ESTUDO DA EFICÊNCIA DE MÉTODOS DE PRESERVAÇÃO DE BACTÉRIAS J.M. Tibola 1, F.M.S. Godinho 1, E.M.M. Rossoni 1 1- Fundação de Ciência e Tecnologia CIENTEC - Departamento de Alimentos Laboratório de Microbiologia Rua Washington Luiz, 675 CEP: 90010-460 Porto Alegre RS Brasil, Telefone: (55-51) 3287-2190 Fax: (55-51) 3287-2080 e-mail: (fernanda-godinho@cientec.rs.gov.br) RESUMO Laboratórios e indústrias necessitam dispor de microrganismos para diversos fins, gerando interesse em métodos capazes de preservar esses microrganismos, bem como manter sua viabilidade e características por longos períodos. Esse trabalho teve como objetivo comparar a viabilidade celular por dois métodos de preservação: liofilização e criopreservação. Tal avaliação foi realizada com nove diferentes espécies de três grupos de bactérias: Gram positivas esporuladas, Gram positivas não esporuladas e Gram negativas. A viabilidade foi verificada sete dias após tratamento através de técnicas de contagem, coloração de Gram e provas bioquímicas. Os resultados mostraram que ambos os métodos foram eficientes para preservação de microrganismos, pois mantiveram suas caraterísticas morfológicas, celulares e metabólicas após os tratamentos. De uma maneira geral verificou-se, ainda, que o método de criopreservação conseguiu melhores taxas de recuperação celular. Pretende-se uma continuação deste trabalho com outros meios de cultura e crioprotetores e por períodos maiores de armazenamento desses microrganismos. ABSTRACT Laboratories and industries need to have micro-organisms for various purposes, generating interest in methods to preserve these micro-organisms and maintain their viability and performance for long periods. This study aimed at comparing the cell viability by two preservation methods: lyophilization and cryopreservation This evaluation was performed with nine different species of three groups of bacteria: Gram positive sporulating, Gram positive nonsporulating and Gram negative. Viability was assessed seven days following treatment by counting techniques, Gram staining and biochemical tests. The results showed that both methods were effective for preservation of microorganisms, it maintained its morphological, cellular and metabolic characteristics after treatments. Furthermore, it has been found, in general, the cryopreservation method could better cell recovery rates. The aim is to a continuation of this work with other culture media and cryoprotectants and for longer periods of these storage microorganisms. PALAVRAS-CHAVE: microrganismos, preservação, liofilização, criopreservação. KEYWORDS: microorganisms, preservation, freeze drying, cryopreservation. 1. INTRODUCÃO A importância da preservação de culturas bacterianas está na necessidade de se dispor do microrganismo a qualquer momento, para fins experimentais, didáticos, industriais ou estudos comparativos. A escolha da técnica a ser utilizada deve levar em consideração as características da espécie bem como as vantagens e desvantagens do procedimento escolhido.
O objetivo de todos os métodos é manter viabilidade e, principalmente, proporcionar a estabilidade genética por maior tempo possível, evitando excessivas mutações que alterem suas características. Esse trabalho tem como objetivo comparar a viabilidade celular de microrganismos utilizados como controles em laboratório de microbiologia mantidos por dois métodos de preservação: criogenia e liofilização. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Foram avaliadas nove bactérias: três Gram positivas esporuladas (Bacillus cereus, Bacillus subtilis e Clostridium perfringens), três Gram positivas não esporuladas (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Enterococcus faecalis) e três Gram negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Samonella Tiphymurium). Para o crescimento das cepas foram utilizados os meios nutritivos agar nutriente e caldo cérebro coração (BHI). Para a determinação da viabilidade celular foi utilizado o agar padrão para contagem (PCA). Para os testes bioquímicos foram utilizados meios de cultura seletivos e diferenciais específicos para a caracterização das espécies bacterianas e para provas bioquímicas. Os meios sólidos usados foram os agares Listeria Otaviani-Agosti (ALOA), Baird Parker (BP), Citrato de Simmons, leite, Mac Conkey, Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP), Oxford, Rambach, sangue, Triptose Sulfito Ciclocerina (TSC) e Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). Os meios líquidos utilizados foram os caldos de fermentação, triptona e tioglicolato. 2.1 Liofilização Cada microrganismo foi inoculado em agar nutriente e incubado por 24 horas a 36 C. Posteriormente foram feitas as suspensões em solução salina, com o auxílio da escala de McFarland, até a concentração de 10 8 UFC/mL (Figura 1a). Foram misturados 2 ml de cada uma das suspensões com 50 ml de um meio próprio para liofilização, composto por leite, inositol e água As preparações foram distribuídas em frascos estéreis próprios para liofilização (Figura 1b) e congeladas em gelo seco (Figura 1c). Finalmente os frascos foram colocados no liofilizador (Figura 1d). A liofilização durou cerca de 17 horas. Depois de liofilizadas, as amostras foram mantidas a - 20 C. Para o Clostridium perfringens, que é um anaeróbio estrito, foi utilizado o caldo tioglicolato como meio de suspensão e condições anaeróbias nas incubações. 2.2 Criopreservação Cada microrganismo foi inoculado em BHI a 37 C por 24 horas. Após foi feito o ajuste de concentração da suspensão para 10 8 UFC/mL, com o auxílio da escala de McFarland. Em seguida a suspensão bacteriana foi aliquotada em microtubos, adicionada de 10% de glicerol e vitrificada a - 60 C em ultrafreezer (Figura 1e). a b c d e Figura 1 Técnicas de liofilização e criopreservação
2.3 Teste de viabilidade Após 7 dias, as amostras liofilizadas e criopreservadas foram ressuspendidos em solução salina com diluições até 10-5, inoculadas pela técnica de pour plate em PCA e incubadas por 48 h a 37 C para posterior contagem. Para Clostridium perfringens foi utilizado o meio de cultura TSC em dupla camada e incubação em condições anaeróbias. 2.4 Caracterização bioquímica e morfológica Paralelamente, foram feitas lâminas com coloração de Gram para caracterização da morfologia celular de cada microrganismo. Os microrganismos também foram inoculados em meios seletivos para verificação das características morfológicas da colônia. Ainda, foram realizadas provas bioquímicas para caracterização dos microrganismos. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados do teste de viabilidade celular para os métodos de liofilização e criopreservação geraram as medias que estão representadas na Tabela 1. Esses valores foram obtidos a partir da média aritmética das contagens em placa da diluição seriada 10-5 em duplicata. Na tabela é possível visualizar algumas observações: - a técnica de liofilização foi mais efetiva que a criopreservação para a bactéria Listeria monocytogenes. - as taxas de recuperação das bactérias Bacillus cereus e Enterococcus faecalis foram muito semelhantes para as duas técnicas; - para as demais bactérias pode-se visualizar uma melhor recuperação pela técnica de criopreservação; - a maior diferença visível nos dados é a recuperação do Clostridium perfringens, onde a bactéria foi recuperada com muito mais eficiência pela técnica de criopreservação. Devido as suas condições de anaerobiose, provavelmente o método de criopreservação fez com que a quantidade de oxigênio que entrou em contato com o microrganismo fosse menor que a quantidade desse gás presente na técnica de liofilização, elevando a taxa de sobrevivência da bactéria. Tabela 1 Contagem dos microrganismos submetidos às técnicas de preservação Microrganismo Liofilização (UFC) Criopreservação (UFC) Bacillus cereus 2,4 x 10 6 5,1 x 10 6 Bacillus subtilis 1,8 x 10 6 1,1 x 10 8 Clostridium perfringens 1,5 x 10 2 1,0 x 10 8 Staphylococcus aureus 6,8 x 10 7 1,6 x 10 8 Listeria monocytogenes 2,2 x 10 6 2,0 x 10 5 Enterococcus faecalis 7,3 x 10 8 4,1 x 10 6 Escherichia coli 4,0 x 10 5 5,0 x 10 8 Pseudomonas aeruginosa 3,5 x 10 5 7,6 x 10 7 Salmonella Typhimurium 2,9 x 10 6 3,6 x 10 8 Os testes bioquímicos apresentaram resultados satisfatórios, confirmando que ambas as técnicas utilizadas mantiveram as características das bactérias. O Bacillus cereus apresentou colônias características de coloração pink com halo de precipitação em agar MYP (Figura 2a) e atividade hemolítica em agar sangue (Figura 2b), assim como o Bacillus subtilis apresentou colônias amarelas em agar MYP (Figura 2c). O Clostridium perfringens apresentou colônias características no TSC de coloração negras devido à precipitação de sulfeto de ferro e formação de gás (Figura 2d). O Staphylococcus aureus permaneceu com atividade hemolítica, produziu coagulase (Figura 2e) e morfologia colonial com halo característico em BP (Figura 2f). A Listeria monocytogenes permaneceu com crescimento característico nos meios ALOA, colônias de coloração verde azulada, e Oxford,
colônias de coloração escura (Figura 2g) e motilidade em meio SIM. A Escherichia coli produziu indol (Figura 2h), fermentou a glicose (Figura 2i) e apresentou crescimento característico em agar MacConkey (Figura 2j). A Pseudomonas aeruginosa permaneceu com atividade hemolítica e degradou a lecitina do agar leite formando halo característico (Figura 2l). A Samonella Tiphymurium manteve a capacidade de utilização de citrato como única fonte de carbono, alterando a coloração do meio de verde para azul (Figura 2m) e suas colônias também mantiveram as características morfológicas no agar XLD, com colônias negras, e no agar Rambach, com colônias de coloração rosa (Figura 2n). a b c d e f g h i j k l m n Figura 2 - Testes bioquímicos utilizados para caracterização dos microrganismos. A morfologia celular das bactérias preservadas pelas duas técnicas se mostrou característica na avaliação após a coloração. Verificou-se, porém, que a técnica de criopreservação foi mais eficiente em manter a integridade das células e a visualização dos esporos. 4. CONCLUSÕES Ambas as metodologias foram eficientes na recuperação dos microrganismos testados, pois não afetaram as características morfológicas e metabólicas. Porém, observamos neste trabalho uma melhor recuperação dos microrganismos pela técnica de criopreservação, provavelmente devido ao glicerol, que evita a formação de cristais de gelo e rompimento das membranas celulares. A liofilização, porem, apresenta vantagens com relação a transporte e armazenamento em temperatura ambiente. Pretende-se uma continuação deste trabalho avaliando a utilização de outros meios para liofilização e crioprotetores, além da viabilidade desses microrganismos depois de armazenados por períodos mais longos.
5. REFERÊNCIAS SOLA, M. C; OLIVEIRA, A.P; FEISTEL, J.C.; MINAFRA E REZENDE, C.S. Manutenção de microrganismos: conservação e viabilidade. Enciclopédia Biosfera, Goiânia, v. 8, n. 14, p. 1398-1418, 2012.