PÁG.: 1/8 1. OBJETIVO Definir um procedimento para preparação dos meios de cultura pelo. 2. ALCANCE Este procedimento se aplica a todos os lotes de meios de cultura preparados pelo Controle Microbiológico, empregados na contagem de heterotróficas, no monitoramento dos microrganismos heterotróficos do laboratório microbiológico e demais rotinas. 3. POLÍTICA É política da autarquia cumprir com as Boas Práticas de Laboratório. 4. RESPONSABILIDADES É responsabilidade da Chefia de departamento e da Chefia de setor orientar seus funcionários para a correta execução deste procedimento. É responsabilidade dos funcionários do Controle de Qualidade Microbiológica cumprirem com o estabelecido neste procedimento. É responsabilidade de quem o elabora e de quem o revisa atualizar e manter vigente este procedimento. 5. DEFINIÇÕES Meios de cultura: material nutriente para cultivo ou desenvolvimento de microrganismos em laboratório. Microrganismos heterotróficos: microrganismos capazes de produzir unidades formadoras de colônias (UFC) na presença de compostos orgânicos contidos em meio de cultura apropriado sob condições pré-estabelecidas de incubação: 35 o C + 2 o C. 6. MATERIAL E EQUIPAMENTO - Ácido Clorídrico SR, 10%;
PÁG.: 2/8 - Água destilada ou purificada. - Autoclave; - Banho Maria; - Espátulas; - Estufa; - Hidróxido de Sódio SR, 4%; - Meios de cultura desidratados; - Placas de Petri; - Provetas de polipropileno ou de vidro graduadas; - Recipiente de vidro, popilpropileno ou inox com capacidades variadas; - Tubos para meios de cultura com tampa rosqueável ou tampa inox; 7. DIAGRAMA DE FLUXO Leia cuidadosamente as instruções do fabricante contidas no rótulo. Em uma balança calibrada, pese com precisão as quantidades de meios desidratados. Coloque-os em um recipiente limpo o qual deve ter sido previamente lavado de acordo com POP nº. CMI - 004. Acrescente aos meios pesados água destilada ou purificada. Mexa com a baqueta e aguarde até completa dissolução. Os meios contendo Agar devem ser aquecidos. Mexa a cada 5 ou 10 minutos ou até abrir fervura. Distribua os meios de cultura em recipiente adequado, não excedendo ¾ da sua capacidade. Caso de meios com Agar autoclavados em frasco para posterior plaqueamento. No caso dos meios líquidos e PCA distribua-os em tubos: 6 ml EC Medium, 11 ml Lactose ou Lauryl, 11 ml Verde e 12 ml Standard ou Plate Count Agar. Utilize os repipetadores. 1
PÁG.: 3/8 1 Submeta os meios ao processo de esterilização a vapor de acordo com o POP nº. CMI 006, pelo tempo determinado no relatório vigente de verificação da autoclave. Submeta os meios ao processo de esterilização a vapor de No caso do meio PCA em tubos, guarde-os em estante para tubos, em temperatura ambiente por 15 dias a partir da data da preparação. Para os meios EC, Lactose ou Lauryl e Verde quando em tubos com tampa de rosca a validade será de 3 meses Coloque uma etiqueta nas estantes contendo: o nome dos meios, a data de preparação, e a data de validade que será de 15 dias após a preparação para meios com tampa inox. Conserve os tubos testados por 12 horas após a autoclavação em geladeira numa temperatura de 2 a 10 C. Registre no livro de preparação de meios de cultura. 8. PROCEDIMENTO Atenção: 1) Os meios de cultura estão comercialmente disponíveis na forma desidratada. Leia cuidadosamente as instruções do fabricante contidas no rótulo. 2) O lote dos meios de cultura será formado pela abreviação do nome do meio de cultura, conforme anexo 3, mais a data da preparação.
PÁG.: 4/8 3) O meio Standard Methods Agar ou Plate Count Agar será armazenado em tubos com tampa de rosca contendo 10 a 12 ml à temperatura ambiente, com prazo de validade de 15 dias. 4) Os meios EC, lactose broth dupla concentração, lauryl sulfate broth dupla concentração, lauryl sulfate broth, lactose broth e brilliant green bile broth 2% distribuídos em tubos de ensaio com tampa de rosca terão validade de 3 meses. Quando distribuídos em tubos com tampa de inox a validade será de 15 dias. 5) O meio A1 distribuído em tubos com tampa de rosca terá validade de 7 dias. 8.1. Preparação: 8.1.1. Em uma balança calibrada, pese com precisão as quantidades dos meios desidratados. 8.1.2. Para saber qual a quantidade de meio a ser pesada, utilize a seguinte fórmula: Quant. do meio a ser pesada = Quant. do meio contida no rótulo (g) x Vol. do meio a ser preparado(ml) 1000 ml 8.1.3. Coloque os meios em um recipiente limpo, o qual deve ter sido previamente lavado de acordo com POP nº. CMI 004. 8.1.4. Acrescente aos meios (caldos) pesados água destilada ou purificada. Mexa com a baqueta e aguarde até completa dissolução. Realize a medida de ph e ajuste, se necessário. Reserve uma alíquota para medida de ph após a autoclavação. Aguarde, no mínimo, 15 minutos para a hidratação do meio contendo Agar, aqueça-o em microondas ou em outra fonte de calor (bico de Bunsen com placa cerâmica). Retire, mexa a cada 5 ou 10 minutos ou até abrir fervura. 8.1.5. Distribua os meios de cultura em recipiente adequado, não excedendo ¾ da sua capacidade, no caso de meios com Agar autoclavados em frasco para posterior plaqueamento. Distribua os meios líquidos em tubos com os tubos de Durham, sempre que necessário. Distribua 12 ml do meio para contagem de heterotróficas (Standard ou PCA) em tubos com tampa de rosca. Utilize os repipetadores identificados para cada meio. 8.1.6. Submeta os meios ao processo de esterilização a vapor de acordo com o POP nº. CMI 006, por um tempo que será determinado no relatório vigente de verificação da autoclave ou no rótulo do fabricante. 8.1.7. Guarde os tubos do meio PCA em estantes sob temperatura ambiente por 15 dias a partir da data de preparação. 8.1.8. Armazene os tubos com tampa de rosca dos meios EC, Lactose ou Lauril e Verde por 3 meses a partir da data de preparação. Quando em tubos com tampa inox a validade destes meios será de 15 dias. 8.1.9. No caso dos meios ágar, após o ciclo de esterilização, deixe repousar em banho-maria ou estufa à temperatura de ± 50 C, aguardando plaqueamento, se necessário.
PÁG.: 5/8 8.1.10. Coloque de 20 a 25 ml dos meios em cada placa estéril, sob o fluxo laminar, na zona bacteriológica, para preparação de placas de monitoramento. 8.1.11. Inverta as placas contendo os meios de cultura e embrulhe-as com plástico ou papel alumínio. 8.1.13. Coloque uma etiqueta de identificação contendo: o nome do meio, lote do meio, a data de preparação,a data de validade e o responsável. 8.1.14. Conserve as placas/tubos em temperatura ambiente (PCA) ou em geladeira em uma temperatura de 2 a 10 C. 8.1.15. No caso dos meios líquidos distribua-os em tubos e guarde-os em estante para tubos e siga os itens 8.1.13. 8.1.16. Registre no livro de registro de meios de cultura, os seguintes dados: - Nome do meio de cultura - Número do lote do fornecedor - Número do lote preparado - Data de preparação - Quantidade utilizada - Volume de água - Tempo, temperatura e pressão de esterilização - ph antes do ajuste, ph após ajuste, ph após a autoclavação - Quantidade de outros aditivos - Quantidade de água para concentração simples - Responsável 8.2. Informações adicionais sobre os meios de cultura: 8.2.1. Os meios de cultura estão comercialmente disponíveis na forma desidratada ou prontos para uso e podem ser testados quanto à sua esterilidade e capacidade na promoção do crescimento dos microrganismos para cada lote adquirido ou preparado, antes do seu uso. A seleção de cepas para a promoção de crescimento depende do meio de cultura que está em teste, as cepas serão preparadas de acordo com o POP nº CMI-002. 8.2.3. Meios de cultura seletivos podem ser utilizados em atividades específicas, tais como detecção da presença de uma espécie de microrganismo em particular. 9. ANEXOS Anexo 1- Registro de incubação.
PÁG.: 6/8 Anexo 2- Ficha de identificação geral. Anexo 3- Lista de abreviações dos meios de cultura. 10. BIBLIOGRAFIA Procedimento elaborado pelo Controle de Qualidade Microbiológica do SAAE. Nota: Os procedimentos citados correspondem à sua última atualização.
PÁG.: 7/8 Anexo 1- Registro de incubação. REGISTRO DE INCUBAÇÃO Material Método Período de Incubação 1 Temperatura 2 TAG da Estufa Data Entrada / / Hora Por Leitura: Nome Anexo 2- Ficha de identificação geral. IDENTIFICAÇÃO GERAL Material/Equipamento: Condições de Armazenamento/Validade (quando aplicável) : Por Leitura:
PÁG.: 8/8 Anexo 3- Lista de abreviações dos meios de cultura. Nome completo A1 Medium Brilliant Green Bile Broth 2% EC Medium Lactose Broth Lauryl Sulfate Broth M-Endo Agar LES M-Endo Broth Plate Count Agar Standard Methods Agar Tryptic Soy Agar Tryptic Soy Broth Abreviação A1MD BGBB ECMD LACB LSBR MEAG MEBR PCAG SMAG TRSA TRSB NOTA: Meios alternativos a esta lista podem ser usados desde que validados.