Ação de Compostos Naturais sobre Fatores de Virulência de Candida albicans isoladas da cavidade bucal INTRODUÇÃO Sílvia Oliveira de Souza 1 (UEG) Thagiane Rodrigues Campos 1 (UEG) Diorgenes Pinto Santana 2 (UEG) Evandro Leão Ribeiro 3 (UFG) Plínio Lázaro Faleiro Naves 4 (UEG) plinionaves@ueg.br A candidíase oral é a infecção fúngica endógena que mais acomete seres humanos e geralmente é uma infecção secundária a algum outra patologia local ou sistêmica. Não é uma doença letal, mas causa desconfortos de diferentes graus, altera o paladar, tornando a ingestão desagradável e dolorosa, levando a uma diminuição do apetite e emagrecimento do paciente. Pode ser a porta de entrada para outras formas de candidíase mais graves, tais como esofágica, orofaringeanas, laringeanas ou sistêmica (URIZAR, 2002). O principal patógeno implicado no seu desenvolvimento é a espécie Candida albicans, um fungo polimórfico que pode se apresentar sob a forma leveduriforme de blastósporo (comensal) ou sob a forma micelial de hifa ou pseudo-hifa (patogênica) (DINIZ et al., 2010). Alguns fatores podem predispor a ocorrência da candidíase oral, como imunocomprometimento, xerostomia, alterações hormonais, o uso de aparelhos ortodônticos, próteses totais e pacientes sob terapia antibiótica prolongada (MATOS et al., 2009). Além dessas características inerentes ao paciente, fatores de virulência dessa levedura desempenham um papel essencial na gênese e no desenvolvimento do processo infeccioso. Aderência, dimorfismo (formação de micélio), variabilidade fenotípica (switching), produção de enzimas extracelulares e toxinas constituem os principais fatores de virulência de Candida albicans, além da formação de comunidades microbianas denominadas biofilme, que contribuem para sua expressiva patogenicidade e resistência aos antifúngicos disponíveis (CHANDRA et al., 2001). O arsenal terapêutico disponível atualmente contra esta micose oral inclui agentes antifúngicos que apresentam mecanismos de ação similares. A maioria dos antifúngicos atua sobre os esteróides da membrana celular do fungo ou contra as enzimas que regulam a síntese dos ácidos nucleicos (URIZAR, 2002). Diante das limitações para o uso desses fármacos, como evidência de resistência microbiana, alto custo e ocorrências de efeitos indesejáveis, algumas substâncias de origem natural têm sido apontadas como possíveis formas de tratamento, haja vista o reconhecimento de vários destes compostos com atividade antifúngica (CASTRO; LIMA, 2010). A necessidade de novas alternativas terapêuticas tornou-se evidente, assim, investigações com derivados de plantas vêm sendo realizadas na perspectiva de se conhecer as propriedades biológicas e terapêuticas que apresentem eficácia significativa e menores efeitos colaterais. Os componentes naturais produzidos pelo metabolismo das plantas é uma fonte potencial de novos tipos de antifúngicos (CASTRO; LIMA, 2010; DINIZ et al., 2010; MATOS et al., 2009; SILVA; RANGEL, 2010). 1 Bolsista CAPES, mestrando em Ciências Moleculares, Universidade Estadual de Goiás, Brasil. 2 Bolsistas PIBIC/CNPq, graduandas do curso de Farmácia, Universidade Estadual de Goiás, Brasil 3 Professor colaborador, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Brasil. 1
4 Professor orientador, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade Estadual de Goiás, Brasil. Os constituintes químicos encontrados nos vegetais são sintetizados e degradados por inúmeras reações que constituem o metabolismo das plantas (SOUSA et al., 2004). Dentre os produtos do metabolismo secundário estão os compostos fenólicos, uma classe de compostos que inclui uma grande diversidade de estruturas, simples e complexas, que possuem pelo menos um anel aromático no qual, ao menos, um hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila. O ácido gálico é um composto fenólico derivado do ácido benzóico encontrado mais frequentemente na natureza na forma de seu dímero de condensação - o ácido elágico (SIMÕES et al., 2004). Atualmente, a medicina tem se tornado mais receptiva ao uso de substâncias microbicidas derivadas de plantas, pois muitos micro-organismos aumentaram sua taxa de resistência, principalmente aqueles oportunistas, aos antimicrobianos empregados na terapia tradicional, diminuindo a capacidade terapêutica dessas substâncias. Assim, plantas medicinais surgem como fonte de novas moléculas com grande potencial antimicrobiano (CARDOSO et al., 2010; MARTINS, 2009; SILVA; RANGEL, 2010). As pesquisas com extratos de origem vegetal para uso oral têm aumentado nos últimos anos buscando novos produtos com maior atividade farmacológica, menor toxicidade e custos mais acessíveis à população (COSTA et al., 2009). Baseado nesse contexto, torna-se de grande relevância a realização de estudos para avaliação da atividade antifúngica do ácido gálico por meio da determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) sobre cepas de Candida albicans isoladas da cavidade bucal. OBJETIVOS Avaliar a Concentração Inibitoria Mínima do ácido gálico e antifúngicos convencionais ; Obter informações sobre a ação do ácido gálico nos fatores de virulência da C. albicans. MATERIAL E MÉTODOS Os ensaios microbiológicos foram realizados no Laboratório de Microbiologia da Universidade Estadual de Goiás. Foram estudadas 36 cepas de Candida albicans isoladas da cavidade bucal de crianças portadoras da síndrome de Down, coletadas de pacientes atendidos na Unidade da Clínica de Odontologia Infantil da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás, na cidade de Goiânia- GO. Também foi incluída nas análises, a cepa padrão C. albicans ATCC 10231. O estudo da suscetibilidade in vitro aos antifúngicos anfotericina B, fluconazol, itraconazol, e 5-fluorocitosina permitiu a determinação da CMI, foi realizado utilizando a técnica de microdiluição. A anfotericina B e a 5-fluorocitosina foram obtidas da Sigma Chemical Company e mantidas a 4ºC. Os triazólicos (fluconazol e itraconazol) foram utilizados em sua preparação comercial (cápsulas com 150mg de fluconazol e cápsulas com 100mg de itraconazol). pesando 5mg de cada droga. A anfotericina B e o itraconazol foram solubilizados em DMSO, na concentração de 1% do volume da solução-estoque. O itraconazol foi mantido em banho-maria a 70 C para sua total dissolução. Para solubilização do fluconazol e a 5-fluorocitosina empregou-se água destilada. 2
Foram preparadas soluções-estoque para anfotericina B a 640µg/mL, para 5- fluorocitosina a 1000 µg/ml, para fluconazol a 1250µg/mL e para o itraconazol a 1280 µg/ml. A partir das soluções-estoque foram realizadas diluições seriadas das drogas em meio sintético RPMI 1640 tamponado a ph 7,0, com tampão MOPS para obtenção das concentrações desejadas das drogas antifúngicas. As concentrações testadas correspondem a intervalos citados na literatura como padrão de suscetibilidade de amostras de Candida. Para anfotericina B foram utilizadas as seguintes concentrações: 0,02; 0,04; 0,08; 0,125; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 e 16,0 µg/ml; para a 5- fluorocitosina: 0,012; 0,024; 0,049; 0,09; 0,19; 0,39; 0,78; 1,56; 3,12; 6,25 e 12,5 µg/ml, para o itraconazol: 0,04; 0,08; 0,16; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0 e 32,0 µg/ml e para o fluconazol: 0,08; 0,16; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0; 32,0 e 64,0 µg/ml. O inóculo de Candida foi cultivado em ágar Sabourand dextrose por 48 horas a 25 C. Esta solução foi preparada em 5mL de água deionizada esterilizada e a densidade celular ajustada em espectrofotômetro para transmitância de 85% em comprimento de onda de 530nm, resultando em uma solução aproximadamente com um inóculo entre 0,5x10 2 a 2,5x10 3 ufc/ml. Para a realização da técnica de microdiluição foram utilizadas placas de acrílico com 96 orifícios de fundo chato e com tampa. Em cada orifício, foram dispensados 100 µg/ml da concentração da droga antifúngicas e 100 µg/ml da solução de suspensão de Candida. As placas foram incubadas a 37 C por 48 horas e as placas com anfotericina B foram cobertas com papel alumínio para proteção contra luz. A concentração inibitória mínima (CMI) para drogas azólicas foi definida como sendo o primeiro poço da placa com redução de 50,0% do crescimento celular leveduriforme, comparado ao crescimento do controle positivo (meio sem droga). Para anfotericina B e 5- fluorocitosina a CMI foi definida como a mais baixa concentração capaz de inibir qualquer crescimento visual. A atividade antifúngica do ácido gálico (Sigma Chemical Company) foi preliminarmente realizada através da técnica de microdiluição adaptada de Petit et al (2005). As cepas de Candida foram cultivadas em ágar Sabourand dextrose por 48 horas a 35 C. A suspensão foi preparada dissolvendo-se 5 colônias isoladas em 5ml de solução fisiológica estéril e a densidade celular ajustada diluindo 100µL em 4,9mL de solução fisiológica estéril e posteriormente diluindo 250 µl em 4.750µL de meio sintético RPMI resultando em uma solução aproximadamente com um inóculo 5,0x10 3 ufc/ml. Pesou-se 204,8mg, considerando 100% de pureza do ácido gálico e dissolveu-se em 1mL de DMSO. Transferiu-se 0,2mL da solução inicial de ácido gálico para outro tubo com 9,8 ml de meio sintético RPMI e obteve-se a concentração de 4.096µg/mL. Para a realização da microdiluição foram utilizadas placas de poliestireno com 96 orifícios de fundo chato e com tampa. Nos poços da coluna 1 foram dispensados 100µL do meio sintético RPMI e em seguida adicionado 100 µl do ácido gálico diluído para atingir a concentração de 2.048 µg/ml. Nos demais poços a partir da coluna 1 foram dispensados 100µL do meio sintético RPMI. Em seguida iniciou-se a diluição seriada do ácido gálico retirando-se 100µL da coluna 1 para a coluna 2 e assim sucessivamente até a coluna 11 obtendo as seguintes concentrações: 1.024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4,2 e 1 µg/ml. As placas foram incubadas a 35,5ºC por 24 horas e após esse período adicionou-se 5 µl de solução de rezasurina a 0,1% em cada poço e incubou-se novamente as placas a 35,5ºC por 1 hora. O crescimento dos micro-organismos é revelado pela demonstração da redução do meio com a resazurina que passa de azul para róseo permitindo uma análise visual do resultado. 3
RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados de concentração inibitória mínima (CMI) oscilaram entre 0,08 e 1,00 µg/ml para anfotericina B, de 0,024 e 1,56 µg/ml para 5-fluorocitosina, entre 0,05 e 4,00 µg/ml e 0,08 a 1,00 µg/ml para o itraconazol. Dalazen et al (2011) avaliaram 30 amostras isoladas durante quadros de recidiva de candidíase oral de pacientes idosos com sinais clínicos definidos de candidíase eritematosa, sendo a maioria diabética. As cepas de C. albicans oriundas de candidiases orais apresentaram CMIs entre 1,56 e 100 μg/ml para anfotericina B e para o fluconazol, as CMIs foram de 25 a 100 μg/ml, sendo então o perfil de resistência obtido cerca de 97% para a anfotericina B, 93% para o fluconazol. Favalessa, Martins e Hahn (2010) caracterizaram e determinaram o perfil de suscetibilidade in vitro de leveduras do gênero Candida isoladas de pacientes infectados pelo HIV frente aos antifúngicos. Com o estudo observou-se elevados valores de concentrações inibitórias mínimas, sendo estes valores iguais a 29,6% para fluconazol, 30,8% para itraconazol, 25,9% para voriconazol, 23,4% para cetoconazol e 1,2% para a anfotericina B, sugerindo resistência dessa espécie aos azólicos e anfotericina B. A variação de concentração inibitória mínima do presente estudo mostrou-se em relação a anfotericina B e fluconazol valores menores em relação as demais investigações. Os testes de suscetibilidade in vitro (variações de CMI e IC 50 ) permitiram verificar que todas as cepas de C. albicans isoladas da boca de crianças com síndrome de Down neste estudo foram sensíveis às drogas antifúngicas testadas. Nos testes para determinação da concentração inibitória mínima do ácido gálico não obtivemos resultados satisfatório. Acreditamos que devido esse composto ser facilmente oxidável, tanto através de enzimas vegetais específicas quanto por influência de metais (como ferro e manganês), da luz e do calor, ou do meio alcalino possa ter contribuído para perda de sua possível atividade antimicrobiana (SIMÕES et al., 2004). Acreditamos ainda que a ausência do tampão MOPS no meio sintético RPMI possa também ter contribuído para a infelicidade de não obtermos um estudo conclusivo em relação à atividade antifúngica frente aos isolados de Candida albicans. O grupo de pesquisa segue trabalhando na repetição das análises. CONSIDERAÇÕES FINAIS As Candida albicans mostraram-se sensíveis a todos os antifúngicos empregados (anfotericina B, fluconazol, itraconazol e 5-fluorocitosina). Nos testes para determinação da concentração inibitória mínima do ácido gálico não foram obtidos resultados satisfatórios, devido a dificuldades operacionais, portanto as análises serão repetidas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CARDOSO, F. L. et al. Análise sazonal do potencial antimicrobiano e teores de flavonóides e quinonas de extratos foliares de Aloe arborescens Mill., Xanthorrhoeaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 20, n. 1, p. 35-40, Jan./Mar, 2010. CASTRO, R. D.; LIMA, E. O. Atividade antifúngica in vitro do óleo essencial de Eucalyptus globulus L. sobre Candida spp.rev Odontol UNESP, Araraquara, v. 39, n. 3, p. 179-184, maio/jun., 2010. 4
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