ISSN 0100-9915 Metodologi Científic: Cultivo in vitro de Unh-de-gto 57 Rio Brnco, AC Outuro, 2011 Autores André Rposo Biólog, D.Sc. em Genétic e Melhormento de Plnts, pesquisdor d Emrp Acre, ndre@cpfc. emrp.r Rent Beltrão Teixeir Engenheir químic, M.Sc. em Engenhri de Processos, nlist d Emrp Acre, eltro@cpfc. emrp.r Fotos: André Rposo Introdução As espécies Uncri tomentos e Uncri guinensis, populrmente conhecids por unh-de-gto, são trepdeirs lenhoss pertencentes à fmíli ds Ruices, origináris d Florest Amzônic e de outrs áres tropicis ds Américs do Sul e Centrl. Seu nome é derivdo dos espinhos semelhntes gnchos que crescem o longo d trepdeir e precem s unhs do gto (Figurs 1 e 2). Conforme Pereir (2004), às dus espécies se triuem efeitos imunoestimulntes, nti-inflmtórios e iniidores de crescimento de céluls cncerígens. Os princípios tivos de mior interesse são os lcloides oxindólicos e os compostos glicosídeos do ácido quinóvico, que demonstrm ser os responsáveis pelos efeitos nti-inflmtórios (AQUINO et l., 1991). As inúmers proprieddes medicinis têm umentdo demnd por esss plnts, fvorecendo ssim o desmte e trnsporte ilegl, podendo provocr um redução de su vriilidde genétic e té mesmo su extinção. Tornse necessário, portnto, o desenvolvimento de técnics lterntivs pr propgção e possível domesticção desss espécies. Dentre els, tem-se micropropgção, que compreende vários métodos de propgção ssexud in vitro, ou sej, no lortório. Ness técnic, pequenos frgmentos de tecido vivo, denomindos explntes, são isoldos de um plnt mtriz, desinfetdos e cultivdos so condições sséptics, por períodos indefinidos em um meio de cultur proprido (ANDRADE, 2002). A utilizção desse método permite produção de muds com lt qulidde fitossnitári, durnte todo o no. Além disso, todo o processo pode ser relizdo em um pequeno espço físico, so condições controlds. Entretnto, o uso d unh-de-gto como produto comercil (fitoterápico) present lgums dificulddes, entre els flt de homogeneidde n constituição químic ds plnts comercilizds. Esse prolem ocorre pelo fto d mtéri-prim ser proveniente de áres nturis sem nenhum controle de qulidde. Nesse sentido, tecnologi de clongem in vitro, poid por um trlho de seleção de crcterístics desejáveis, poderá contriuir pr otenção de plnts com mior homogeneidde e de qulidde grntid (OBREGÓN VILCHES, 1996). Figur 1. Uncri tomentos com rmos floridos (); rmos contendo espinhos retos ().
2 Metodologi Científic: Cultivo in vitro de Unh-de-gto Figur 2. Uncri guinensis com rmos floridos (); rmos contendo espinhos curvos (). Metodologi Os meios de cultur devem ser distriuídos em tuos de ensio (20 mm x 150 mm) ou frscos de vidro trnsprente com cpcidde de 250 ml, do tipo mionese, fechdos com ppel lumínio e tmps plástics, respectivmente, e utoclvdos por 18 minutos 1,1 Kgf/cm 2, em tempertur de 121 C. Antes d utoclvgem, o ph do meio deve ser justdo em 5,8. As culturs devem ser mntids em sl de crescimento com tempertur controld de 25 C ± 2 C, dispondo de luminosidde (38 µmol.m².s -1 ) fornecid por lâmpds fluorescentes tipo luz do di, e fotoperíodo de 16 hors de luz. Etps d micropropgção: 1) Desinfestção e germinção ds sementes in vitro As sementes devem ser lvds em águ corrente e depois em águ destild. Em câmr de fluxo lminr, devem ser desinfestds com imersão em álcool etílico 70% (v/v), por 1 minuto e, em seguid, mergulhds por 30 minutos em hipoclorito de sódio 1,5% e lvds por três vezes em águ destild utoclvd. Após esse procedimento devem ser inoculds, individulmente, em tuos de ensio (20 mm x 150 mm) contendo 10 ml de meio de cultur de MS/4 (com 25% d concentrção de sis do meio de cultur de Murshige e Skoog (1962) e WPM (Wood Plnt Medium), elordo por Loyd e McCow (1980), pr U. tomentos e U. guinensis, respectivmente, suplementdos com 30 g.l -1 de scrose e 6 g.l -1 de ágr ( quntidde de ágr pode vrir de cordo com o fricnte), onde devem permnecer por 60 dis (Figur 3). Fotos: Rent Beltrão Teixeir Fotos: André Rposo Figur 3. Plântuls de Uncri guinensis em meio de cultur WPM () e Uncri tomentos em meio de cultur MS/4 (), pós 60 dis de inoculção.
Metodologi Científic: Cultivo in vitro de Unh-de-gto 3 2) Multiplicção in vitro Após 60 dis de incução, s plântuls germinds in vitro, em câmr de fluxo lminr, devem ser retirds dos tuos de ensio com o uxílio de um pinç long e colocds sore plcs de Petri contendo ppel esterilizdo. Em seguid, com uxílio de isturi, s folhs e rízes devem ser retirds e o cule secciondo, de mneir que os entrenós (segmentos nodis), com proximdmente 2 cm, permneçm com pelo menos dus gems xilres. Devem ser inoculdos de qutro cinco segmentos nodis por frsco de vidro do tipo mionese (250 ml de cpcidde) contendo 30 ml de meio de cultur MS/4 e WPM pr U. tomentos e U. guinensis, respectivmente, suplementdos com 30 g.l -1 de scrose e 6 g.l -1 de ágr. Não é necessário dicionr citocinins pr induzir formção de rotções múltipls, já que se mostrrm tóxics pr esss espécies, com um produção mssl de clos n se dos explntes (Figur 4). As culturs devem ser mntids em sl de crescimento e sucultivds cd 30 dis com renovção do meio de cultur. É possível cultiváls por té cinco sucultivos sucessivos. O número médio de rotos regenerdos por segmento nodl, em cd sucultivo, com utilizção desse protocolo, é de 1,5 roto/explnte. 3) Enrizmento Brotos entre 3,0 cm e 4,0 cm de ltur devem ser retirdos dos frscos, em câmr de fluxo lminr, com pinç long, e colocdos sore ppel tolh, em ncd. Se ocorrer presenç de rízes, devem-se retirá-ls com um corte feito n se do explnte. Folhs velhs e mrelds tmém devem ser retirds. Os rotos devem ser inoculdos qutro cinco por frsco de vidro do tipo mionese (250 ml de cpcidde) contendo 30 ml de meio de cultur MS/4 e WPM, respectivmente pr U. tomentos e U. guinensis, suplementdos com scrose (15 g.l -1 ), crvão tivdo (1,0 g.l -1 ) e gelificdo com ágr (6 g.l -1 ). As culturs devem permnecer entre 40 e 60 dis em sl de crescimento (Figur 5). Fotos: Rent Beltrão Teixeir Figur 4. Brotções dventícis de Uncri guinensis oriunds de experimento de multiplicção utilizndo citocinin 6-enzilminopurin (BAP): trtmento controle, sem dição de BAP (); trtmento com 4 mg.l -1 de BAP () e presenç de clos n se do explnte (set).
4 Metodologi Científic: Cultivo in vitro de Unh-de-gto Foto: Rent Beltrão Teixeir Fotos: Rent Beltrão Teixeir Figur 5. Enrizmento de rotções dventícis de Uncri tomentos. 4) Aclimtizção Após 50 dis, s rotções com rízes devem ser retirds do meio de enrizmento e lvds em águ destild por dus vezes pr remover o meio de cultur derido às rízes. Devem-se, então, trnsferi-ls pr recipientes plásticos esterilizdos com cpcidde de 3 litros (câmrs plástics), contendo um prte de sustrto comercil e um prte de vermiculit (Figur 6), e incuá-los em câmr incudor tipo B.O.D., com tempertur de 28 ºC, fotoperíodo de 16 hors de luz. Após 60 dis, s muds devem ser trnsferids pr tuetes, contendo sustrto comercil, e mntids em cs de vegetção, por cerc de 3 meses, sendo irrigds dus vezes o di. Pssdo esse tempo poderão ser plntds no cmpo. Figur 6. Muds de Uncri guinensis () e U. tomentos () em processo de climtizção em câmrs plástics, contendo um prte de sustrto comercil e um prte de vermiculit.
Metodologi Científic: Cultivo in vitro de Unh-de-gto 5 Referêncis ANDRADE, M. R. S. de. Princípios d cultur de tecidos vegetis. Plnltin, DF: Emrp Cerrdos, 2002. AQUINO, R.; FEO, V. de; SIMONE, F. de; PIZZA, C.; CIRINO, G. Plnt metolites: new compounds nd nti-inflmmtory ctivity of Uncri tomentos. Journl of Nturl Products, v. 54, p. 453-459, 1991. LOYD, G.; MCCOWN, B. Commercilly-fesile micropropgtion of mountin lurel, Klmi ltifoli, y use of shoot-tip culture. Interntionl Plnt Propgtion Society Proceedings, v. 30, p. 421-427, 1980. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rpid growth nd iossys with tissue cultures. Physiologi Plntrum, v. 15, p. 473-497, 1962. OBREGÓN VILCHES, L. Uñ de gto, género Uncri: estudios otánicos, químicos y frmcológicos de Uncri tomentos y Uncri guinensis. Lim: Instituto de Fitoterpi Americno, 1996. PEREIRA, R. de C. A. Micropropgção, indução de clos, crcterístics ntômics e monitormento dos iomrcdores de Uncri tomentos Willddenow Ex Roemer & Schultes DC e Uncri guinensis (AUBLET) Gmelin (Unh de Gto). 2004. 186 f. Tese (Doutordo em Fitotecni) - Universidde Federl de Lvrs, Lvrs. Circulr Técnic, 57 Ministério d Agricultur, Pecuári e Astecimento Exemplres dest edição podem ser dquiridos n: Emrp Acre Endereço: Rodovi BR 364, km 14, sentido Rio Brnco/Porto Velho, Cix Postl 321, Rio Brnco, AC, CEP 69908-970 Fone: (68) 3212-3200 Fx: (68) 3212-3284 http://www.cpfc.emrp.r sc@cpfc.emrp.r 1 edição 1 impressão (2011): 200 exemplres Comitê de pulicções Expediente Presidente: Mri de Jesus Bros Cvlcnte Secretário-Executivo: Suely Moreir de Melo Memros: André Rposo, Elis Melo de Mirnd, Ernestino de Souz Gomes Gurino, Mykel Frnklin Lim Sles, Romeu de Crvlho Andrde Neto, Tdário Kmel de Oliveir, Ttin de Cmpos, Uilson Fernndo Mtter, Virgíni de Souz Álvres Supervisão editoril: Cludi C. Sen/Suely M. Melo Revisão de texto: Cludi C. Sen/Suely M. Melo Normlizção iliográfic: Riquelm de S. de Jesus Trtmento ds ilustrções: Bruno Imroisi Editorção eletrônic: Bruno Imroisi CGPE 9639