Leuko64 Ensaio para deteção de Respostas Inflamatórias Sistémicas Agudas i Informação do Produto h LK-064-75 (75 testes) ; LK-064-250 (250 testes) V Para Utilização de Diagnóstico in vitro RESUMO E PRINCÍPIO A presença do Neutrófilo CD64 in vitro e in vivo aumenta rapidamente em poucas horas, por ação de mediadores de inflamação, tais como o interferon gama e o G-CSF (1-3). Observa-se a mesma alteração em resposta à infeção e lesão comprovadas dos tecidos, facto que aponta para a correlação entre a presença do neutrófilo CD64 e a manifestação de tais condições nos seres humanos (4-14). O ensaio Leuko64 TM utiliza um cocktail de três anticorpos monoclonais, com especificidades para o CD64 (clones 22 e 32.2) e CD163 (clone Mac2-158). A utilização de dois anticorpos para diferentes determinantes antigénicos do CD64 melhora a relação sinal/ruído do ensaio e fornece um mecanismo para minimizar a variação entre lotes no sinal de fluorescência do reagente. A adição do anticorpo monoclonal ao CD163, um antigénio específico de monócito, aumenta a especificidade da identificação da subpopulação de leucócitos, facilitando assim o funcionamento do algoritmo de descoberta de aglomerados do software Leuko64 TM QuantiCALC e permitindo a identificação de populações internas de controlo positivo e negativo. A utilização de um software automatizado elimina a variação inerente à análise subjetiva de ficheiros de dados citométricos de fluxo. A utilização de uma suspensão de esferas fluorescentes para a normalização dos instrumentos de quantificação celular CD64 permite o controlo de acordo com o Material de Referência Standard Reference Material SRM 1932 NIST (RM 8640), além de constituir um mecanismo de redução das diferenças entre lotes dos kits de Ensaio Leuko64 TM. Os resultados do Ensaio Leuko64 TM são comunicados como um Índice PMN CD64 como o parâmetro de diagnóstico, juntamente com os Índices de Monócitos no CD64 e CD163. APLICAÇÃO As versões LK64-75 e LK64-250 do kit de Ensaio Leuko64 TM destinam-se à utilização específica com os seguintes citómetros de fluxo: Beckman Coulter XL, Beckman Coulter FC-500, BD Biosciences FACScan, BD Biosciences FACSCalibur e BD Biosciences Cantos.
UTILIZAÇÃO PREVISTA O kit de Ensaio Leuko64 da Trillium Diagnostics destina-se à utilização na medição da presença do leucócito neutrófilo CD64, juntamente com outros resultados laboratoriais e avaliações clínicas, para apoiar o diagnóstico in vitro da resposta inflamatória sistémica aguda às lesões nos tecidos, tal como ocorre com danos nos tecidos, infeções ou septicemia. O Trillium Leuko64 TM destina-se à utilização em diagnósticos in vitro, efetuados apenas por pessoal qualificado e com a formação pertinente. CONTEÚDO DO KIT Mistura de anticorpos murino monoclonais (contém solução-tampão Reagente A salina com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) purificada e 0,01% de azida de sódio). Solução Trillium de Lise Concentrada 10X (contém cloreto de amónio, Reagente B sal trissódico EDTA e fosfato de potássio) Suspensão de 5,2 µm de esferas de polistireno marcadas com StarFire Reagente C Red e isotiocianato de fluoresceína (FITC), (contém 0,1% de azida de sódio e 0,01% de Tween 20). Utilizado para analisar ficheiros de dados citométricos e calcular os Leuko64 TM Índices de CD64 nos leucócitos. O CD incluído contém também Software tutoriais para a formação dos utilizadores e para uma melhor utilização do kit do Ensaio Leuko64 TM. REAGENTES e MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO INCLUÍDOS Água destilada Tubos descartáveis de polistireno de 12x75 mm Citómetro de Fluxo Micropipeta(s) para injeção de 5µL, 50µL e 1mL Misturador Vórtex Computador para análise do ficheiro de dados citométricos AMOSTRA O Ensaio Leuko64 TM necessita apenas de 50µL de sangue inteiro anti-coagulado. O ácido EDTA, a heparina, o citrato de sódio e o ACD são compatíveis com este sistema de teste. As amostras permanecem aceitáveis até 8 horas quando mantidas à temperatura ambiente (18-22C) ou durante 48 horas quando refrigeradas (2-8C). PREPARAÇÃO DA AMOSTRA 1. Dilua a Solução de Lise Trillium 10X (Reagente B) numa proporção de 1:10, misturando 1 parte do concentrado do Reagente B com 9 partes de água destilada filtrada. O ph final desta solução deve ser 7.40 + 0.05. Crie o volume suficiente para o número previsto de testes (é necessário 1,0 ml para cada amostra). A solução de Lise Trillium 1X ou diluída mantém-se estável durante 1 semana à temperatura ambiente (20-26 C) ou durante 30 dias refrigerada (2-8 C). 2. A solução de Lise Trillium diluída deverá estar entre os 20 C e os 37 C aquando da utilização. Uma solução fria poderá resultar numa lise de baixa qualidade e condições de ensaio aquém das ideais. 3. Etiquete um tubo de polistireno de 12 x 75 mm para cada amostra a analisar. 4. Injete 50µL do Reagente A Leuko64 TM em cada tubo etiquetado. 5. Injete 50µL da amostra da amostra de sangue anti-coagulado bem misturada com uma relação de glóbulos brancos de <25 x 10 9 /L (diluir conforme necessário) ao tubo correspondente contendo o Reagente A; misture ou aplique o misturador com delicadeza; incube no escuro durante 10 minutos à temperatura ambiente (18-22C). LK64-V11-2013 A4 PT Página 2 de 9
6. Adicione 1mL de Lise Trillium (1X) (Reagente B diluído) a cada tubo e aplique o misturador cuidadosamente. Incube no escuro durante 15 minutos à temperatura ambiente. A aplicação intermitente do misturador melhora a lise. 7. Adicione 5µL de esferas Leuko64 TM (Reagente C) a cada tubo, aplique o misturador e analise no citómetro de fluxo, utilizando a configuração do instrumento e o protocolo de análise descritos em baixo. As amostras preparadas não analisadas imediatamente deverão ser mantidas a uma temperatura de 2-8 C, protegidas da luz, até à respetiva análise. A análise por citómetro de fluxo deve ser desempenhada no prazo de 4 horas da coloração. CONFIGURAÇÃO DO CITÓMETRO DE FLUXO Antes da análise da primeira amostra, é necessário configurar um protocolo de recolha no citómetro de fluxo. As esferas Leuko64 TM (Reagente C) irão funcionar como calibrador dos ganhos do instrumento e das definições de tensão. De modo a garantir o funcionamento adequado do software automatizado, deverá seguir as instruções em baixo exatamente. Consulte os tutoriais no CD de software Leuko64 TM QuantiCALC para assistência adicional nas instruções. 1. Prepare um tubo de polistireno de 12x75 mm contendo 5µL de esferas Leuko64 TM (Reagente C) em 0,5mL da Lise Trillium 1X (Reagente B diluído numa proporção de 1:10, com água destilada filtrada, ph 7.40 + 0.05). Esta suspensão de esferas irá ser utilizada para estabelecer a tensão PMT ótima e definições de dispersão de luz do citómetro de fluxo. 2. No modo de recolha do citómetro (utilizadores do Beckman Coulter XL, FC500 ou Navios consultar a informação em baixo), configure 5 histogramas de dois parâmetros: FS (lin.) vs SS (log.) CD64 com FITC vs SS (log.) CD163 com PE vs SS (log.) FL3 (esferas) vs SS (log.) CD163 com PE vs CD64 com FITC E 3 histogramas de um parâmetro: FL1 - CD64 com FITC FL2 - CD163 com PE FL3 (ou tubo PMT com configuração de filtros capaz de detetar um sinal de 685 nm) NOTA: Os instrumentos Beckman Coulter XL, FC500 e Navios devem ter os parâmetros de aquisição selecionados pela seguinte ordem: P1 = FALS P4 = logaritmo de PE P2 = logaritmo de SS P5 = logaritmo de PMT para sinal P3 = logaritmo de FITC de 685 nm (normalmente FL4) 3. DESLIGUE todas as definições de compensação e de limiar. 4. Definições de Tensão para Todos os Instrumentos, exceto BDB FACSCanto II. (Os utilizadores do FACSCanto II devem consultar as instruções abaixo) Nota: Defina todos os parâmetros de logaritmo para uma apresentação de 4 dezenas no software de recolha do citómetro de fluxo antes da aquisição Efetue a análise da suspensão de esferas e implemente os seguintes ajustes aos histogramas de um só parâmetro (consultar o diagrama) O centro do pico no eixo FL1 (FITC) deverá encontrar-se a meio no canal 100 (no início da terceira dezena da intensidade de fluorescência). LK64-V11-2013 A4 PT Página 3 de 9
O centro do pico do eixo FL2 (PE) deverá encontrar-se em ~ 20 (a primeira unidade na segunda dezena da intensidade de fluorescência). O centro do pico no eixo FL3 (FITC) deverá encontrar-se a meio no canal 100, ou no início da terceira dezena da intensidade de fluorescência. No histograma FS vs SS, a população de esferas deverá encontrar-se no final da terceira dezena do sinal do logaritmo de SS e perto do canal 200 para sinal para a frente ou de dispersão de ângulo baixo (na escala 256, utilizar o canal 25-50). Para todos os Utilizadores dos Modelos Beckman Coulter, FACSCalibur e FACScan : CD64 FITC CD163 PE Starfire Red Logaritmo de SSC **Definições de Tensão Apenas para Utilizadores do BDB FACSCanto II : Os citómetros de fluxo BD FACSCanto II requerem instruções de configuração alternativas devido às diferenças na exibição da escala de fluorescência do logaritmo, que é exclusiva do software de recolha do BD FACSDiva utilizado no Canto II. Nota: Defina todos os parâmetros de logaritmo para uma apresentação de 4 dezenas no software de recolha do citómetro de fluxo antes da aquisição. Efetue a análise da suspensão de esferas e implemente os seguintes ajustes aos histogramas de um só parâmetro (consultar o diagrama) O centro do pico no eixo FL1 (FITC) deverá encontrar-se a meio no canal 3000 (a segunda unidade da terceira dezena da intensidade de fluorescência). O centro do pico no eixo FL2 (PE) deverá encontrar-se perto do final da segunda dezena da intensidade de fluorescência. O centro do pico no eixo FL3 deverá encontrar-se a meio no canal 3000 (a segunda unidade da terceira dezena da intensidade de fluorescência). No histograma FS vs SS, a população de esferas deverá encontrar-se no final da terceira dezena do sinal do logaritmo de SS e no canal 25-50 para sinal para a frente ou de dispersão de ângulo baixo. LK64-V11-2013 A4 PT Página 4 de 9
Apenas Utilizadores BD FACSCanto II: CD64 FITC CD163 PE Starfire Red Logaritmo de SSC 5. O limite para exclusão de plaquetas e resíduos de glóbulos vermelhos deverá ser definido no logaritmo de SS utilizando linfócitos. O discriminador no logaritmo de SS deverá ser definido à esquerda da população de linfócitos. Não utilize um conjunto discriminador em dispersão frontal, dado que as esferas serão excluídas da aquisição. 6. As definições de Recolha e Armazenamento deverão ser ajustadas de forma a permitir a recolha de 50 000 eventos não limitados. De um modo geral, recomenda-se a definição da resolução a 1024, sendo que tal é necessário durante a utilização dos citómetros Beckman Coulter Cytomics FC500 ou BD Biosciences FACSCanto. 7. Guarde o modelo das definições e recolha. Repita os passos 4 a 7 com cada novo lote de Leuko64 TM ou após serviços de manutenção do instrumento. ANÁLISE DO FICHEIRO DE DADOS CITOMÉTRICOS Instale o software Leuko64 QuantiCALC incluído no Macintosh ou PC a utilizar para a análise dos dados. Siga as instruções relativas à análise de dados citométricos contidas no ficheiro de Ajuda do software. NOTA: O software é específico de cada lote e os protocolos de utilização são específicos do modelo do instrumento. Terá de confirmar a seleção adequada. ESTRATÉGIA DE CONTROLO DE QUALIDADE PARA O ENSAIO LEUKO64 TM O ensaio utiliza populações de células autólogas dentro da amostra do paciente para controlos positivos e negativos, o que otimiza a avaliação de variáveis pré-analíticas. A população de linfócitos, à qual falta presença de CD64 e CD163 como uma população de controlo negativo e assegura a adição de reagentes adequados e poderá detetar a presença de substâncias fluorescentes dentro da amostra do diagnóstico. A população de monócitos, que tem uma presença constitutiva quer de CD64 quer de CD163, serve como um controlo positivo para certeza de coloração adequada da amostra com o Reagente A. Siga as instruções amigas do utilizador para análise de dados citométricos no âmbito do ficheiro de Ajuda do software Leuko64 TM para mais dados relativos aos controlos positivo e negativo do ensaio. NOTA: O software tem bandeiras e diretivas relacionadas com o controlo. LK64-V11-2013 A4 PT Página 5 de 9
t l H Y C MANUSEAMENTO E ARMAZENAMENTO Guardar os frascos na vertical, bem tapados, a uma temperatura de 2-8C quando não estiverem em utilização. Os frascos por abrir mantêm-se estáveis até ao final da data de validade indicada na etiqueta e na folha de ensaio. Evitar períodos desnecessários de aquecimento e arrefecimento, uma vez que o ensaio é validado para trinta (30) ou menos termociclos. Proteja o produto do congelamento, de temperaturas acima de 30C e de uma exposição prolongada à temperatura ambiente (18-26C) ou à luz. AVISO Todos os componentes deste kit contêm azida de sódio (<0,1% w/ v). Em combinação com ácidos ou metais, este produto químico transforma-se num composto tóxico e perigoso. Manuseie com cuidado. As soluções que contenham azida de sódio deverão ser eliminadas de forma adequada. CONTROLO DA QUALIDADE DO PRODUTO O desempenho e especificidade dos reagentes constantes deste kit são testados utilizando os métodos internos de controlo de qualidade da Trillium. O fabrico deste produto segue linhas orientadoras de produção e de sistema de qualidade em conformidade com as normas FDA QSR e ISO 13485:2003. LIMITAÇÕES DO PRODUTO A utilização terapêutica do interferon gama, G-CSF ou outros agentes que modulem a resposta imunológica inata, são conhecidos como podendo afetar a regulação ascendente da presença do leucócito CD64, afetando, consequentemente, a interpretação do ensaio. Os resultados do Ensaio Leuko64 TM não devem ser utilizados como medida única da inflamação nestes pacientes, mas podem ser utilizados para monitorizar o efeito de tais tratamentos. Devem respeitar-se as condições adequadas de armazenamento e utilização deste produto e das amostras a serem testadas, a fim de obter o melhor desempenho e evitar resultados falsos ou imprecisos. A mistura incompleta do Reagente C antes da utilização poderá invalidar a alíquota retirada e o material restante no frasco. A seleção do protocolo de instrumento ou do número de lote do kit incorreto, quando da ativação do software, pode resultar numa redução da precisão da análise do ficheiro de dados citométricos. O software é específico de cada lote e os protocolos de utilização são específicos do modelo do instrumento. Faça a seleção adequada quando tal lhe for pedido. Qualquer ficheiro relativo a uma amostra de sangue gravemente leucopénica ou neutropénica, que apresente menos de 200 ocorrências de glóbulos brancos limitadas pelo software Leuko64 TM em qualquer uma das 3 categorias (PMN, Linfócito ou Monócito), não pode ser analisada pelo Ensaio Leuko64 TM sem uma redução significativa da precisão do Índice PMN no CD64. LK64-V11-2013 A4 PT Página 6 de 9
Qualquer ficheiro com uma contagem de ocorrência de esferas inferior a 1000 deve ser avaliado para determinar a razão, que pode ser causada por definições de instrumentos incorretas ou por uma amostra de sangue não diluída com glóbulos brancos > 25 x 10 9. Raramente, os instrumentos de citometria de fluxo podem ter filtros colocados numa configuração atípica, na qual FL1 não é o sinal CD64 com FITC e FL2 não é o sinal CD163 com PE, comprometendo, assim, o desempenho do software Leuko64 TM. Contacte o seu fornecedor de instrumentos e a assistência técnica da Trillium Diagnostics para assistência na solução deste ou quaisquer problemas com a utilização do software. CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO Cada laboratório deverá estabelecer um ou vários intervalos aceitáveis para cada lote de Leuko64 TM. O intervalo de referência do Índice PMN no CD64 para amostras de sangue saudável estima-se em 1.00. Geralmente, quanto mais grave a resposta inflamatória sistémica aguda, mais elevado o valor do Índice PMN (e Monócito) no CD64 será medido. Os intervalos de referência estimados dos Índices de Monócitos no CD64 e CD163 não foram estabelecidos. REFERÊNCIAS 1. Davis BH. Improved diagnostic approaches to infection/sepsis detection. Expert Rev Mol Diag 2005;5:193-207. 2. Schiff D, Rae J, et al. Increased phagocyte CD64 expression and improved Fc-receptor mediated phagocytosis following in vivo recombinant human interferon-ɣ treatment of normal human subjects. Blood 1997;90:2987-94. 3. Petroni KC, Shen L, Guyre PM. Modulation of human polymorphonuclear leukocyte IgG Fc receptors and Fc receptor-mediated functions by IFN-gamma and glucocorticoids. J Immunol 1988;140:3467-72. 4. Davis BH, Bigelow NC, et al. Neutrophil CD64 expression: potential diagnostic indicator of acute inflammation and therapeutic monitor of interferon- therapy. Lab Hematol 1995;1:3-12. 5. Guyre PM, Campbell AS, et al. Monocytes and polymorphonuclear neutrophils of patients with streptococcal pharyngitis express increased numbers of type I IgG Fc receptors. J Clin Invest 1990;86:1892-1. 6. Ng PC, Lam HS. Diagnostic markers for neonatal sepsis. Curr Opin Pediatr 2006;18:125-31. 7. Davis BH, Bigelow NC. Comparison of neutrophil CD64 expression, manual myeloid immaturity counts, and automated hematology analyzer flags as indicators of infection or sepsis. Lab Hematol 2005;11:137-47. 8. Leino L, Sorvajarvi K, et al. Febrile infection changes the expression of IgG Fc receptors and complement receptors in human neutrophils in vivo. Clin Exp Immunol 1997;107:37-43. 9. Davis BH, Olsen S, et al. Neutrophil CD64 is an improved indicator of infection or sepsis in emergency room patients. Arch Pathol Lab Med 2006;130(5):654-61. 10. Van der Meer W, Pickkers P, et al. Hematological indices, inflammatory markers and neutrophil CD64 expression: comparative trends during experimental human endotoxemia. J Endotoxin Res 2007;13:94-100. LK64-V11-2013 A4 PT Página 7 de 9
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MARCAS REGISTADAS O software Leuko64 QuantiCALC é abrangido pelos direitos de autor e foi codesenvolvido pela VERITY SOFTWARE HOUSE Topsham, Maine, Estados Unidos www.vsh.com and, LLC Brewer, Maine, USA www.trilliumdx.com FACSCanto e FACScan são marcas registadas da BD Biosciences San Jose, CA, Estados Unidos www.bdbiosciences.com Navios, Gallios Cytomics FC500 and XL são marcas registadas da Beckman Coulter, Inc Brea, CA, Estados Unidos www.beckman.com Leuko64 é um ensaio patenteado, coberto sob a patente norte-americana #8,116,984, patente japonesa #5047803 e aplicação EPO #05851842.4. APOIO AO CONSUMIDOR M P IQ Trillium Diagnostics, LLC PO Box 67 Brewer, Maine, Estados Unidos 04412 Tel 1-207-945-0900 Fax 1-207-942-0346 Técnico info@trilliumdx.com Encomendas por telefone, fax ou no site em www.trilliumdx.com Products BV Rozenburglaan 13a 9727 DL Groningen, Holanda Tel +31 (0) 50 57 57 000 Fax +31 (0) 50 57 57 002 Técnico marketing@iqproducts.nl Encomendas orders@iqproducts.nl Site www.iqproducts.nl LK64-V11-2013 A4 PT Página 9 de 9