QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL

PUC- CAMPINAS CEATEC - CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS, AMBIENTAIS E TECNOLOGIAS FACULDADE DE QUÍMICA 1º semestre/ 2012 QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS MÓDULO I e II ESPECTROANALÍTICA E ANÁLISE TÉRMICA MÓDULO III MÉTODOS DE SEPARAÇÃO: Cromatografia Aulas ministradas por: Profa. Dra. Alessandra Borin Pasta na área FTP: aleborin email: aleborin@puc-campinas.edu.br

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin AULAS PRATICAS DE QUIMICA ANALITICA INSTRUMENTAL Não será permitida a entrada do aluno sem a vestimenta adequada de laboratório, sem jaleco e/ou sem apostila da aula prática; O grupo que não entregar o pré-laudo do experimento no início da aula será descontado 3,0 pontos no respectivo laudo; Duvidas sobre conteudo, criterios de avaliação consultar o plano de disciplina a no site do aluno; A apostila, o cronograma das aulas, modelos do laudo e do pré-laudo, orientações dos seminários estão todos no FTP (pasta aleborin); Para cada experimento o grupo deverá entregar, no inicio da aula, um prélaudo para cada experimento; No término de cada módulo de experimentos cada grupo deverá entregar o conjunto de laudos e o seminário referente ao módulo ( ver as datas no cronograma); Para os laudos seguir o modelo que está no FTP da docente. Será zerada a nota dos grupos que usarem modelos de laudos de anos anteriores; Para os seminários seguir as orientações que também estão no FTP. NÃO É PERMITIDO REALIZAR PARTE PRÁTICA DO EXPERIMENTO FORA DO HORÁRIO DA AULA Materiais de uso comum dos grupos (ATENÇÃO: FAÇAM SEUS CÁLCULOS BASEADOS NESTES VOLUMES) Micropipetas de volume fixo e ponteiras 10µL 20µL 25µL 50µL 100µL 200µL 250µL 500µL 1000µL Frascos âmbar, batoques, tampas, adesivos para armazenamento e identificação de soluções; Balões volumétricos (10 de 10mL, 10 de 25mL, 10 de 50mL, 10 de 100mL, 5 de 250mL, 2 de 500mL), proveta (50 e 100mL), béqueres (5 de 50mL, 5 de 100mL, 5 de 250mL, 5 de 500mL), Pipetas Pasteur, Funil e Papel de Filtro; Pipetas volumétricas e graduadas (2, 5, 10, 25mL), pêras; Papéis de seda para pesagem; Luvas térmicas; Luvas cirúrgicas; USAR PRINCIPIOS DA QUIMICA ANALÍTICA VERDE: Preparar soluções no menor volume possível para o menor consumo de reagentes e para gerar menos resíduos; LER O PROCEDIMENTO E FAZER TODOS OS CÁLCULOS ANTES DA AULA E PARA ENTREGA DO PRÉ-LAUDO Página de 46 2

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin No fim de cada aula prática Cada grupo é responsável por: Descartar todos os resíduos nos frascos (inorgânicos, orgânicos, metais pesados, ácidos, bases) identificados na capela; organizar, armazenar, identificar e conservar suas soluções/ amostras preparadas; organizar e devolver seu material / vidrarias dentro da sua bandeja; em caso de falta/ quebra de algum material/equipamento comunicar ao técnico do laboratório; guardar/ gravar seus resultados, espectros, cromatogramas etc; e, por fim, deixar a bancada limpa e organizada. Tratamento dos dados Quem quiser, pode trazer o notebook para aula prática para realizar os cálculos e preencher o laudo. 3

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin MÓDULO I e II ESPECTROANALÍTICA E ANÁLISE TÉRMICA 4

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin Rodízio de Experimentos Semanas Experimento Grupo 1 1 G1 2 G2 3 G3 4 G4 5 G5 2 1 G2 2 G3 3 G4 4 G5 5 G1 3 1 G3 2 G4 3 G5 4 G1 5 G2 4 1 G4 2 G5 3 G1 4 G2 5 G3 5 1 G5 2 G1 3 G2 4 G3 5 G4 5

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin EXPERIMENTO 1: QUANTIFICAÇÃO DE KMnO 4 EMPREGANDO ESPETROFOTOMETRIA NA REGIÃO DO VISÍVEL Introdução: A variação da cor de um sistema com a mudança da concentração de um componente é a base da análise colorimétrica. A cor é, usualmente, devida à formação de um composto colorido pela adição de um reagente apropriado ou é inerente ao constituinte que se deseja analisar. A intensidade da cor é comparada com a intensidade da cor que se obtém com o mesmo procedimento pelo tratamento de uma amostra cuja quantidade e concentração são conhecidas. A análise espectrofotométrica, um tipo específico de colorimetria, usa-se uma fonte de radiação na faixa da região do visível até o ultravioleta do espectro. Para isso, escolhe-se comprimentos de onda de radiação bem-definidos e com largura de banda de menos de um nanômetro, normalmente através de um espectrofotômetro. Equipamentos, materiais e reagentes: Solução KMnO 4 (10-4 mol/l) Espectrofotômetro Femto 600 1 Pêra 1 pisseta água destilada 1 cubeta de plástico ou vidro Papel higiênico Experimental: 1º - Observação e familiarização com o equipamento. Tentar identificar as partes do equipamento 2º - Preparo da solução estoque e das soluções trabalho para a construção da curva analítica Preparar, a partir da solução estoque de KMnO 4 ; (Qual será a concentração desta solução estoque?) Atenção: Quando for pesar o KMnO 4 forrar cuidadosamente a balança; Preparar 5 soluções trabalho para a construção da curva analitica. (Qual será a faixa de concentração desta curva analitica?) (ATENÇÃO: a amostra estará com uma concentração entre 4,0.10-5 M e 6,0.10-5 M); Completar o volume do balão volumétrico com água destilada. 3º - Seleção do comprimento de onda na região do visivel (400 a 700 nm) Utilizando-se água destilada como referência ( branco ) - (ATENÇÃO: toda vez que mudar o comprimento de onda realizar a leitura do branco ); Realizar a leitura da solução do ponto do meio da curva analítiva na região do visivel de 30 em 30 nm e anotar suas respectiva absorbância; Em seguida, escolher 3 comprimentos de onda: 1) o máximo de absorbância; 2) um mínimo de absorbância; 3) um ponto intermediário em um aclive da curva. 6

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin 5º - Leitura das soluções trabalho e da amostra Para os três comprimentos de onda (máximo, intermediário e mínimo) realizar a leitura das 5 soluções trabalho e da amostra; A água é a solução de referência; Medir a absorbância da amostra. 6º - Cálculo da concentração da amostra Construir, para cada comprimento de onda, uma curva de calibração (absorbância versus concentração); Utilizando-se destas curvas de calibração, determine a equação da reta que relacione as duas grandezas; Determine a concentração da amostra nos 3 comprimentos de onda. Qual a melhor curva? Por quê? Bibliografia: SKOOG, D. A. e LEARY, J.J. Principles of Instrumental Analysis. Saunders College Publishing, New York, 4 ed. 1992. HARRIS, D. C., Análise Química Quantitativa. 6ª Ed. Rio de Janeiro, LTC, 2003. 7

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin EXPERIMENTO 2: DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PARECETAMOL EM UM MEDICAMENTO POR ESPECTROFOTOMETRIA NA REGIÃO DO ULTRAVIOLETA Introdução: Neste experimento será utilizada a Lei de Beer para determinar o teor de parecetamol (figura 18) em um medicamento por espectroscopia por absorção no ultravioleta. Sabe-se que compostos contendo duplas ligações, especialmente as conjugadas, absorvem fortemente na região do UV. A radiação nesta região leva a transições dos orbitais HOMO (orbital ocupado de maior energia) para o LUMO (orbital não ocupado de menor energia). Figura 18- Estrutura química do paracetamol ou N-(4-hidroxifenil)acetamida) Figura 19- Exemplo de espectros na região do Ultravioleta [1] Equipamentos, materiais e reagentes: 1 Comprimido - Genérico Medley - 750 mg paracetamol (excipientes: ácido esteárico, amido, crospovidona, dióxido de silício coloidal, estearato de magnésio, macrogol, povidona) e cada comprimido pesa em torno de 900mg. Espectrofotômetro HP 8452 A (Arranjo de diodo) 1 Cubeta de quartzo 1 Pêra 1 funil Papel Filtro almofariz Paracetamol padrão USP HCl concentrado 37% (capela) Metanol Experimental: 1º - Observação e familiarização com o equipamento. Tentar identificar as partes do equipamento 8

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin Figura 20 Exemplo de um espectrofotômetro Ultravioleta- Visível [1] Figura 21 Diagrama esquemático do banco óptico de um espectrofotômetro Ultravioleta- Visível [4] 9

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin 2º - Preparação da solução HCl 0,1 mol/l Preparar o volume necessário para este experimento de uma solução HCl 0,1 mol/l. Evite desperdícios de solvente e reagente, e também gere menos resíduos. (FAZER NA CAPELA) 3 - Preparação da amostra (Fazer na capela) Anotar a massa de um comprimido e a concentração mencionada na lista de materiais deste experimento; Macerar este comprimido, pesar 30mg e transferir esta massa para um balão de 50mL. Completar o volume com metanol e homogeneizar (CAPELA); Transferir 1 ml da solução resultante para outro balão volumétrico de 50 ml. Adicionar 400µL ácido clorídrico 0,1 mol/l (proporção 200µL de HCl 0,1 mol/l para cada 25mL de solução), completar o volume com metanol e homogeneizar. Qual é a concentração de paracetamol prevista nesta amostra? Você precisará desta informação para construir a curva analítica 4º - Preparação da solução estoque de paracetamol Preparar uma solução estoque de paracetamol (Qual será a concentração desta soluão estoque?). Completar com metanol e homogeneizar. (FAZER NA CAPELA, o metanol pode afetar a retina e cegar) 5º - Cálculos de diluição e preparo das 5 soluções para curva de calibração Preparar 5 soluções trabalho a partir da solução estoque de paracetamol; Lembre-se que em todas as soluções, adicionar de HCl 0,1 mol/l ( proporção 200µL de HCl 0,1 mol/l para cada 25mL de solução), completar o volume com metanol e homogeneizar. 6º - Preparação da solução branco Adicionar 100µL de HCl 0,1 mol/l em balão volumétrico de 10mL. Esta solução branco será usada para ajustar o zero. 7º - Encontrar o comprimento de onda máximo fazendo uma varredura em toda a região do Ultravioleta Medir as absorbâncias da solução padrão de maior concentração para encontrar o comprimento de onda máximo. 8º - Tabelar os resultados e construir as curvas de calibração na planilha Excel 9º - Calcular a quantidade de paracetamol em um comprimido, a partir das leituras obtidas da amostra. Curiosidade: Através desta técnica analítica é possível verificar se os óculos de sol protegem mesmo dos raios UV. 10

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin Bibliografia: [1] SKOOG, D. A. e LEARY, J.J. Principles of Instrumental Analysis. Saunders College Publishing, New York, 4 ed. 1992. [2] FARMACOPÉIA BRASILEIRA, VOL IV, 2001, p. 167.2 [3] VOGEL, Análise Química Quantitativa, 6ªed., LTC Editora, Rio de Janeiro, 2002. [4] HARRIS, D. C., Análise Química Quantitativa. 6ª Ed. Rio de Janeiro, LTC, 2003. 11

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin EXPERIMENTO 3: TITULAÇÃO POTENCIOMÉTRICA DE UM ÁCIDO FRACO TRIPRÓTICO COM BASE FORTE: DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO FOSFÓRICO EM REFRIGERANTES À BASE DE COLA Introdução: Pode-se determinar a concentração de ácido fosfórico (H 3 PO 4 ) em refrigerantes por titulação potenciométrica de neutralização. Observa-se a neutralização do H 3 PO 4, pelo segundo salto potenciométrico, pois, de acordo com as suas constantes de ionização, verifica-se que o 3ºH deste ácido, praticamente, não sofre ionização. K a1 = 7,1.10-3 K a2 = 6,32.10-8 K a3 = 4,5. 10-13 Baseado nisso, a equação química para os cálculos será: H 3 PO 4 + 2NaOH Na 2 HPO 4 + 2H 2 O O limite máximo permitido pela legislação é de 0,06g de H 3 PO 4 em 100mL de refrigerante. O valor do H 3 PO 4 se refere ao refrigerante desgaseificado, sem a presença de CO 2. Materiais e reagentes: Refrigerante de cola Soluções tampões de ph 4,0 e 7,0 (ou 6,86) Solução de NaOH 0,1 mol.l -1 recém-preparada e padronizada. Pipeta volumétrica de 25,00 ml; Bureta de 50,0 ml; Suporte universal e garra para bureta; phmetro com eletrodo de vidro combinado; Experimental: 1º - Preparação da amostra Colocar todo o volume da amostra ( 350mL) em um béquer; Ferver, durante 20 minutos, a fim de eliminar o CO 2 e resfria-lo em lugar ao abrigo do ar. (enquanto isso calibre o phmetro). 2º - Calibre o eletrodo EVC Procedimento de calibração detalhado página 14. Localização do ponto de equivalência (p.e.) Medir, exatamente, 100mL da amostra desgaseificada, para dentro de um béquer ( fazer isto em triplicata). Mergulhar na solução o EVC previamente calibrado. Tomar cuidado para que a barra magnética não toque no bulbo do EVC. Preencher a bureta com a solução de NaOH, ler o ph inicial e proceder a titulação, adicionando de 1,0 em 1,0 ml do titulante, para localizar o p.e. 12

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin 3º - Conhecendo a região do ponto de equivalência, titular com ajuste fino para a construção dos gráficos para determinação mais exata do ponto de equivalência Com uma nova alíquota repetir a titulação com adições de 0,5 ml nas regiões distantes do ponto de equivalência e 0,1 ml nas proximidades do mesmo. Titular em triplicata. 5º - Tabelar os resultados 6º - Construir as curvas: ph x V(mL) ph/ V x V (ml) 2 ph/ V 2 x V (ml) 7º - Determinar a concentração de H 3 PO 4 na amostra. 8º - Calcular a média e a estimativa do desvio padrão amostral dos resultados obtidos. Bibliografia: SKOOG, D. A. e LEARY, J.J. Principles of Instrumental Analysis. Saunders College Publishing, New York, 4 ed. 1992. SCHNEIDER, N. S. H. Fundamentos da Potenciometria. O Autor, Santa Maria,2000. Informações adicionais Eletrodo de vidro Dentro dos eletrodos de membrana, este é o mais importante sensor a íons H +. Há o estabelecimento de uma diferença de potencial (d.d.p.) na membrana de vidro, devido a diferença de concentração entre os íons H + dentro e fora da membrana. 13

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin Figura 1- a) Esquema do eletrodo de vidro; b) eletrodo de vidro combinado (EVC) Calibração do eletrodo de vidro para medida de ph O eletrodo de vidro está sujeito ao potencial de assimetria, devido à tensão física do vidro e, sendo assim, é necessário calibrar regularmente este sensor. 1. Fazer a conexão do eletrodo de vidro combinado ao potenciômetro (phmetro) 2. Ligar o potenciômetro à rede elétrica. Aguardar de 15 a 20 minutos para a estabilização. 3. Mergulhar o eletrodo na solução tampão ph 7,0. Aguardar a estabilização neste ph e, se necessário, ajusta-lo a esse valor. 4. Retirar o eletrodo da solução tampão, lavar com água destilada e secar com papel absorvente macio. 5. Mergulhar o eletrodo na solução tampão ph 4,0. Aguardar a estabilização neste ph. Se não atingi-lo, fazer somente um pequeno ajuste. 6. Repetir o item 4. 14

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin 7. Proceder desta forma, repetindo as etapas de 3 a 6, até que os valores de ph 4,0 e 7,0 sejam atingidos sem a necessidade de ajuste. Neste ponto o eletrodo está apto para fazer medida do ph da amostra. Observações: 1. A s soluções tampões de ph devem ser mantidas em geladeira; 2. Os potenciômetros (phmetros) mais modernos são computadorizados, e o eletrodo de vidro é auto-calibrado com as soluções tampões de ph; 3. As soluções tampões de ph devem ser escolhidas, para a calibração, de acordo com o ph, no ponto de equivalência, do sistema titulante/titulado ou, na potenciometria direta, escolhe-se duas soluções tampões, por exemplo, 7,0 e 4,0. Sempre: lavar e secar o eletrodo antes e depois de mergulhar em qualquer solução; manter o eletrodo de vidro combinado em solução de KCl 3 mol.l -1 ou saturada, levemente acidificada, quando fora de uso. Determinação do Ponto de equivalência Muitos métodos podem ser usados para determinar o ponto de equivalência de uma titulação potenciométrica. Quando se faz uma titulação, deve-se detalhar os volumes nas imediações do ponto de equivalência, acrescentado-se os volumes do titulante de 0,1 em 0,1 ml, para se obter um melhor resultado. O experimento deve ser realizado em duplicata, ou, ainda melhor em triplicata. A partir do registro dos valores de potencial por volume adicionado, obtém-se o seguinte gráfico: 15 Figura 2 - Curva de titulação E (mv) x V(mL) Este gráfico, normalmente, resulta em uma curva em forma de S, sendo que a metade da parte reta da curva corresponde ao ponto de equivalência. Para se confirmar este valor, constrói-se o segundo gráfico (Figura 3) que tem, no eixo das ordenadas, a diferença dos potenciais consecutivos ( E), dividido pela diferença

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin dos volumes consecutivos ( V) e, no eixo das abscissas, o volume V, sendo descrito pela Equação 1: V i + V( i +1) V ' = (Eq. 1 ) 2 onde: V i e V (i+1) = volumes consecutivos Desta forma, obtém-se, claramente, o ponto de equivalência, obtendo-se um ponto máximo ou um ponto de mínimo. Figura 3 - Gráfico E/ V x V Um terceiro gráfico, ainda, pode ser construído, que é o E 2 / V 2 abscissas, V, que é: ' ' V i + V( i + 1) V '' = (Eq. 2) 2 sendo: V 1 + V (i+1) = volumes consecutivos e, no eixo das A segunda derivada E 2 / V 2 é uma extensão do método da primeira derivada. O ponto, no qual o gráfico corta o eixo das abscissas (volume V ), é onde a inclinação é zero e este valor deve corresponder, exatamente, ao máximo ou mínimo da curva da primeira derivada e à metade da parte reta da curva em forma de S. 16

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin Figura 4 - Gráfico V E 2 / V 2 x Tabela1: Exemplo de dados de uma titulação potenciométrica de 50,0mL de uma amostra de Fe 2+, usando como titulante solução de Ce 4+ 0,10 mol.l -1. V(mL) E(mV) E/ V V E 2 / V 2 V 1,00 373 10,5 3,00-1,31 5,25 5,00 415 4,6 7,50-0,08 10,00 10,00 438 4,2 12,50 0,44 15,00 15,00 459 6,4 17,50 1,86 19,00 Baseando-se nos mesmos cálculos, os gráficos também podem ser construídos substituindo o E pelo ph, como pode ser observando na Figura 5. 17

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin Figura 5 - Gráficos de ph x V (ml) ph/v x V 18

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin EXPERIMENTO 4: DETERMINAÇÃO DE FERRO EM ALIMENTOS POR ESPETROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA Introdução: O ferro é um nutriente importante para a manutenção da concentração de hemoglobina no sangue e sua carência na dieta, é responsável pela anemia ferropriva, o tipo mais comum de anemia nutricional. O enriquecimento de farinhas com ferro, já é realizado em alguns países, desde a década de 40. Em 2002, no Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) por meio da Resolução N 344, ins tituiu a obrigatoriedade do enriquecimento de farinhas de trigo e milho com ferro (4,2 mg a cada 100 g de farinha). Equipamentos, materiais e reagentes: 2 balões volumétricos de 100mL 5 balões volumétricos de 50mL 1pipeta graduada de 5mL 1 pipeta graduada de 10mL Água deionizada Espectrômetro de Absorção atômica Perkin Elmer Analyst 300 Solução padrão de Ferro 1000mg/L (1000ppm) Ácido nítrico concentrado (65%, d-1,39g/ml) 1 Pêra Experimental: 1º - Limpeza das Vidrarias (Já pronta para a aula) Lavar todas as vidrarias em banho de detergente, enxaguar com água da torneira até total eliminação de espumas. -Colocar todas as vidrarias em banho de ácido (nítrico ou clorídrico comerciais) 10% (v/v). As vidrarias devem estar completamente preenchidas com o banho (sem bolhas de ar no interior). Não colocar metais dentro do banho. -Manter as vidrarias no banho por, pelo menos, 12 horas. -Enxaguar as vidrarias (no mínimo 4 vezes) com água deionizada. -Deixar secar ao ar livre ou em estufa. Não colocar os materiais volumétricos na estufa. 2º - Abertura da amostra Mineralização das amostras (Já pronta para a aula) -Utilizando papéis vegetais, pesar cerca de 0,6000 g de amostra em papel vegetal. Anotar os valores até a quarta casa decimal. -Transferir, cuidadosamente, esta massa para tubos de digestão. -Evitar a deposição de amostras na parede do tubo de digestão. -Pesar novamente o papel vegetal e verificar se a amostra foi totalmente transferida para o tubo. -Descontar, da massa original, qualquer resíduo que tenha ficado no papel vegetal. -Levar os tubos contendo as amostras para uma capela. -Com o auxílio de uma pipeta volumétrica de 10 ml, medir 10 ml de ácido nítrico concentrado e adicionar 4 ml em cada tubo de digestão (utilizar luvas, óculos de segurança e pêra de borracha). -Preparar, também, dois tubos brancos (tubos sem as amostras). Adicionar ácido a 2 tubos vazios. -Posicionar pequenos funis na entrada de cada tubo de digestão (inclusive nos brancos). 19

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin -Levar os tubos de digestão para o bloco digestor e iniciar o aquecimento. -Ajustar a temperatura para 100 o C. Os funis permitirão que o ácido nítrico fique em refluxo. -Manter o aquecimento por no mínimo 2 horas. -Retirar os tubos do aquecimento. -Aguardar o resfriamento. -Adicionar, cuidadosamente, 2 ml de peróxido de hidrogênio em cada tubo (inclusive nos brancos). Esta adição pode ser efetuada através dos funis. -Voltar os tubos para o aquecimento e, desta vez, ajustar a temperatura para 110 o C. Manter nesta temperatura por 30 minutos. -Aumentar a temperatura para 130 o C e manter por 1 hora. -Durante o processo de mineralização os tubos devem ser, periodicamente, visualizados para evitar que o ácido nítrico seque. -Retirar os tubos do bloco e aguardar o resfriamento. -Com o auxílio de uma pisseta, adicionar uma pequena quantidade de água (5 ml) aos tubos de digestão. Fazer com que a água passe pelo funil e escora pelas paredes dos tubos. -Posicionar os tubos em um banho de ultra-som por alguns segundos (5 a 10 s) ou em um agitador de tubos (caso nenhum destes equipamentos esteja disponível, agite os tubos, repetidas vezes, com a mão). -Transferir, cuidadosamente, o conteúdo dos tubos para balões volumétricos de 25 ml (utilize os funis). -Repetir este processo até o preenchimento dos balões. -Transferir as amostras para frascos de plástico devidamente identificados. -Efetuar as determinações de ferro em equipamento. 3 º - Observação e familiarização com o equipamento. Tentar identificar as partes do equipamento Figura 24 Esquema em blocos de um espectrômetro de absorção atômica 4º - Preparando o espectrômetro de absorção atômica Ligar gases Conecte a lâmpada do metal a ser determinado (Fe). 20

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin Ligue o instrumento. 5º - Configurações no espectrômetro de absorção atômica Pressão dos gases: Lâmpada de cátodo oco: Corrente da lâmpada: Comprimento de onda: 6º - Preparar solução HNO 3 0,01 mol/l Preparar o volume necessário (sem desperdicios) de HNO 3 0,01 mol/l a partir da solução de ácido nítrico concentrado, 65% e densidade de 1,39 g/ml. 7º - Construindo curva de calibração. Cálculos de diluição. Solução estoque de Fe de 1000ppm (já pronta) Com as vidrarias disponíveis na bandeja do grupo, preparar, a partir da solução estoque, 6 soluções trabalho (Qual será a faixa de concentração desta curva? Sabe-se que a amostra pode ter de 3 a 5 ppm (mg/kg ou mg/l); Completar com solução HNO 3 0,01 mol/l 8º - Leitura das soluções para curva de calibração e da amostra. Branco será a solução de HNO 3 0,01 mol/l Homogeneizar a amostra (previamente preparada item1) e fazer a leitura no equipamento. 9º - A partir da equação da reta da curva de calibração faça os cálculos da quantidade de ferro no alimento. Bibliografia: SKOOG, D. A. e LEARY, J.J. Principles of Instrumental Analysis. Saunders College Publishing, New York, 4 ed. 1992. HARRIS, D. C., Análise Química Quantitativa. 6ª Ed. Rio de Janeiro, LTC, 2003. BATISTA FILHO, M. Rev. Bras. Saúde Matern. Infant., 2004, 4 (2): 121-123. SOEIRO, B T; BOEN, T R; PEREIRA FILHO, E R; LIMA-PALLONE J A; Avaliação de Ácido Fólico e Ferro em Farinhas de Trigo Enriquecidas, 29ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2006. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 2005. Legislação em Vigilância Sanitária. www.anvisa.gov.br/e-legis. (Acessado em 29 de Março de 2008) 21

PUC-Campinas / Faculdade de Química/ Apostila Química Analítica Instrumental Profa.Dra. Alessandra Borin EXPERIMENTO 5: ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA DE POLÍMERO PET Introdução: A análise termogravimétrica (Thermogravimetric Analysis - TGA) mede a quantidade e a velocidade da mudança de peso de um material em função da temperatura ou tempo em atmosfera controlada. Estas medidas podem auxiliar na caracterização do material bem como prever sua estabilidade térmica, com perda ou aumento de massa devido decomposição, oxidação ou desidratação. Equipamentos, materiais e reagentes: Netzch Thermal Analysis Amostra de polímero PET previamente lavado (Deve ser lavado somente com água e seco em estufa a 180 C durante 12hs) (REBRAPET). Experimental: 1º - Observação e familiarização com o equipamento. Tente identificar as partes do equipamento 2º - Configurações no TGA Ligar refrigerador e verificar nível da água Gás proteção : N 2 Atmosfera: O 2 Ligar controlador do TGA Ligar TGA Ligar Software > abrir método Velocidade de aquecimento: 20ºC/min Tempo de corrida: 45min Fluxo O 2 : 15 20mL Fluxo N 2 : 30mL Rampa contínua de 20ºC(temperatura amb) 990ºC Temperatura Final :1000ºC Figura 25: PET pós-consumo em forma de flakes 3º - Leitura Limpeza dos cadinhos de porcelana Lavar com água régia (3HNO 3 :HCl) e depois secar em mufla a 1000ºC. 4º - Etapas no Software do TGA: 1. Tarar balança vazia do TGA (este é no equipamento) 2. Tarar o cadinho vazio no TGA 3. Tarar a balança vazia novamente. 4. Colocar o material no cadinho 5. Pesar no TGA 6. Verificar condições de operação 7. Tarar novamente a balança 8. Começar a análise (start) 9. Obtido o termorgrama, ir no software TA analysis, colocar temperatura no eixo x e fazer o alisamento (smooth) 10. Fazer a derivada do termograma 11. Exportar no formato ASCII 22

5º - Interpretar o termograma Bibliografia: SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A., Princípios de Análise Instrumental. 5ª Ed. Porto Alegre, Bookman, 2002. REBRAPET. Disponível em http://rebrapet.com.br/oqepet.htm. Acesso em 04/2009

MÓDULO III MÉTODOS DE SEPARAÇÃO Rodízio de Experimentos Semanas Experimentos Grupos 6 e 7 6 1 e 2 7 3 e 4 8 5 e 6 9 7 e 8 8 e 9 6 3 e 4 7 5 e 6 8 7 e 8 9 1 e 2 10 e 11 6 5 e 6 7 7 e 8 8 1 e 2 9 3 e 4 12 e 13 6 7 e 8 7 1 e 2 8 3 e 4 9 5 e 6 24

EXPERIMENTO 6: Cromatografia clássica: 6A- Isolamento dos pigmentos do extrato de páprica e de espinafre por cromatografia em coluna clássica. 6B Separação de corantes artificiais de gelatina em pó por cromatografia em papel. Introdução: A cromatografia é um método de análise que ocupa um lugar de destaque em vários campos da Ciência (Química, Bioquímica, Engenharia de Alimentos etc.) devido à sua praticidade de efetuar separações, permitindo identificar e quantificar variadas misturas de compostos químicos. Quando uma amostra de uma mistura corre por um suporte apropriado, líquido ou sólido, seus componentes interagem de maneiras diferenciadas com o material-suporte, de acordo com a maior ou menor afinidade química existente entre eles. [1,4,6] 1º DIA ( revezamento de grupos) 1- Isolamento dos pigmentos do extrato de páprica por cromatografia em coluna A páprica é um condimento de cor vermelha-intensa preparada a partir do pimentão vermelho (Capsicum annuum) seco e moído, sendo utilizado tanto na culinária como na agroindústria. Os principais pigmentos isolados da páprica são o β-caroteno e a capsantina. [1] Materiais e reagentes: 3 Béqueres (100 ml) Funil e papel filtro 2 Provetas (50 ml) Bagueta Pipeta graduada 2mL Chapa de aquecimento Solução de KOH 30% em álcool etílico Páprica Açúcar refinado Algodão Éter de petróleo Acetona Coluna de vidro 3 tubos tipo penicilina Frasco para resíduos 1º - Extrato de páprica (Fazer na capela) Pese 1,0 g de páprica e dissolva em 25 ml de éter de petróleo; Deixe 5 min a 40 C e 10 min a temperatura ambient e e filtre. Adicione ao sobrenadante 1,5 ml de KOH 30% em álcool etílico, deixando a mistura em repouso por 10 min. Concentre a solução a 1 ml em chapa de aquecimento a 40-50 C por aproximadamente 5 min. 2º Separação em coluna cromatográfica Utilize coluna cromatográfica de vidro (Figura 1) usando açúcar refinado (Figura 3) como fase estacionária, empacotando-a com éter de petróleo. Adicione à coluna o total de extrato obtido, conforme descrito acima. Elua com éter de petróleo (separação da banda amarela de β-caroteno Figura 2.1), seguido de mistura 1:1 de éter de petróleo-acetona e finalmente acetona (separação da banda vermelha da capsantina Figura 2.2). 25

Recolha frações de 10 ml cada. Figura 1 Separação do extrato de páprica em coluna cromatográfica com fase estacionária de a) açúcar refinado e b) sílica gel. Fase móvel: éter de petróleo/acetona. Figura 2 (1) Estrutura química do β-caroteno; (2) Estrutura química da capsantina 26

Figura 3 Estrutura química do açúcar (sacarose) usado como fase estacionária [3]. Na Figura abaixo é apresentada uma lista de algumas fases móveis. Apolar Polar Figura 4 - Tabela com alguns solventes e suas características [4] 27

1b- Isolamento dos pigmentos do Espinafre por cromatografia em coluna A clorofila é facilmente identificada nas plantas, pois é a responsável pela coloração verde das mesmas. A clorofila a é a mais abundante no reino vegetal, sendo encontrada, juntamente com a clorofila b, numa proporção de 3:1, respectivamente [7]. Materiais e reagentes: Béquer de 600mL e 1000mL 2 Béqueres de 100mL 1 giz inteiro (CaSO 4 ) Luvas Acetona Éter de petróleo 2 almofariz Folhas de espinafre fresco Algodão 2 Funis Papel de filtro Seringa de vidro de 20mL 1 pipeta Pasteur ou conta-gotas Preparo do extrato de espinafre (Fazer na capela) Pese aproximadamente 30 g de folhas de espinafre e transfira para um gral. Utilize uma mistura de éter de petróleo e acetona (8:2) e triture as folhas com o pistilo. Separe a solução verde obtida por filtração. Giz triturado como fase estacionária de coluna cromatográfica Triture um giz e adicione a um béquer contendo 10mL de éter de petróleo. Agite a mistura obtida e transfira, com o auxílio de um funil, para o interior da coluna contendo um pedaço de algodão em uma das extremidades. 28

Espere até o éter de petróleo atingir o nível do recheio da coluna, deixando o solvente escorrer por gravidade, evitando desta forma uma compactação maior do giz triturado, o que tornaria a cromatografia bastante lenta. Adicione com o conta-gotas aproximadamente 3 ml do extrato do espinafre. Deixe o extrato penetrar pela fase estacionária da coluna e adicione, lentamente o éter de petróleo. Colete toda a banda amarela, mude o solvente para acetona e colete a banda verde. Éter de Petróleo 2º DIA 2 Separação de corantes artificiais de gelatina em pó por cromatografia em papel Muitos alimentos possuem corantes artificiais em sua composição (Tabela abaixo) [2]. 29

Os corantes artificiais permitidos pela legislação brasileira são derivados ácidos. Nas Figuras 5 e 6 são apresentadas algumas estruturas químicas de alguns corantes artificiais usados na indústria alimentícia. Figura 5 - Tartrazina (Corante Azo) Figura 6 - Eritrosina (Corante Xanteno) 30

Materiais e reagentes na bandeja: 2 amostras de gelatina em pó Papel de filtro qualitativo Pipeta volumétrica de 1 e 5 ml 1 pêra Proveta de 50 e 100mL 2 Béqueres de 500mL 4 béqueres de 50mL 4 béqueres de 100mL Fio de lã pura branca (20 cm) Pisseta com água destilada capilar de vidro espátula Bagueta 2 vidros relógio Secador manual Chapa de aquecimento Frasco para resíduos Ácido acético PA Etanol PA Cloreto de Sódio hidróxido de amônio (NH 4 OH) 2%(v/v) Materiais e reagentes de uso comum: Tesoura Pipeta de Pasteur Lápis Régua Experimental: 1º) Preparo da amostra: Para alimentos solúveis em água, dissolva cerca de 5g de pó de gelatina em 10-20 ml de água destilada (suficiente até saturar a solução). 2º)Preparo da lã para extração do corante: Os corantes artificiais permitidos pela legislação brasileira são derivados ácidos e, por isso, podem ser fixados em lã tratada previamente com uma base. Para o preparo da lã ferva-a em aproximadamente 30 ml de uma solução aquosa de NH 4 OH 2% v/v até que a mesma fique leitosa. Retire a lã desta solução. Em seguida, ferva-a novamente em água destilada para a eliminação do excesso da base. 3º) Extração e separação dos corantes Adicione a lã tratada com a base na solução obtida após o preparo da amostra. Aqueça esta solução até a fervura, deixando-a sob aquecimento por alguns minutos até que se observe a fixação da cor do corante na lã. Nesta etapa, os corantes presentes na amostra (naturais e artificiais) são adsorvidos na lã. Lave a lã sob água corrente para eliminar o açúcar contido na amostra e transfira a mesma para um béquer contendo novamente a solução de NH 4 OH 2% v/v (aprox. 5 ml). Aqueça lentamente a solução até a sua fervura para que os corantes sejam transferidos da lã para a solução amoniacal. A extração da cor pela base indica a presença do corante ácido. Retire a lã e evapore parte da água da solução obtida para que o extrato final seja concentrado. Este é o extrato que deve ser aplicado no papel. 31

Corrida cromatográfica: Serão testadas duas fases móveis: 1 Solução aquosa com 2% m/v de NaCl (usar como solvente: solução 50% v/v Agua: Etanol) 2 Contendo 60mL de etanol + 20 ml de água destilada Prepare duas cubas cromatográficas (serão béqueres) para cada corrida cromatográfica; Adicione fase móvel dentro do béquer até que a mesma atinja uma altura de 1 a 2 cm. Tampe cada béquer com vidro relógio e deixe o conjunto em repouso por 15 minutos para que se estabeleça o equilíbrio de vapor da fase móvel (saturação da cuba). Corte um pedaço de papel de filtro conforme tamanho de cada béquer; Sobre uma superfície limpa e usando um lápis (não pode ser caneta de qualquer espécie), trace levemente uma linha horizontal 2,5 cm da extremidade inferior do papel cromatográfico. Usando um capilar de vidro, adicione o extrato da sua amostra. Seque com secador e repita isso 5 vezes. (CUIDADO PARA O SECADOR NÃO QUEIMAR O PAPEL) Se, ao adicionar o corante, usando um capilar sobre a linha traçada, este se espalhar muito, descarte o papel e comece a adição do ponto em um novo papel. Coloque o papel na cuba já saturada, sem que o mesmo encoste nas paredes do béquer, cobrindo novamente com o papel alumínio. Remova-o quando os corantes deixarem de se mover e deixe-o em uma superfície limpa e seca, preferencialmente em um papel toalha branco. Trace uma linha onde o solvente parou. Deixe o papel secar (Figura 7). Meça as distâncias para calcular os fatores de retenção (R f ) de cada componente separado (dc distância percorrida pelo analito; dm distância percorrida pela fase móvel) R f = d c / d m 32

Figura 7 Representação esquemática do cromatograma obtido no experimento. D fm = distância percorrida pela fase móvel; D c = distância percorrida por corantes. Na figura abaixo é apresentada a estrutura da celulose presente no papel que é o suporte para a fase estacionária. Figura 8 Estrutura química da celulose [5] 3º - Medir os índices de retenção da cromatografia em papel. Distância percorrida pela fase móvel (dm) : Distância percorrida pelo analito (dc): 33

Bibliografia: 1 da SILVA, L B, ALLES M I, MOREL A F M, DALCOL I I, Produtos naturais no Ensino de Química: Experimentação do Extrato de Páprica, Química Nova na Escola, 23, 2006, 52-53. 2 - FRACETO, F, de LIMA, S L T, Aplicação da cromatografia em papel na separação de corantes em pastilhas de chocolate, Química Nova na Escola, 18, 2003, 46-48. 3 BOBBIO F O, BOBBIO P A, Introdução à Química de Alimentos, Editora Unicamp, Campinas, 1985. 4 - COLLINS, C. H. et al., Fundamentos de Cromatografia.Campinas, Editora Unicamp, 2006. 5 - RIBEIRO E P, SERAVALLI E A G, Química de Alimentos, Editora Edgard Blucher, 2ªEd, São Paulo, 2007. 6 Prado M A, Godoy H T, Determinação de corantes artificiais por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em pó para gelatina, Química Nova, 27(1), 2004, 22-26. 7 de Oliveira A R M et al, Cromatografando com giz e espinafre: um experimento de fácil reprodução nas escolas de ensino médio, Química Nova na Escola, 7, 1998, 37-41. 34

EXPERIMENTO 7: Construção de rampa de temperatura em Cromatografia Gasosa. Análise Qualitativa e Quantitativa. Introdução: A cromatografia gasosa é uma técnica com um poder de resolução excelente, tornando possível, muitas vezes, a análise de dezenas de substâncias de uma mesma amostra. Um dos principais motivos que tornam a cromatografia gasosa de uso bastante acentuado é a sua sensibilidade. Dependendo do tipo de substância analisada e do detector empregado, conseguese detectar cerca de 10-12 g. [1] Depois do tipo de fase estacionária, a temperatura da coluna é o fator que mais afeta a separação. O aumento na temperatura da coluna resulta em diminuição dos tempos de retenção, mas causa uma perda de resolução. A temperatura da coluna pode ser mantida constante durante toda a análise (isotérmica) ou aumentada linearmente ou não (programação de temperatura) [1]. Exemplos de cromatogramas obtidos por análise isotérmica e por rampa de temperatura são apresentados na Figura 9. Figura 9 Comparação de uma separação de alcanos sob condição isotérmica(a) e com programação de temperatura (b). [1] Na Figura 10 são apresentados alguns exemplos de fase estacionária usada na cromatografia gasosa. [1] 35

Figura 10 Tipos de fases estacionárias [1]. Materiais e reagentes na bandeja: 1 pêra Luvas tolueno (solvente) grau HPLC n-hexano, 1-butanol grau HPLC Materiais e reagentes de uso comum: Balança Analítica Cromatógrafo a GásHP-5890 com detector de ionização em chamas (Fase móvel: nitrogênio e coluna cromatográfica Carbowax 20M (polietilenoglicol). seringa cromatográfica 10 µl. Micropipetas, ponteiras Pipetas Pasteur 36

1º DIA Análise Qualitativa construção da rampa de temperatura do forno para corrida cromatográfica 1º Observe o equipamento 2º Anote os ajustes iniciais do Cromatógrafo a. Verifique a coluna do cromatógrafo b. Verifique a temperaturas iniciais do injetor, detector e do forno. Temperatura do injetor: Temperatura do detector: Temperatura inicial do forno: c. Ligue os gases do detector (Hidrogênio, oxigênio nitrogênio) e o acenda a chama do FID Gás de arraste: d. defina a técnica de injeção das amostras (split/ splitless) 3º Construção da curva de temperatura para separação dos picos no cromatograma 3.1. Para construir a rampa de temperatura do forno do cromatógrafo: Verifique o ponto de ebulição de cada padrão e do solvente na Tabela abaixo: Tabela 3: Pontos de ebulição de alguns solventes a 760mmHg Substância Ponto Ebulição (ºC) Substância Ponto Ebulição (ºC) Acetato de etila 56,9 o-xileno 143-145 2-butanona 79,6 n-pentano 36,1 n-hexano 69 Etanol 78,5 Metano -161 Decano 174 Metanol 64,5 1-butanol 116-118 1-propanol 97,2 Tolueno 110 Qual temperatura será ajustada no cromatógrafo para separar esta mistura? Será isotérmica ou será construída uma rampa de temperatura? (Trace sua rampa na Figura 11) Lembre-se que além do ponto de ebulição há a interação do analito com a fase estacionária. 37

Temperatura (ºC) Tempo (min) Figura 11 - Rampa de Temperatura para cromatógrafo gasoso 3.2. Para verificar se a rampa construida é a mais adequada e também conhecer os tempos de retenção de cada analito e o cromatograma da mistura a) Prepare 1 solução padrão de 5 ppm (mg/l) de n-hexano e uma outra solução de 5 ppm(mg/l) de 1-butanol, ambos em tolueno. Para minimizar o uso de solventes orgânicos grau HPLC empregar balões volumétricos de 10 ml. Os analitos podem ser pesados para evitar perda por evaporação; b) Injete no cromatógrafo 0,5 µl de cada solução; c) Quando ajustar o volume em 0,5 µl puxe o ar para deixar a agulha da seringa vazia) Muito cuidado ao trabalhar com a seringa cromatográfica. Anote o tempo da corrida: min 2º DIA Análise Quantitativa Quantificação dos analitos em amostra Ajustado os parâmetros anteriormente; Construir uma curva de calibração com 3 pontos para quantificar n-hexano e 1- butanol em uma amostra. (Qual será a faixa de concentração desta curva analitica? Dado: A amostra terá entre 15 a 60 ppm (mg/l) de cada analito) Obtenha o cromatograma dos pontos da curva e da amostra Construa a curva de calibração em uma planilha de cálculo (Área versus concentração); Através desta equação de reta calcule a concentração dos analitos na amostra. Bibliografia: [1] COLLINS, C. H. et al., Fundamentos de Cromatografia.Campinas, Editora Unicamp, 2006. 38

EXPERIMENTO 8: Quantificação de Limoneno por Cromatografia Gasosa com Headspace. Introdução: Os óleos essenciais, como o óleo essencial do limão, da laranja, são destinados para a indústria de sucos, refrigerantes, para fabricação de cosméticos entre outros [1]. Um dos principais componentes existentes na casca do limão e da laranja é o Limoneno, que é um hidrocarboneto natural, cíclico e insaturado, fazendo parte da família dos terpenos (Figura 12). Figura 12: Estrutura do Limoneno Amostragem por Headspace Técnicas como headspace dinâmico (purge and trap), micro extração em fase sólida (SPME) e micro extração com solvente (SME) têm sido desenvolvidas para melhorar a eficiência da extração para compostos orgânicos voláteis e semi-voláteis de amostras líquidas e sólidas. [3] Estas técnicas requerem equipamentos caros e, no caso da SPME, a fibra degrada-se com o uso contínuo e tem um tempo de vida limitado, e do mesmo modo, cabe levar em conta os tipos de fases estacionárias limitadas para as fibras. A técnica de headspace estático (Figura 13) é relativamente simples e de fácil operação, onde através do aquecimento da amostra, introduzem compostos voláteis presentes no vapor de gás (headspace) contido em um frasco selado. Esta técnica analítica é historicamente chamada de headspace estático acoplado à cromatografia gasosa". O termo "headspace" refere-se ao espaço sobre a amostra líquida ou sólida presente em um frasco lacrado. O termo "estático" significa que os voláteis no headspace do frasco estão em equilíbrio com os mesmos compostos na amostra líquida ou sólida. O instrumento extrai um volume reprodutível no headspace e injeta-o no fluxo do gás de arraste do cromatógrafo gasoso. Os compostos voláteis de alimentos, embalagens, produtos farmacêuticos, fragrâncias, produtos higiênicos, solos e água são freqüentemente analisados para avaliar se eles estão de acordo com critérios de qualidade ou normas reguladoras; ou ainda são analisados usando headspace a fim de investigar sua composição. [3] 39

Figura 13: Fases do frasco do Headspace [3]. Materiais, reagentes na bandeja: Padrão de Limoneno (96%) Acetato de Etila PA (p.e. 77 C) Pisseta com água deionizada 5 vials e selos de vials Materiais, reagentes de uso comum: Cromatógrado HP-6890 Headspace Balança Analítica Seringa cromatográfica 10µL Micropipetas, ponteiras Lacrador e deslacrador Pipeta Pasteur 1º DIA Preparo das soluções para a curva analítica Parâmetros do Cromatógrafo e do Headspace Parâmetros Headspace (carregar método): Temperatura vial: 100ºC Temperatura Loop: 115 ºC Trap Line: 130ºC GC cycle time: 10min Vial eq time: 8min Press eq time: 0,5 min Loop Fill time: 0,40 min Loop Eq. Time: 0,05min Inject ime: 1,00 min Via. Press: 16,0 psi Cromatógrado HP-6890 Coluna: carbowax (polietilenoglicol) 0,25mm x 60m, espessura do filme de 0,50um 40

Detector: Ionização em chamas (FID) Pressão = 10 psi; Injeção no modo: splitless Temperatura do injetor = 250ºC Temperatura do detector = 300 o C. Vazão do gás de arraste na coluna: 0,7 ml/min Gás de arraste: nitrogênio Temperatura do Forno (Figura 15) 110ºC, 10 o C/min - 200 o C (0,5 min) - (limpeza: 220ºC por 0,5 minuto) Figura 14 -- Exemplo de tela dos parâmetros ajustados para o forno do Cromatógrafo Procedimento 1 º Procure no Handbook de Química (Merck Index, Aldrich etc) o ponto de ebulição, a massa molecular e a densidade do limoneno 2 Preparo da solução estoque de Limoneno de 0,01 m ol/l Pese uma massa de amostra suficiente para preparar uma solução estoque de 0,01 mol/l de Limoneno a partir do padrão de Limoneno 96-97% em acetato de etila; 41

3º Descobrir tempo de retenção do analito Colocar no vial uma quantidade muito pequena (1 gota) do limoneno (vulgarmente conhecido como correr o o bafo ). Lacrar o vial, colocar no headspace e fazer a corrida cromatográfica 4º Preparo das soluções trabalho para a curva de calibração A partir da solução estoque de Limoneno prepare 3 soluções padrão de 0,0025 mol/l, 0,005mol/L e 0,0075 mol/l em acetato de etila em balões de 25mL. Guardar as soluções para injetar na 2º dia desta prática. 2º DIA Corridas cromatográficas dos pontos da Curva Analítica e Amostra Com as soluções anteriomente preparadas serão realizadas as três corridas para os pontos da curva analítica e a corrida cromatográfica para a amostra. 1º - Injeção dos pontos da curva e da amostra Adicionar 5mL da amostra no vial e lacrar. Colocar no carrossel do headspace 2º - Obtenção dos Cromatogramas Posicione os vials no carrossel seguindo a seqüência programada: Vial 1 padrão 1 Vial 2 padrão 2 Vial 3 padrão 3 Vial 4 amostra. 3º - Ache pela equação da reta da curva de calibração a concentração da amostra Construa a curva de calibração em uma planilha de cálculo e através da equação de reta calcule a concentração de limoneno na amostra. Bibliografia: [1] GRASSI H Fº, PENTEADO B B, SANTOS C H, Preparo de amostras e métodos para a determinação do teor de óleo essencial de frutos do limoeiro, Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal - SP, v. 27, n. 1, p. 191-193, Abril 2005 [2 ] COLLINS, C. H. et al., Fundamentos de Cromatografia.Campinas, Editora Unicamp, 2006. [3] MELQUIADES R A, LOBO I, GUEDES C L B, PINTO J P, Análise de benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos em solos por headspace e cromatografia gasosa/detector de ionização de chama Semina: Ciências Exatas e Tecnológicas, Londrina, v. 27, n. 2, p. 113-120, jul./dez. 2006 42

EXPERIMENTO 9: DETERMINAÇÃO DE SACARINA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC ou CLAE) Introdução: Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação de espécies químicas, por si mesma, ou em conjunto com outras técnicas instrumentais análise, como por exemplo, a espectroscopia no infravermelho ou a espectrometria de massas. A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes em duas fases, que estão em contato íntimo A representação abaixo mostra o esquema básico de um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (Figura 15). Como a coluna cromatográfica é preenchida com fase estacionária cujas partículas têm diâmetros pequenos, é necessário que o sistema todo suporte pressões elevadas. sistema de bombeamento medidor de pressão coluna cromatográfica detector válvula de amostragem reservatório de fase móvel registrador, integrador ou microcomputador Figura 15 - Representação dos principais componentes de um cromatográfo líquido. Neste experimento será realizada a análise quantitativa de sacarina empregando a cafeína como padrão interno, por CLAE em fase reversa. Na Figura abaixo é apresentada a estrutura da sacarina (Figura 16 A) e da cafeína usado como padrão interno (Figura 16B). 43

A B Figura 16 - Estruturas da sacarina (A) e da cafeína (B) [3,4] Materiais e reagentes na bandeja: Injeção e Filtro Padrão de sacarina sódica (PM: 241,20g/mol) Padrão de cafeína (PM: 194,19 g/mol) padrão interno 6 vials Materiais e reagentes de uso comum: Cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector UV Seringa cromatográfica de 100µL Micropipetas, ponteiras Balança analítica Experimental: 1º - Condições cromatográficas Fase estacionária: coluna C18 Fase móvel (isocrática): KH 2 PO 4 0,020 mol/l (ph 3,5 ajustado com H 3 PO 4 5 % v/v) + acetonitrila [90+10 v/v] Fluxo: 1,5 ml/min Volume injetado: 100µL Temperatura: ambiente Detecção: 214 nm 2º - Preparo da fase móvel (Já estará preparada) KH 2 PO 4 0,020 mol/l (ph 3,5 ajustado com H 3 PO 4 5 % v/v) + acetonitrila [90+10 v/v]. ATENÇÃO: Os solventes antes de serem misturados devem ser filtrados em filtro de membrana apropriado e desgaseificados. 44

1º DIA Preparo das soluções para a Curva Analítica 3 º - Preparo da solução estoque de sacarina e cafeína Prepare uma solução estoque de sacarina (Qual será a concentração desta solução estoque? Informação importante: a amostra estará entre 0,8 e 0,15mg/mL); Prepare uma solução estoque de cafeína (padrão interno) de 0,1 mg/ml; Dilua ambas soluções estoque em água purificada em sistema Milli-Q; Lembre-se do principio da Quimica Analitica Verde: preparar minimo do volume possivel para consumir menos fase movel e gerar menos resíduo; 4º - Soluções trabalho para a construção da curva analítica Preparar a partir da solução estoque, 3 soluções trabalho para a construção da curva analitica (Qual será a faixa de concentração desta curva analítica? Informação importante: a amostra estará entre 0,8 e 0,15mg/mL); Completar os balões das soluções trabalho com FASE MÓVEL; ATENÇÃO: adicionar a cada solução, um volume de padrão interno de cafeína, que corresponda a 0,40mg/mL. Completar com FASE MÓVEL. 6º - Colocar as amostras em frascos, etiquetar e guardar na geladeira para a próxima aula. 2º DIA Corridas cromatográficas dos pontos da Curva Analítica e Amostra 1º - Análise cromatográfica ANTES DE CADA INJEÇÃO NO CROMATÓGRAFO, FILTRAR AS SOLUÇÕES. Injetar 100µL de cada solução padrão Tempo médio da corrida cromatográfica: min 2º - Preparo da amostra Pipetar 500µL da amostra em balão volumétrico de 10mL. Lembre-se: adicionar a cada solução o padrão interno de cafeína na concentração de 0,1 mg/ml. Completar com FASE MÓVEL; 3º - Cálculo da concentração da amostra Construa a curva de calibração (com uso de padrão interno) como mostra a Figura 17. Encontre a concentração de sacarina na amostra. 45