eletroforese bidimensional é utilizada preferencialmente na comparação de proteomas em diferentes estádios fisiológicos ou de desenvolvimento, onde a observação de proteínas diferencialmente expressas, permite inferir o envolvimento dos genes correspondentes a cada estádio em questão. O uso da técnica na separação de proteínas da madeira de diferentes espécies como pinus, álamo e o eucalipto, tem revelado a presença de múltiplos spots de uma mesma proteína em géis bidimensionais (Figura 5). A presença de diferentes spots de uma mesma proteína pode indicar e auxiliar na compreensão de eventos como: Modificações pós-traducionais; Variações alélicas de um mesmo gene (isoformas); Figura 4 Etapas usadas na separação de proteínas por eletroforese bidimensional. (A) retirada do tecido, (B) extração e purificação das proteínas, (C) obtenção de um extrato livre de impurezas, (D) aplicação da amostra e da fita de acrilamida com gradiente de ph, (E) focalização isoelétrica, separação conforme seu ponto isoelétrico, (F) SDS-PAGE, separação pelo peso molecular, (G) gel 2D-PAGE da madeira de Eucalyptus grandis corado com coomassie brilhante blue Produtos de genes parálogos; Eventos provenientes do splicing alternativo. Em árvores de interesse florestal, a separação de proteínas por 2D- PAGE tem sido utilizada na comparação entre: proteínas da madeira e de tecidos fotossintetizantes em pinus (COSTA et al.,1999), na sazonalidade de proteínas durante o ano em diferentes tecidos de álamo (VANDER MIJNSBRUGGE et al., 2000), no estudo de madeira normal e de tensão (PLOMION et al, 2003), no estudo das proteínas da madeira de Pinus pinaster (GION et al., 2005) e de Eucalyptus grandis (Figura 6) em diferentes estádios do desenvolvimento (ANDRADE, 2006; CELEDON, 2006; MEIRELES, 2006). Identificação e sequenciamento de proteínas As principais técnicas usadas na identificação e sequenciamento de peptídeos e proteínas são a degradação de Edman e a espectrometria de massas (MS). Embora a degradação de Edman seja amplamente usada, tem como limitações: baixa sensibilidade e consome muito tempo (em média uma hora por aminoácido), sendo incompatível com proteínas que apresentam a região N-terminal bloqueada (PENG e GYGI, 2001). Atualmente a ultra-sensibilidade e resolução dos espectrômetros de massas têm desempenhado um importante papel na identificação de proteínas (Figura7), permitindo que mesmo aquelas presentes em baixíssimas concentrações possam ser analisadas e identificadas, com rapidez e robustez nas análises. O uso da espectrometria de massas por muito tempo ficou restrito a um pequeno número de moléculas capazes de resistir ao método de ionização e ao processo de análise que envolve a sua transferência para um sistema de alto vácuo e altas temperaturas, sendo um obstáculo no estudo de biomoléculas como as proteínas. No final dos anos 80, com o desenvolvimento de dois novos métodos de ionização branda (Figura 8) o MALDI (Matrix-Assisted Laser Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 13

Figura 5 Exemplos de proteínas do caule de eucalipto encontradas em diferentes spots; (a) isoflavona redutase, (b) tubulina e (c) 14-3-3 Figura 6 Padrão da expressão de proteínas do caule Eucalyptus grandis em diferentes idades, separadas por eletroforese bidimensional, (figura do gel de árvores de 6 anos retirado e modificado de MEIRELES, 2006) Figura 7 Etapas usadas na identificação e sequenciamento de proteínas. (A) O gel 2D-PAGE é escaneado, (B) análise do gel por programas de imagem, (C) proteínas de interesse são retiradas do gel, digeridas com tripsina e seqüenciadas por espectrometria de massas, (D) obtenção dos espectros de massa (E) através da análise e interpretação dos espectros de massas é encontrado a seqüência dos aminoácidos que compõem os peptídeos, (F) com a seqüência dos diferentes peptídeos é identificada a proteína Desorption Ionization) e o ESI (Electrospray Ionization), ocorreu uma revolução na análise de biomoléculas. Estas novas técnicas foram tão importantes que seus criadores, Koishi Tanaka (MALDI) e John Fenn (ESI) ganharam o Prêmio Nobel de Química em 2002. No início dos anos 90 as novas técnicas de ionização branda, associadas com o desenvolvimento de novos algoritmos computacionais, permitiram correlacionar dados obtidos de um espectro de massas de biomoléculas com seqüências existentes em bancos de dados. Este evento marcou a transformação da MS no estudo em larga escala e das técnicas usadas na genômica funcional (MANN e WILM, 1995; MANN et al., 2001). O sucesso dos métodos de ionização MALDI e ESI e o desenvolvimento de analisadores de massa em seqüência (tandem), levaram a um grande aumento na resolução e sensibilidade do método, tornando-o uma ferramenta obrigatória nas análises estruturais e químicas de peptídeos e proteínas. Os espectrômetros de massa atuais permitem selecionar uma só molécula ionizada, fragmentá-la (colisão com um gás inerte) e através da análise das massas dos fragmentos conhecer a estrutura da molécula original, permitindo determinar, por exemplo, a seqüência de aminoácidos de um peptídeo ou uma alteração química específica em algum resíduo de aminoácido (PIMENTA, 2003; PATTERSON e AEBERSOLD, 2003; STEEN e MANN, 2004). Diversos laboratórios têm adotado o uso do MALDI e do ESI em suas estratégias de identificação e sequenciamento de proteínas. Por usarem diferentes princípios de ionização e distintas limitações, o uso dos dois métodos tem levado a um maior número de moléculas identificadas, além de aumentar a rapidez e a confiabilidade das análises. Normalmente o MALDI-TOF-MS é usado primeiramente para determinar a massa da proteína e após a sua digestão com tripsina, seus peptídeos são separados, normalmente por cromatografia líquida acoplada diretamente no espectrômetro de massas (ESI-TOF- MS/MS) e seqüenciados (GIORGIANNI, 2003). Situação atual e perspectivas do proteoma da madeira Os trabalhos de proteoma en- 14 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

Espectrômetro de massas Mistura de peptídeos Feixe de laser Coluna Detector Filtro de massa Aceleração por potencial elétrico Placa com a amostra e a matriz submetida a alta voltagem Descarga elétrica Matriz Capilar Analito Formação de um spray MS Figura 8 Fontes de ionização branda usada na proteômica. (A) Esquema do MALDI-MS. A matriz e a amostra são aplicadas em uma placa de metal (B) e, apüs a evaporação do solvente, as moléculas da amostra cristalizam com a matriz. Esses cristais são então bombardeados com um feixe de raio laser, ionizando as moléculas para serem detectadas pelo espectrômetro de massas. (C) Esquema do ESI-MS. A amostra é dissolvida em um solvente volátil e injetada por um tubo capilar metálico sobre o qual é aplicada uma voltagem (D); o resultado é um aerossol de analíto e solvente. A alta temperatura da fonte provoca a evaporação do solvente, produzindo íons protonados para a análise. volvendo a formação da madeira são recentes, porém têm demonstrado que entre diferentes espécies como o pinus e o eucalipto (Tabela 1) as proteínas mais expressas estão envolvidas no metabolismo de energia e em mecanismos de defesa. Além de mecanismos responsáveis pela síntese de celulose, hemicelulose e lignina, os compostos mais abundantes da madeira. O proteoma da madeira tem demonstrado também que existe uma grande similaridade entre as proteínas de angiospermas e gimnospermas (COSTA et al., 1999). A similaridade entre a abundância e homologia de proteínas de diferentes espécies indica a existência de metabolismos conservados relacionados direta ou indiretamente com a formação da madeira em distintos grupos taxonômicos. Possivelmente diferenças significativas poderão ser encontradas através da análise de proteínas de menor abundância, que devem incluir fatores de transcrição, envolvidos com o controle da expressão gênica. A mudança na expressão destes genes deve ser a grande responsável pela diferença observada entre as características da madeira de diferentes espécies. Tabela 1. Proteínas mais abundantes em ordem decrescente encontradas no proteoma do Eucaliptus grandi s e Pinus pinaster Eucalyptus grandis Pinus pinaster Proteína Função Proteína Função S adenosylmethionine Metabolismo de aminoácidos Ac tin Citoes quel eto Isoflavone reductase Metabolismo secundário Tubulin beta Citoes quel eto Actin Ci toes quel eto S adenosylmethionine synthase Metabolismo de aminoácidos HSP 70 K Da Resposta a estresse Tubul i n al pha Citoes quel eto CAffeic acid 3-O-methyltransferase Síntes e de li gnina HSP 70 KDa Respostas a estresse E nolase Energia Isoflavone reductase Metabolismo secundário ATP synthase beta chain Energia ATP synthase beta chain Energia Tubulin alpha Ci toes quel eto Caffeic acid 3-O-methyltransferase Síntes e de li gnina Tubulin beta Ci toes quel eto L-ascorbate peroxidase Energia Fructokinase Energia 14-3-3 Regulação intracelular 14-3-3 Regulação i ntracelul ar Triosephosphate isomerase Energia Glutamine synthase Metabolismo de nitrogênio Enolase Energia Phosphoglycerate kinase Energia UDP-glucose protein transglucosylase Energia UDP-glucose pyrophosphorilase Energia S-Adenosyl-L-homocysteine hidrolase Metabolismo de aminoácidos Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 15

A técnica de separação empregada nestes trabalhos envolve a eletroforese bidimensional, a qual possui como limitação a separação de proteínas hidrofóbicas de membrana (RABILOUD et al., 1997), de baixa abundância, com peso molecular muito baixo (< 10KDa), bem como as de maior peso molecular (> 200 KDa) e as extremamente ácidas ou básicas (HARDER et al., 1999). A combinação de diferentes estratégias de separação no estudo do desenvolvimento e formação da madeira como a cromatografia líquida multidimensional e a eletroforese capilar, poderá isolar grupos de proteínas com menor representatividade nos géis bidimensionais, como fatores de regulação, e que podem ser responsáveis por controlar características de importância para o setor florestal. A disponibilidade dos dados gerados pelo sequenciamento do genoma de espécies com importância florestal como o eucalipto, pinus e o álamo irão aumentar a taxa de identificação de proteínas por espectrometria de massas. Além de esclarecer questões sobre as rotas metabólicas envolvidas em sua formação e as enzimas que atuam no processo, auxiliando no isolamento de genes estruturais e que regulam a formação da madeira (ZHONG et al., 2005) disponibilizando novas possibilidades para o melhoramento genético de árvores de interesse florestal. Referências ANDRADE, A. de. Sequenciamento, identificação e análise de proteínas do caule de mudas de Eucalyptus grandis. 2006. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 120 p. BAUCHER, M.; HALPIN, C.; PETIT- CONIL, M.; BOERJAN, W. Lignin: genetic engeneering and impact on pulping. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, Philadelphia, v. 38, p. 305-350, 2003. BOERJAN, WOUT. Biotechnology and the domestication of forest trees. Current opinion in biotechnology, London, v.16, n.2, p.159-66, 2005. CARPENTIER, SC; WRITTERS, E.; LAUKENS, K.; DECKERS, P.; SWENNEN, R.; PANIS, B. Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues: An evaluation of differente methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis. Proteomics, Wiley v.5, p.2497-2507, 2005. CELEDÓN, P. A. F. Identificação de proteínas da região cambial de Eucalyptus grandis por eletroforese bidimensional e espectrometria de massas. 2006. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 112 p. CHAFFEY, N.; CHOLEWA, E.; REGAN, S.; SUNDBERG, B. Secondary xylem development in Arabidopsis: a model for wood formation. Physiologia plantarum, Lund, v.114, n.4, p.594-600, apr, 2002. COSTA, P.; PIONNEAU, C.; BAUW, G.; DUBOS, C.; BAHRMANN, N.; KREMER, A.; FRIGERIO, J. M.; PLOMION, C. Separation and characterization of needle and xylem maritime pine proteins. Electrophoresis, Weinheim, v.20, p.1098-108, 1999. DAMERVAL, C.; DE VIENNE, D.; ZIVY, M.; THIELLEMENT, H. Technical improvements in twodimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheatseedling proteins. Electrophoresis, Weinheim, v.7, p.52-54, 1986. DU, J.; XIE, H. L.;ZHANG, D. Q.; HE, X. Q.; WANG, M. J.; LI, Y. Z.; CUI, K. M.; LU, M. Z. Regeneration of the secondary vascular system in poplar as a novel system to investigate gene expression by a proteomic approach. Proteomics, Weinheim, v.6, p.881-895, 2006. DUNN, M. J., Proteins. Oxfort: Clarendon Press, 1993. 407.p. EGERTSDOTTER, U.; VAN ZYL L. M.; MACKAY, J.; PETER, G.; KIRST, M.; CLARK, C.; WHETTEN, R.; SEDEROFF, R. Gene expression during formation of earlywood and latewood in loblolly pine: expression profiles of 350 genes. Plant Physiology, Lancaster, v.6, p.654-663, 2004. FENN, J. B.; MANN, M.; MENG, C. K.; WONG, S. F.; WHITEHOUSE, C. M. Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules. Science, Washington, v. 246, p. 64-71, 1989. GION, J. M.; LALANNE, C.; LE PROVOST, G.; FERRY- DUMAZET, H.; PAIVA, J.; CHAUMEIL, P.; FRIGERIO, J. M.; BRACH, J.; BARRE, A.; DARUVAR, A.; CLAVEROL, S.; BONNEU, M.; SOMMERER, N.; NEGRONI, L.; PLOMION, C. The proteome of maritime pine wood forming tissue. Proteomics, Weinheim, v.5, p.3731-3751, 2005. GIORGIANNI, S. B. Proteoma analysis by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry: strengths and limitations. Trends in analytical chemistry, Amsterdam, v. 22, n. 5, p. 273-281, 2003. GÖRG, A.; WEISS, W.; DUNN, M. J. Current two dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics, Weinheim, v.4, p.3665-3685, 2004. HARDER, A.; WILDGRUBER, R.; NAWROCKI, A.; FEY, S. J.; LARSEN, P. M.; GORG, A. Comparison of Yeast Cell Protein Solubilization Procedures for Two-Dimensional Electrophoresis. Electrophoresis, NewYork, v. 20, p. 826 829, 1999. HERTZBERG, M.; ASPEBORG, H.; 16 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

SCHRADER, J.; ANDERSSON, A.; ERLANDSSON, R.; BLOMQVIST, K.; BHALERAO, R.; UHLEN, M.; TEERI, T. T.; LUNDEBERG, J.; SUNDBERG, B.; NILSSON, P.; SANDBERG, G. A transcriptional roadmap to wood formation. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v.98, n.25, p. 14732-7, Dec, 2001. HURKMAN, W. J.; TANAKA, C. K. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by twodimensional gel electrophoresis. Plant Physiology, Lancaster, v.81, p.802-806, 1986. KLOSE, J.; KOBALZ, U. 2-Dimensional electrophoresis of proteins - an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis, New York, v.6., n. 16, p. 1034-1059, 1995. LEITE, N. B. Avanços da silvicultura brasileira são significativos. Visão Agrícola, Piracicaba, n. 5, p.12-18, jul-dez, 2005. MANN, M.; HENDRICKSON, R. C. A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry. Annual review of biochemistry, Palo Alto, v. 70, p. 437-473, 2001. MANN, M.; WILM, M. Electrospray mass spectrometry for protein characterization. Trends in biochemical sciences, Amsterdam, v.6, p.219-24, 1995. MECHIN, V.; CONSOLI, L.; LE GUILLOUX, M.; DAMERVAL, C. An efficient solubilization buffer for plant proteins focused in immobilized ph gradients. Proteomics, New York, v.3, p.1299-1302, 2003. MEIRELES, K. G. X. Identificação de proteínas expressas na região cambial de Eucalyptus grandis por espectrometria de massas. 2006. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba. 117 p. PALSSON, B. In silico biology through omics. Nature biotechnology, New York, v. 20, n. 7, p. 649-650, 2002. PANDEY, A.; MANN, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature, London, v. 405, p. 837-845, 2000. PATTERSON, S.D.; AEBERSOLD, R. H. Proteomics: the first decade and beyond. Nature genetics, New York, v. 33, p. 311-323, 2003. PENG, J.; GYGI, S. P. Proteomics: the move to mixtures. Journal of mass spectrometry, Chichester, v. 36, p.1083-1091, 2001. PIMENTA, A. M. C. Os desafios do proteoma. Ciência Hoje, v. 32, n. 192, p. 16-22, 2003. PLOMION, C.; LEPROVOST, C.; STOKES, A. Wood formation in trees. Plant Physiology, Lancaster, v. 127, p. 1513-1523, 2001. PLOMION, C.; PIONNEAU, C.; BAILLÈRES, H. Analysis of protein expression along the normal to tensin wood gradient in Eucalyptus gunnii. Holzforschung, Berlin, v.57, p.353-358, 2003. POKE, F. S.; VAILLANCOURT, R. E.; POTTS, B. M.; REID, J. B. Genomic research in Eucalyptus. Genetica, Dordrecht v. 125, 79-101, set, 2005. RABILOUD, T.; ADESSI, C.; GIRAUDEL, A.; LUNARDI, J.; Improvement of the Solubilization of Proteins in Two-Dimensional Electrophoresis with Immobilized ph Gradients. Electrophoresis, Weinheim, v. 18, p. 307 316, 1997. ROGERS, M.; GRAHAM, J.; TONGE, R.P. Using statistical image models for objetive evaluation of spot detection in twodimensional gels. Proteomics, New York, v.3, p.879-886, 2003. RUBINFELD, A.; KEREN-LEHRER, T.; HADAS, G.; SMILANSKY, Z.. Hierarchical analysis of largescale two-dimensional gel electrophoresis experiments. Proteomics, New York, v.3, p.1930-1935, 2003. STEEN, H.; MANN, M. The ABC S (and XYZ S) of peptide sequencing. Nature reviews, London, v. 5, p. 699-771, 2004. VANDER-MIJNSBRUGGE, K.; MEYERMANS, H.; VAN MONTAGU, M.; BAUW, G.; BOERJAN, W. Wood for-mation in poplar: identification, characterization and seasonal variation of xylem proteins. Planta, Berlin, v. 210: 589-598, 2000. VÂLCU, C. M.; SCHLINK, K. Reduction of proteins during sample preparation and twodimensional gel electrophoresis of woody plant samples. Proteomics, Wiley, v.6, p.1599-1605, 2006. VAN WIJK, K.J. Challenges and Prospects of Plant Proteomics. Plant Physiology, Lancaster, v.126, n.2, p.501-508, 2001. WECKWERTH, W.; LOUREIRO, M. E.; WENZEL, K.; FIEHN, O. Differential metabolic networks unravel the effects of silent plant phenotypes. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v.101, n. 20, p. 7809-14, 2004. ZHONG, R.; PENA, M. J.; ZHOU, G. K.; NAIRN, C. J.; WOOD-JONES, A.; RICHARDSON, E. A.; MORRISON, W. H.; DARVILL, A. G.; YORK, W. S.; YE, Z. H. Arabidopsis fragile fiber8, which encodes a putative glucuronyltransferase, is essential for normal secondary wall synthesis. The Plant Cell, Rockville, v. 17, p. 3390-3408, 2005. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 17