UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE MANOEL PEREIRA DA SILVA NETO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE MANOEL PEREIRA DA SILVA NETO AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO MÚSCULO GRANDE DORSAL SUBMETIDO À EXPANSÃO TECIDUAL PÓS-INFILTRAÇÃO COM TOXINA BOTULÍNICA: ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS UBERABA-MG 2014

MANOEL PEREIRA DA SILVA NETO AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO MÚSCULO GRANDE DORSAL SUBMETIDO À EXPANSÃO TECIDUAL PÓS-INFILTRAÇÃO COM TOXINA BOTULÍNICA: ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre. Área de Concentração: Patologia Básica e Experimental Orientadora: Profa. Dra. Renata Margarida Etchebehere UBERABA-MG 2014

MANOEL PEREIRA DA SILVA NETO AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO MÚSCULO GRANDE DORSAL SUBMETIDO À EXPANSÃO TECIDUAL PÓS-INFILTRAÇÃO COM TOXINA BOTULÍNICA: ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre Área de Concentração: Patologia Humana Aprovada em Uberaba (MG), 28 de Abril de 2014. Banca Examinadora Prof. Dr. Hélio Humberto Angotti Carrara Membro da Banca Profa. Dra. Renata Margarida Etchebehere Orientadora Profa. Dra. Rosekeila Simões Nomeline Membro da Banca

Dedico este trabalho ao meu pai José Pereira Gomes (in memoriam), exemplo de homem bom, honesto, responsável, dedicado e bem humorado. É uma grande referência em minha vida e espelho para minhas decisões. À minha mãe Severina Ferreira Gomes, cujas atitudes referentes a mim podem ser resumidas em poucas palavras: minha torcedora sempre fiel. À minha esposa Fabiana Helena Oliveira da Silva, pelo entendimento, compreensão, disponibilidade e ajuda contínua, ao longo da minha vida e carreira. À minha filha Manuela Oliveira Silva Pereira, minha melhor produção e razão de alegria e aprendizagem. Aos meus irmãos, cada qual com sua sensibilidade, que acreditaram na minha forma de conduzir a vida e a profissão, em especial àquele que foi minha inspiração para abraçar a Medicina e a Cirurgia Plástica, meu irmão Francisco Leopoldo Ferreira Pereira. Aos residentes, que foram verdadeiros laboratórios da minha formação desde 2002: aprendia o que ensinava a eles. Enfim, a todos os familiares e amigos que participaram do meu crescimento pessoal e profissional.

AGRADECIMENTOS A Deus, a quem sempre entreguei minha vida, carreira, pacientes, preocupações, obstáculos e vitórias. Em todos os momentos, busquei a calma Nele. Aos meus mestres, Odo Adão, José Fernando Borges Bento, Luciano Palis Horta (in memoriam), Paulo Roberto Borges Cherulli (in memoriam), Luiz Humberto Toyoso Chaem e Marco Túlio Rodrigues da Cunha, pelo caminho ético e profissional que demonstraram ao longo da minha formação. São referências na minha prática médica. Aos meus pacientes, pelo que me ensinaram. Frente à todas as possibilidades de cura, alívio, suporte e desafios, isso mantém meu amor e encanto pela arte médica. À Universidade Federal do Triângulo Mineiro, minha casa, onde consegui ter minha formação, especialização, pós-graduação e onde formo novos alunos. Meu respeito, agradecimento e eterna gratidão. À minha orientadora Renata Margarida Etchebehere, por acreditar em mim, confiar no potencial e com extremo carinho, zelo, atenção, disponibilidade e cuidado ao direcionar cada etapa deste trabalho, com isso, reacendeu meu interesse pela pesquisa científica, pela metodologia e por novas produções. Ao meu coorientador Prof. Dr. Luiz Carlos Reis, pela sugestão do tema e orientação da metodologia. Seu raciocínio rápido e genialidade foram sempre marcantes. À Srta. Márcia Maria Palhares, pela grande ajuda na estruturação gramatical e metodológica do trabalho.

Pessoas, muito mais que coisas, devem ser restauradas, revividas, resgatadas e redimidas: jamais jogue alguém fora. Audrey Hepburn

RESUMO SILVA NETO, Manoel Pereira da. Avaliação Histológica do Músculo Grande Dorsal Submetido à Expansão Tecidual Pós-infiltração com Toxina Botulínica: Estudo Experimental em Ratos. 2014. 29f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba (MG), 2014. Introdução: Os autores descrevem as alterações histológicas do músculo grande dorsal submetido à expansão após relaxamento prévio com toxina botulínica e as possíveis correlações dos achados com os benefícios encontrados na prática como, por exemplo, aumento da complacência muscular e melhor acomodação da prótese. Método: Empregaram o modelo animal, com o uso de dez ratas com peso médio de 300 g, mesma faixa etária, da cepa Wistar (Rattus norvegicus) e o músculo Grande Dorsal, por ser de fácil abordagem cirúrgica, delgado, com evidente plano de clivagem e base óssea subjacente. Biópsias musculares eram feitas antes e após as expansões, no músculo normal, no grupo controle (apenas com expansores) e no grupo com expansores e toxina botulínica. Expansores de 3 centímetros cúbicos eram posicionados abaixo do músculo e expandidos com 0,3 mililitros de soro fisiológico semanalmente, por 10 semanas. Os cortes histológicos eram corados segundo as técnicas de Hematoxilina-eosina (HE), para avaliação geral, e Tricrômio de Masson (TM) para avaliação do tecido conjuntivo. Resultados: As fibras musculares submetidas à expansão sob a ação da toxina botulínica apresentaram focos de fibrose e proliferação de vasos sanguíneos menos intensos que no grupo sem toxina botulínica e a diminuição do número de fibras musculares e a atrofia eram menores que no grupo que não utilizou a toxina. Conclusão: Os achados encontrados nos permitem presumir que a expansão muscular associada ao relaxamento com toxina botulínica preserva as características da musculatura esquelética oferecendo melhor acomodação e proteção da prótese e facilitando a dinâmica da expansão Descritores: Expansores de Tecidos. Toxinas Botulínicas. Histologia.

ABSTRACT SILVA NETO, Manoel Pereira da. Histological Evaluation of Latissimus Dorsi Muscle Subjected to Tissue Expansion After Infiltration with Botulinum Toxin: an Experimental Study in Rats. 2014. 29f. Dissertation (Master's Degree in Health Sciences) Federal University of the Triângulo Mineiro, Uberaba (MG), 2014. Introduction: The authors describe the histological alterations in skeletal muscle subjected to expansion after the relaxation with botulinum toxin and the possible correlations of the findings with the benefits found in practice, as for example, muscle increased complacency and better accommodation of the prosthesis. Method: Ten Winstar rats were used with average weight of 300g, females and in the same age range. The selected muscle for expansion was the Large Dorsal Muscle, by being easy surgical approach, slender, with evident cleavage plane and osseous base behind. Muscle Samples were collected for histological evaluation before the expansion and the end of the same. Ten expansions were made, with an interval between them of 7 days, being injected the equivalent to 10% of the total capacity of the expansion valve, i.e, 0.3 ml in each session. The histological sections were then stained according to the techniques of Hematoxylin-eosin (HE), for general evaluation, and Masson trichrome (TM) for evaluation of the connective tissue. Results: Evaluating muscle fibers subjected to expansion without the action of botulinum toxin, were observed, in both slides stained with HE as by TM, foci of fibrosis and increased connective tissue between the muscle fibers and between the muscle fascicles. In addition, there were an increase in the number of blood vessels, atrophy of skeletal muscle and consequent centralization of nuclei in cells compared to toxin group. Conclusion: The findings suggest the use of botulinum toxin in muscles that will be submitted to expansion permits greater maintenance of structural characteristics and consequently better accommodation of the prosthesis. Descriptors: Tissue Expansion Devices. Botulinum Toxins. Histology.

RESUMEN SILVA NETO, Manoel Pereira da. Evaluación Histológica del Latissimus Dorsi Sometido a Expansión Tisular Post-infiltración con Toxina Botulínica: Estudio Experimental enratas. 2014. 29f. Tesis (Maestría en Ciencias de la Salud) - Universidad Federal del Triángulo Mineiro, Uberaba (MG), 2014. Introducción: Los autores describen los cambios histológicos del Latissimus dorsi sometido a expansión tras la relajación de la toxina botulínica y las posibles correlaciones de los resultados con los beneficios en la práctica, como, por ejemplo, la mayor complacencia muscular y un mejor alojamiento de la prótesis. Método: Las personas han utilizado el modelo animal, con el uso de diez ratas con un peso promedio de 300 g, el mismo rango de edad, la cepa Wistar las ratas (Rattus norvegicus) y el músculo Gran Dorsal, por ser de fácil abordaje quirúrgico, Delgado, con una evidente y plano de clivaje base ósea. Las biopsias musculares fueron tomadas antes y después de la expansión, en normal del músculo, en el grupo de control (sólo con expansores) y en el grupo con expansores y toxina botulínica. Tres Centímetros cúbicos de expansores se encuentra por debajo del músculo y se ampliará con 0,3 ml de solución salina cada semana, durante 10 semanas. Los cortes histológicos se tiñeron con arreglo a las técnicas de hematoxilina-eosina (HE), para evaluación general y Masson masson (TM) para la evaluación del tejido conectivo. Resultados: las fibras del músculo sometido a la expansión bajo la acción de la toxina botulínica, mostró focos de fibrosis y proliferación de vasos sanguíneos menos intensa que en el grupo sin toxina botulínica y la disminución del número de fibras musculares y atrofia fueron menores que en el grupo que no utilice la toxina. Conclusión: Com los hallazgos podemos suponer que su aplicación en el músculo esquelético permitirá una mayor relajación y preservación del músculo, y por consiguiente una mayor distensibilidad y alojamiento de la prótesis. Descriptores: Dispositivos de Expansión Tisular. Toxinas Botulínicas. Histología.

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Expansor de órbita da marca SILIMED 19 Figura 2 Toxina Botulínica do tipo A (Botox, Allergan Incorporation, Irvine, CA) 20 Figura 3 Aplicação da toxina no músculo grande dorsal... 21 Figura 4 Infiltração do anestésico intraperitoneal. 21 Figura 5 Posicionamento do animal, tricotomia e marcação.. 22 Figura 6 Identificação do músculo grande dorsal e dissecção supra e submuscular 22 Figura 7 Posicionamento do expansor... 23 Figura 8 Posicionamento da válvula.. 23 Figura 9 Colocação de azul de metileno dentro do expansor 24 Figura 10 Síntese. 24 Figura 11 Aspecto pós-expansão.. 25 Figura 12 Cortes histológicos do músculo grande dorsal normal, após expansão e após expansão e aplicação de toxina botulínica 27

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS % Porcentagem µm Micrometro cm Centímetro cm 2 Centímetros quadrados g Grama Ki67 Proteína mg/kg Miligramas por quilo de peso mg/ml Miligramas por mililitros ml Mililitro ml/cm 3 Mililitros por centímetros cúbicos UI/cm 2 Unidades Internacionais por centímetro quadrado UI/ml Unidades Internacionais por mililitros ANVISA CEUA HE TM UI VGFR Agência Nacional de Vigilância Sanitária Comitê de Ética em Uso de Animais Hematoxilina-eosina Tricrômio de Masson Unidades Internacionais Vascular Endothelial Growth Factor Receptor

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 14 2 OBJETIVOS 17 3 JUSTIFICATIVA 18 4 MATERIAL E MÉTODOS 19 5 RESULTADOS 26 6 DISCUSSÃO 28 7 CONCLUSÃO 30 8 REFERÊNCIAS 31 ANEXOS ANEXO A: Parecer do Comitê de Ética em uso de Animais da Universidade Federal do Triângulo Mineiro

14 1 INTRODUÇÃO A expansão tecidual é uma técnica muito utilizada em cirurgia plástica, e, tem como característica principal utilizar as propriedades biomecânicas da pele submetida à tensão progressiva (ARGENTA; MARKS, 2006). A expansão natural de tecidos ocorre durante a fase de crescimento físico, no aumento das mamas na puberdade e na gestação, demonstrando que a pele humana se adapta rapidamente à expansão fisiológica. Diversas culturas empregam dilatações progressivas de estruturas anatômicas, como orelhas, pescoço e lábios, para fins de embelezamento (ARGENTA; MARKS, 2006; CHUN; ROHRICH, 1998; CUNHA et al. 2002; DE FILIPPO; ATALA, 2002; GEMPERLI; BRECHTBÜHL, 2002; GUYURON; HUDDLESTON, 2004; HOCHBERG et al., 2004; JANKOVIC; BRIN, 1991; LOGIUDICE; GOSAIN, 2003). Os expansores são largamente utilizados na prática médica desde a técnica de 50 e são considerados um dos maiores avanços da Cirurgia Plástica na última década (NEUMANM, 1957). A vantagem principal do expansor cutâneo consiste na possibilidade de reconstrução com tecidos regionais, portanto, com semelhança de cor e textura e sem a adição de novas cicatrizes, oferecendo resultados superiores àqueles obtidos com enxertos e retalhos à distância. O processo de expansão pode ser utilizado em lesões maiores ou em áreas com distensibilidade pequena. Esse procedimento tem permitido reparar grandes perdas teciduais de origem congênita, como nas meningomieloceles, ou adquiridas por traumas ou tumores, como por exemplo, o emprego em sequelas de queimaduras, reconstruções de mama, tratamento de alopecia e até nas expansões ósseas (CHUN; ROHRICH, 1998; DE FILIPPO; ATALA, 2002; GEMPERLI; BRECHTBÜHL, 2002). Uma das principais queixas da expansão muscular progressiva é a dor, provavelmente secundária ao espasmo muscular induzido pela hipóxia, que pode levar inclusive à interrupção do tratamento. Uma observação prática de atenuação ou ausência da dor ocorre nos casos em que há uma denervação cirúrgica eletiva ou traumática de um determinado músculo que será expandido, por exemplo, nos casos de reconstrução mamária com próteses

15 expansíveis (BURGEN; DICKENS; ZATMAN, 1949; HOCHBERG et al., 2004; LAYEEQUE et al., 2004). Existem trabalhos que demonstram, no músculo expandido para reconstrução mamária com prótese, a redução da dor após o relaxamento com toxina botulínica (LOGIUDICE; GOSAIN, 2003; LU et al., 1998; MATHES, 2006). Há aproximadamente 60 anos a toxina botulínica é empregada na medicina para diminuição ou interrupção temporária do tônus muscular. O mecanismo básico de ação dessa proteína é sua ligação aos receptores de membrana da acetilcolina e o bloqueio da liberação dessa (GIBSTEIN et al., 1997; HOCHBERG; PEREIRA; ALMEIDA, 1990; HUGHES, 1994; LOGIUDICE; GOSAIN, 2003; LAYEEQUE, et al., 2004; RADOVAN, 1982; SCOTT, 1980). Já foi descrito que, além da atividade nos neurônios, a toxina botulínica pode inibir a liberação evocada de outros neurotransmissores, aumentando ainda mais as possibilidades de sua aplicação prática no futuro (VERSACI; BALKOVICH, 1984). Estudos demonstraram que as alterações histológicas após a expansão ocorrem principalmente na epiderme e na derme. A pele apresenta aumento da atividade mitótica da epiderme, comprovada pelo aumento do marcador de proliferação celular Ki67 pela imunohistoquímica na área expandida. A derme tem sua espessura diminuída consideravelmente, associada à formação de uma cápsula fibrosa ao redor do expansor (HOCHBERG et al., 2004; HUGHES, 1994; LOGIUDICE; GOSAIN, 2003). Após a expansão há um ganho na complacência muscular contribuindo para a diminuição da tensão na sutura. As principais alterações histológicas são a hipertrofia da fibra muscular, alteração no formato da fibra e na posição nuclear, aumento e alterações nos vasos sanguíneos. Essas alterações não são encontradas na expansão muscular aguda realizada no intraoperatório por causa do tempo excessivamente curto para estimular crescimento muscular permanente (DE FILIPPO; ATALA, 2002). O mecanismo de neovascularização em tecidos expandidos ainda não foi totalmente esclarecido. Alguns autores sugerem que esse decorra do estímulo da própria tensão mecânica, induzindo angiogênese. Outros, porém questionam a íntima relação entre o aumento do fluxo sanguíneo capilar e o

16 aumento da viabilidade da pele expandida, o que não seria justificado somente pela tensão mecânica. Estudos detectaram aumento do Fator de Crescimento do Endotélio Vascular (VGFR) em tecidos expandidos, o que justifica a neovascularização (GUR et al., 1998; JANKOVIC; BRIN, 1991; LOGIUDICE; GOSAIN, 2003; PITANGUY, 1991). De Filippo e Atala (2002) revisaram a cascata de eventos envolvidos no crescimento e regeneração tecidual após a expansão. O estímulo mecânico desencadeia um sinal para transdução de fatores de crescimento, proteína quinases e estruturas do citoesqueleto, responsáveis pelo aumento da área de superfície tissular após expansão. Gur et al. (1998) após análise em microscopia eletrônica e de luz do músculo peitoral maior para reconstrução de mama, relataram degeneração muscular e desorganização estrutural, contradizendo outros estudos que, em sua maioria, indicavam uma conservação da estrutura muscular normal após expansão. O objetivo deste estudo foi descrever as alterações com ênfase na presença e intensidade de atrofia ou hipertrofia muscular, posição do núcleo, inflamação, quantidade de vasos sanguíneos e de depósitos de hemossiderina em lâminas coradas pela Hematoxilina e eosina e o Tricômico de Masson para qualificar e quantificar o tecido conjuntivo.

17 2 OBJETIVOS O objetivo deste estudo foi descrever as alterações histológicas no músculo Grande dorsal de ratas submetido à expansão tecidual com e sem aplicação de Toxina Botulínica e comparar com o músculo normal.

18 3 JUSTIFICATIVA Existem poucos estudos que avaliam as alterações histológicas no músculo esquelético submetido a expansão, prática muito comum em medicina, especialmente em cirurgia reparadora. Avaliar as alterações da expansão associada ao denervante químico e correlacioná-las com os possíveis benefícios tais como aumento da complacência muscular, melhor acomodação e proteção da prótese, poderá ser de grande aplicação na prática médica, especialmente nas reconstruções de mama.

19 4 MATERIAL E MÉTODO O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, com o protocolo nº 305 de 2014 (ANEXO A). Foram utilizadas dez ratas com peso médio de 300 g, mesma faixa etária (cerca de 6 meses) da cepa Wistar (Rattus norvegicus). Justifica-se o uso desse animal como modelo devido à facilidade de reprodução de condições semelhantes ao que acontece na expansão de tecidos no ser humano. Além disso, o animal é adequado em termos de porte (não é de grande tamanho, requerendo maior espaço e quantidade de alimento; nem é pequeno, dificultando os procedimentos técnicos), e de ciclo de vida (em pouco tempo obtém-se uma simulação de alguns meses em humanos). O músculo escolhido para expansão foi o Músculo Grande Dorsal, por ser de fácil abordagem cirúrgica, delgado, com evidente plano de clivagem e base óssea subjacente. Para a expansão muscular, utilizou-se dez expansores de órbita de seres humanos de 1,7 cm de diâmetro, com 3 ml de volume, lisos, com duas válvulas, esterilizados com óxido de etileno, registrados na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), da marca SILIMED Silicone e Instrumentos Médico-Cirúrgicos e Hospitalares LTDA (Figura 1). Figura 1 - Expansor de órbita da marca SILIMED Fonte: Acervo do autor (2014).

20 A toxina botulínica aplicada foi do tipo A (Botox, Allergan Incorporation, Irvine, CA), que é apresentada na forma liofilizada em frasco com 100UI (Figura 2). Figura 2 - Toxina Botulínica do tipo A (Botox, Allergan Incorporation, Irvine, CA) Fonte: Acervo do autor (2014). Foi feita diluição com 4 ml de solução fisiológica a 0,9%, de forma a obter 25UI/ml. A dose empregada foi de 1UI por cm 2 de músculo. Para a aplicação, utilizou-se seringas e agulhas de insulina de 1 ml/cc, sendo infiltrados dois traços de referência da seringa. Cinco animais foram submetidos à expansão do Músculo Grande Dorsal sem aplicação da toxina botulínica. Outros cinco animais foram submetidos à expansão com aplicação prévia de toxina botulínica (Figura 3).

21 Figura 3 - Aplicação da toxina botulínica no músculo Grande dorsal Fonte: Acervo do autor (2014). Amostras do músculo foram coletadas para avaliação histológica antes da expansão e ao final da mesma. Foram feitas dez expansões, com intervalo entre elas de sete dias, sendo injetado o equivalente a 10% da capacidade total do expansor, ou seja, 0,3 ml em cada sessão. Para a introdução do expansor, os animais eram anestesiados com substância sedativa, analgésica e relaxante muscular, o cloridrato de xylasina 2% na dosagem de 5mg/kg, em uma concentração de 9,1mg/ml (dose calculada por meio da fórmula : Peso x dosagem x 1/concentração ), associada a ketamina na dosagem de 50mg/kg, intraperitoneal (Figura 4). Figura 4 - Infiltração de anestésico por via intraperitoneal Fonte: Acervo do autor (2014).

22 O animal era posicionado com os membros anteriores abduzidos e a área de incisão de aproximadamente 2 cm era tricotomizada manualmente após a confirmação do estado anestésico, pela perda do reflexo da cauda pelo animal e relaxamento muscular (Figura 5). Figura 5 - Posicionamento do animal, tricotomia e marcação da pele Fonte: Acervo do autor (2014). Após a incisão e identificação do músculo grande dorsal, era realizada uma dissecção romba submuscular, buscando confeccionar uma loja na qual se colocava o expansor (Figura 6). submuscular Figura 6 - Identificação do músculo grande dorsal e dissecção supra e Fonte: Acervo do autor (2014).

23 Ainda foram coletadas amostras do músculo para avaliação histológica. A válvula conectada ao expansor era posicionada no subcutâneo, para facilitar a identificação nas futuras punções (Figura 7). Figura 7 - Posicionamento do expansor Fonte: Acervo do autor (2014). Imediatamente após o posicionamento do expansor, injetou-se 10% de sua capacidade com soro fisiológico tingido com azul de metileno, manobra utilizada na prática para acompanhamento de possíveis extravasamentos (Figura 8). Figura 8 - Posicionamento da válvula Fonte: Acervo do autor (2014).

24 Após a expansão completa coletavam-se amostras do músculo para a análise histológica (Figuras 9,10,11). Nenhum animal morreu durante a pesquisa e apenas um apresentou necrose cutânea por provável sobreposição do expansor e da válvula, complicação tecnicamente evitada com o afastamento dos mesmos. Figura 9 Injeção de azul de metileno dentro do expansor Fonte: Acervo do autor (2014). Figura 10 Síntese da pele do animal Fonte: Acervo do autor (2014).

25 Figura 11 - Aspecto do dorso do animal após a expansão Fonte: Acervo do autor (2014). As amostras do músculo colhidas eram fixadas em formol tamponado a 4%, onde permaneciam por um período mínimo de quatro horas. Posteriormente, o material era processado, incluído em parafina e submetido à microtomia para obtenção de cortes histológicos com cerca de 4µm de espessura. Os cortes histológicos eram então corados segundo as técnicas de Hematoxilina-eosina (HE), para avaliação geral, e Tricrômio de Masson (TM) para avaliação do tecido conjuntivo. As lâminas foram analisadas em microscópio de luz comum (OLYMPUS BX 41) por dois observadores simultaneamente, o orientador e o mestrando, especialmente para treinamento do aluno. Inicialmente eram avaliadas as biópsias realizadas antes da expansão, consideradas como músculo normal. Nas lâminas coradas pelo HE, nas amostras após a expansão, avaliou-se a presença de atrofia muscular, mudança na posição e no tamanho do núcleo das células musculares, presença e intensidade de inflamação, quantidade de vasos sanguíneos e presença de depósitos, particularmente de hemossiderina, comparando-se com a biópsia pré-expansão nos grupos com e sem relaxamento prévio com Toxina Botulínica. Nas lâminas coradas pelo TM, avaliou-se a quantidade de tecido conjuntivo, corado em azul, entre as fibras musculares coradas em vermelho.

26 5 RESULTADOS As fibras musculares biopsiadas antes da expansão nos animais dos grupos com e sem relaxamento com a toxina botulínica foram consideradas como músculo normal e utilizadas como referência (Figura 12 A, B e C). As principais características de uma fibra muscular normal são a disposição em fascículos dos feixes musculares com pouco tecido conjuntivo entre eles, núcleo posicionado na periferia e com presença de filetes nervosos e vasos sanguíneos esparsos no tecido conjuntivo. Não identificamos fibrose, depósitos ou processo inflamatório no músculo normal (biópsia antes da expansão). Ao avaliar as fibras musculares submetidas à expansão sem a ação da toxina botulínica, observou-se, tanto nas lâminas coradas pelo HE quanto pelo TM, fibrose evidenciada pelo aumento do tecido conjuntivo entre as fibras musculares e entre os fascículos musculares. Além disso, havia aumento do número de vasos sanguíneos, atrofia do músculo esquelético e consequente centralização dos núcleos destas células e músculo esquelético mais escasso quando comparado com o músculo normal e muito mais intenso quando comparada com o grupo com aplicação de toxina botulínica. Exibia ainda focos de hemorragia recente e antiga (depósitos de hemossiderina) e leve infiltrado inflamatório inespecífico composto por linfócitos e plasmócitos (Figura 12 D, E e F). Quanto às fibras musculares submetidas à expansão sob a ação da toxina botulínica, observaram-se focos de fibrose e proliferação de vasos sanguíneos, porém, menos intensos que no grupo sem toxina botulínica. Nesse caso, a diminuição do número de fibras musculares e a atrofia eram menores que no grupo que não utilizou a toxina. Por outro lado, não se observou hemorragia antiga ou infiltrado inflamatório neste grupo (Figura 12 G, H e I). Outro achado importante foi a ausência de cápsula de tecido conjuntivo fibroso em torno da prótese, observação comum em humanos.

27 Figura 12 - Cortes histológicos do músculo grande dorsal normal, após expansão sem aplicação de toxina botulínica e após expansão e aplicação de toxina botulínica A e B músculo esquelético antes da expansão seta indica vaso sanguíneo (HE, 400X); C escasso tecido conjuntivo (azul) entre as fibras musculares (vermelho) no músculo antes da expansão (TM, 400X); D fibrose e leve infiltrado inflamatório mononuclear (seta) no músculo expandido; E proliferação de vasos sanguíneos no múculo expandido; F hemorragia antiga - depósitos de hemossiderina em amarelo (HE, 400X); G aumento do tecido conjuntivo (azul) no músculo expandido (TM, 400X); H vasos sanguíneos ao lado de músculo esquelético após expansão e aplicação de toxina botulínica (HE, 400X); tecido conjuntivo (azul) entre as fibras musculares (vermelho) após expansão e aplicação de toxina botulínica (TM, 400X). Fonte: Acervo do autor (2014).

28 6 DISCUSSÃO Acredita-se que a fibrose observada nos animais submetidos à expansão muscular esquelética decorra provavelmente da isquemia sofrida pelo tecido pela expansão e consequente distensão dos tecidos e compressão dos vasos sanguíneos. Posteriormente, seriam liberadas citocinas que induziriam a proliferação vascular encontrada (MITCHELL; KUMAR; ABBAS, 2012). Quando se avaliou o grupo que recebeu a toxina botulínica, a fibrose e a proliferação vascular eram menos intensas. Provavelmente, o relaxamento da musculatura induzido pela toxina diminua a isquemia local, o que justifica a diferença encontrada. Por outro lado, também se encontrou menos atrofia, bem como não foi encontrada inflamação ou hemorragia nesse grupo. Acredita-se que a isquemia nesse grupo seria menor, em consequência do relaxamento muscular induzido pela toxina. Provavelmente, haveria menor liberação de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, como a expansão após o relaxamento muscular é mais fácil e haveria menos hemorragia (AL-QATTAN et al,, 2013 ). Segundo a literatura, há íntima relação entre o aumento do fluxo sanguíneo capilar e o aumento da viabilidade da pele expandida. Além disso, estudos recentes detectaram aumento do VGFR em tecidos expandidos, o que justifica a neovascularização (GUR et al., 1998; JANKOVIC; BRIN, 1991; LOGIUDICE; GOSAIN, 2003; PITANGUY, 1991). Uma das principais queixas da expansão tecidual progressiva é a dor, provavelmente secundária ao espasmo muscular induzido pela hipóxia, que pode levar inclusive à interrupção do tratamento. Uma observação prática de atenuação ou ausência da dor ocorre nos casos em que há uma denervação cirúrgica eletiva ou traumática de um determinado músculo que será expandido, por exemplo, nos casos de reconstrução mamária com próteses expansíveis (BURGEN; DICKENS; ZATMAN, 1949; LOGIUDICE; GOSAIN, 2003). Existem trabalhos que demonstram a redução da dor no músculo expandido para reconstrução mamária com prótese pós relaxamento com toxina botulínica (LOGIUDICE; GOSAIN, 2003; LU et al., 1998; MATHES, 2006).

29 Além do relaxamento muscular, acredita-se que a menor hipóxia sofrida pelas fibras musculares seja um fator associado à diminuição da dor, talvez pela diminuição de liberação de substâncias álgicas.

30 7 CONCLUSÃO A toxina botulínica é uma substância usada na prática médica há vários anos, relativamente segura e de fácil aplicação que causa relaxamento muscular, permitindo distensão muscular menos abrupta e consequentemente menos dolorosa. O presente estudo é um piloto para o desenvolvimento da tese de doutorado, em que aumentaremos o número de animais permitindo avaliação estatística, além de acrescentarmos estudo imunohistoquímico buscando classificar o infiltrado inflamatório, algumas citocinas envolvidas e marcadores vasculares. Apesar do tamanho reduzido da amostra, indicando a necessidade de estudos posteriores, esses achados (redução da fibrose, preservação das fibras musculares, ausência de hemorragia e menor inflamação), correlacionados com dados da literatura, nos permitem presumir que o uso da toxina botulínica na expansão de músculo esquelético permitirá maior relaxamento e preservação do músculo, havendo consequentemente maior distensibilidade e melhor acomodação da prótese.