AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DOS PROBIÓTICOS PRESENTES NO IOGURTE CASEIRO SOB DIFERENTES CONDIÇÕES DE PRODUÇÃO

AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DOS PROBIÓTICOS PRESENTES NO IOGURTE CASEIRO SOB DIFERENTES CONDIÇÕES DE PRODUÇÃO Felipe Miguel Farion Watanabe¹, Lorena Elianne Graef² ¹ Acadêmico do curso Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR) ² Mestra em Ciências Farmacêuticas pela Universidade Federal do Paraná, Prof.ª orientadora da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR) RESUMO O iogurte é um alimento obtido pela fermentação lática do leite por bactérias, que podem exercer ação benéfica ao homem ao proteger contra espécies patogênicas se atingir o trato intestinal com um número de bactérias viáveis satisfatório. Foi analisada a ação de variáveis durante a produção do iogurte temperatura e substrato e a viabilidade das bactérias frente condições adversas refrigeração, ph estomacal e resistência a antibiótico. A temperatura de fermentação ideal foi 45ºC, enquanto 35ºC promoveu bom crescimento das bactérias e 55ºC levou à morte celular. O teor de gordura do substrato não afetou significativamente o desenvolvimento das bactérias. As bactérias resistiram ao ph estomacal por um período de tempo suficiente para que um número viável satisfatório pudesse alcançar o duodeno. As bactérias foram resistentes aos antibióticos amoxicilina, penicilina G e tetraciclina e sensíveis aos antibióticos amoxicilina com ácido clavulânico, oxacilina, gentamicina e streptomicina. Palavras-chave: probiótico, iogurte, resistência a antibiótico ABSTRACT The yogurt is a food obtained by the lactic fermentation of milk by bacteria, which can have a benefic effect to humans by protecting against pathogenic species if it reaches the intestinal tract with a satisfactory number of viable bacteria. It was analyzed the effect of variables during the yogurt production temperature and substrate and the bacteria viability under adverse conditions refrigeration, stomach ph and antibiotic resistance. The best temperature was 45ºC, while 35ºC promoted a good bacteria growth and 55ºC caused cellular death. The fat content did not affect significantly the bacteria growth. The bacteria resisted to the stomach ph for time enough to reach the intestine in a satisfactory viable number. The bacteria were resistant to the antibiotics amoxicillin, penicillin G and tetracicllin and sensible to the antibiotics amoxicillin with clavulanic acid, oxacillin, gentamicin and streptomycin. Key words: probiotic, yogurt, antibiotic resistance 1

INTRODUÇÃO O iogurte é um alimento feito a partir da fermentação lática do leite, no qual bactérias láticas consomem a lactose presente no leite e, por não apresentarem o ciclo do ácido cítrico em seu metabolismo, produzem o ácido lático como resultado da oxidação incompleta dos carboidratos, diminuindo o ph até o valor 4,6 que é o ponto isoelétrico da caseína principal proteína do leite causando sua coagulação (AQUARONE et al., 2001; JAY, 2005). A produção mundial de leites fermentados era, em 2004, de três milhões de toneladas por ano, sendo o iogurte o leite fermentado mais popular e o mais consumido no Brasil. A preferência do consumidor brasileiro é pelo iogurte de teor médio de gordura ou desnatado e com baixa viscosidade (AQUARONE et al., 2001; MALAJOVICH, 2004). Usualmente, utilizam-se as bactérias Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus como fermentadoras do leite, tais bactérias atuam em protoco-operação, pois no início da fermentação, a baixa acidez e o aminoácido valina produzido pelo L. bulgaricus estimulam o crescimento do S. thermophilus, que por sua vez produz ácido lático e pequenas quantidades de ácido acético, que estimula o crescimento do lactobacilo em seguida (BEHMER, 1999; AQUARONE et al., 2001). A espécie L. bulgaricus vem sendo substituída pela espécie L. acidophilus, pois somente essa é capaz de sobreviver à digestão e se desenvolver no intestino humano, podendo o iogurte ser suplementado também com bactérias do gênero Bifidobacterium, apresentando ação terapêutica, pois tais bactérias colonizam e protegem a mucosa intestinal contra infecções maléficas pela acidificação do meio e pela secreção de compostos antagonistas à certas espécies patogênicas, como a acidofilina e a acidolina produzidas pelo L. acidophilus e que inibe o crescimento da bactéria Staphylococcus aureus. Além disso, relatos apontam que o consumo de iogurte contendo probióticos microrganismos vivos capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal produzindo efeitos benéficos à saúde do indivíduo, segundo Resolução RDC nº2 (7 de janeiro de 2002) possui ação benéfica sobre intolerância à lactose, colesterol sérico e agentes carcinogênicos (GILLILAND, 1989; EVANGELISTA, 2001, SAAD, 2006). Para que a bactéria probiótica possa exercer sua função terapêutica, ela deve sobreviver ao trato gástrico e chegar ao intestino, devendo possuir no mínimo 10 6 UFC/mL de iogurte para que possa chegar ao intestino em quantidade adequada de bactérias viáveis (BERRADA et al., 1991; HOU et al., 2003). O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento microbiológico das bactérias do iogurte tanto durante a produção, variando temperatura e substrato, quanto após a produção, 2

analisando sua sobrevivência frente à refrigeração, ph estomacal e presença de antibióticos a fim de verificar sua viabilidade para colonizar o trato intestinal. MATERIAIS & MÉTODOS Influência da temperatura O iogurte caseiro foi feito de acordo com as instruções do fabricante do fermento lácteo Bio Rich (Chr. Hansen, Dinamarca), sendo adicionado todo o conteúdo bacteriano composto por Bifidobacterium lactis Bb-12, Lactobacillus acidophilus La-5 e Streptococcus thermophilus em um litro de leite integral. O leite foi incubado em banho-maria a 35ºC, 45ºC e 55ºC. Foi considerado como ponto final da fermentação o ponto isoelétrico da caseína (ph 4,6). Em intervalo de 30 minutos uma alíquota foi retirada para medir o ph utilizando phmetro. A contagem de micro-organismos viáveis durante a fermentação foi realizada em intervalos de 1 hora. O iogurte foi diluído em série tendo como diluente solução de Ringer com lactato e semeado sobre uma placa contendo o meio de cultura ágar leite (Himedia, Índia), conforme orientações do fabricante do ágar. A placa foi incubada em estufa a 37ºC por 48 horas. Influência do substrato Para avaliar a influência desse parâmetro foram utilizados como substrato leite integral (3% gordura), semi-desnatado (2% gordura) e desnatado (0% gordura). A produção foi conduzida a 45º tendo como ponto final da fermentação o ph 4,6. Foi analisado o ph e a contagem de micro-organismos viáveis conforme descrito previamente. Estabilidade sob refrigeração O iogurte obtido por fermentação do leite integral recém-produzido foi armazenado sob refrigeração a 7ºC e analisado após 2, 7, 14 e 21 dias de conservação quanto ao ph e à contagem de micro-organismos viáveis conforme descrito previamente. Resistência ao ph estomacal Alíquotas de iogurte foram levadas ao ph 1,5 e 2,0 utilizando solução de HCl 1M e incubadas em banho-maria a 37ºC por 2 horas. Contagens de micro-organismos viáveis foram realizadas em intervalos de 30 minutos conforme descrito previamente [adaptação de Berrada e cols. (1991) e Hou e cols. (2003)]. Resistência a antibiótico Foi realizada a análise de resistência a antibióticos pelo método da difusão de disco (OPLUSTIL et al., 2004). O iogurte foi diluído em solução de Ringer com lactato na 3

proporção 1:9 e inoculado sobre uma placa de ágar leite. Sobre a placa foram fixados dois discos de cada um dos seguintes antibióticos: amoxicilina, amoxicilina com ácido clavulânico, penicilina G, gentamicina, streptomicina, oxacilina e tetraciclina. A placa foi incubada em estufa a 37ºC por 48 horas e foi medido o raio do halo de inibição formado. RESULTADOS E DISCUSSÃO Influência da Temperatura O ph atingiu satisfatoriamente o valor 4,6 em 180 minutos quando o leite foi incubado a 35ºC e 45ºC. Quando incubado a 55ºC, o decaimento do ph foi inferior em relação às outras temperaturas analisadas, atingindo o ph 5,23 após 240 minutos de incubação, valor de ph insatisfatório para a produção do iogurte (Graf. 1). Sob temperatura de 55ºC, houve declínio do número de bactérias viáveis, chegando a 7.10 6 UFC/mL após 240 minutos, o que representa 4% do número inicial, 1,79.10 8 UFC/mL. Ambas as temperaturas 35ºC e 45ºC promoveram crescimento microbiano, sendo que o iogurte pronto produzido a 35ºC apresentou 2,3.10 9 UFC/mL e o produzido a 45ºC apresentou o maior número de bactérias viáveis, 3,5.10 9 (Graf. 2). A Resolução nº 5 do Ministério da Agricultura (13 de novembro de 2000) estabelece para o iogurte o número mínimo de 10 7 UFC/g, portanto apenas os iogurtes produzidos a 35ºC e 45ºC estão adequados à sua norma. 7 6,5 6 ph. 5,5 5 4,5 4 0 30 60 90 120 150 180 210 240 Tempo (min) Gráfico 1: Decaimento do ph durante a produção de iogurte sob diferentes temperaturas: 35ºC ( ), 45ºC ( ) e 55ºC ( ) 4

10 9 log UFC/mL 8 7 6 0 60 120 180 240 Tempo (min) Gráfico 2: Monitoramento microbiológico durante a produção de iogurte sob diferentes temperaturas: 35ºC ( ), 45ºC ( ) e 55ºC ( ) Influência do substrato O decaimento do ph durante a produção do iogurtes utilizando os três substratos foi semelhante e satisfatório após 3 horas de fermentação (Graf. 3). A contagem microbiológica também apresentou semelhança de resultados entre os 3 iogurtes produzidos. Ao longo da produção, o comportamento das bactérias utilizadas na produção dos iogurtes semi-desnatado e desnatado foi idêntico, porém diferente do comportamento daquelas utilizadas na produção de iogurte a partir de leite integral, que apresentou uma fase lag de adaptação maior. O lote do fermento lácteo utilizado para a produção dos iogurtes semi-desnatado e desnatado foi o mesmo, porém diferente do lote utilizado na produção do iogurte integral e, por se tratar de um material biológico, o fermento está sujeito a uma leve variação entre lotes. Apesar da diferença durante a produção, o iogurte final apresentou números próximos de bactérias viáveis, possuindo o iogurte integral 3,5.10 9 UFC/mL, o semi-desnatado 3.10 9 UFC/mL e o desnatado 2,6.10 9 UFC/mL (Graf. 4). Esses dados estão de acordo com Jay (2005), segundo o qual as bactérias do iogurte são pouco proteolíticas e lipolíticas, logo sua fonte de energia é essencialmente proveniente dos carboidratos e não dos lipídios do leite. Por apresentar crescimento microbiano e redução de ph satisfatórios, o leite semi-desnatado e desnatado podem ser livremente utilizados na produção de iogurte, satisfazendo a preferência dos consumidores brasileiros que optam por tais tipos. 5

7 6,5 6 ph. 5,5 5 4,5 4 0 30 60 90 120 150 180 Tempo (min) Gráfico 3: Decaimento do ph durante a a fabricação de iogurte produzido a partir dos seguintes tipos de leite: integral ( ), semi-desnatado ( ) e desnatado ( ) 10 log UFC/mL_ 9 8 0 1 2 3 Tempo (horas) Gráfico 4: Monitoramento microbiológico durante a fabricação de iogurte produzido a partir dos seguintes tipos de leite: integral ( ), semi-desnatado ( ) e desnatado ( ). Estabilidade sobre refrigeração Após 2 dias de refrigeração, o iogurte apresentou aumento do número de bactérias viáveis, pois as bactérias presentes no iogurte estavam em fase de intensa multiplicação quando levadas à refrigeração, portanto tal crescimento deve ter ocorrido durante as primeiras horas de refrigeração, durante as quais o iogurte manteve temperatura suficiente para promover tal crescimento. No sétimo dia de refrigeração, o número de UFC/mL manteve-se estável, apresentando um leve crescimento. Entre o 7º e o 21º dia, houve uma queda do número de bactérias viáveis, porém mesmo após 21 dias de conservação a frio, o iogurte apresentou 9,1.10 9 UFC/mL, número maior do que o estabelecido pela legislação (Tab. 1). 6

Dia 0 2 7 14 21 ph 4,65 4,43 4,38 4,35 4,32 UFC/mL 2,3.10 9 2,6.10 9 2,7.10 9 1,66.10 9 1,17.10 9 Tabela 1: Monitoramento do ph e número de bactérias viáveis do iogurte refrigerado a 7ºC O metabolismo das bactérias foi reduzido pela refrigeração, visto que após 21 dias refrigerado, o iogurte apresentou queda de 0,33 no valor de ph (Tab. 1). Esse resultado é semelhante ao obtido por Beal e cols. (1999), que mantiveram o iogurte refrigerado por 21 dias e esse apresentou ph superior a 4,0. O mesmo autor relatou também que o número de S. thermophilus viáveis reduziu mais do que o número de lactobacilos devido à tolerância maior à acidez apresentada pelo lactobacilo. O experimento realizado por Grosso e Favaro-Trindade (2004) mostra que a redução do número de L. acidophilus e B. lactis viáveis presentes no iogurte ph 4,4 refrigerado por 21 dias não ultrapassou o valor 10 n-2, sendo n o expoente logarítmico inicial do iogurte antes da refrigeração, portanto a redução de 1,13.10 9 UFC/mL obtida nesse trabalho esta de acordo com o resultado obtido por outros autores. Resistência ao ph estomacal O iogurte apresentou a mesma redução do número de bactérias viáveis após 30 minutos de acidificação tanto para ph 1,5 quanto para ph 2,0. Porém, em ph 1,5 tal número sofreu grande redução no tempo zero logo após a acidificação do iogurte seguido de uma redução mais amena entre o tempo zero e 30 minutos, após esse período houve outra queda elevada até o tempo de 90 minutos, estabilizando o decréscimo entre os tempos 90 e 120 minutos. Já em ph 2,0, o iogurte apresentou uma pequena redução do número de UFC/mL no tempo zero, porém um acentuado decréscimo desse número entre o tempo zero e 30 minutos, seguido de um decaimento significativo porém mais suave entre os tempos 30 e 90 minutos e uma redução ainda menos intensa entre o tempo 90 e 120 minutos (Graf. 5). A queda brusca do número de UFC/mL apresentada por ambos os iogurtes acidificados nos primeiros 30 minutos pode ser associada às bactérias Streptococcus thermophilus, cujo crescimento tende a ficar inibido entre a faixa de ph 4,4 e 4,2 (JAY, 2005), enquanto as bactérias Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium spp. podem tolerar valor de ph 3,0 (TEJADA-SIMON et al., 1999; WANG et al., 2004). Cruzando os resultados obtidos com os resultados do esvaziamento gástrico obtidos por Berrada e colaboradores (1991) (Fig. 1), pode-se concluir que após 30 minutos da ingestão de 250mL de iogurte, quase 40% já terá passado ao duodeno e, portanto, não estará mais sujeito à acidez estomacal, o que representaria aproximadamente 100mL de iogurte, 7

contendo 4,5.10 8 UFC totais. Os mesmos autores reportaram também que a redução do número de bactérias viáveis expostas ao ph estomacal in vitro foi muito mais intensa do que apresentado in vivo devido à diluição do suco gástrico in vivo, portanto a viabilidade das bactérias pode ser maior do que a apresentada no estudo in vitro desse trabalho. O esvaziamento gástrico é afetado por diversos fatores, entre eles a composição do alimento, sendo que os lipídios são particularmente efetivos sobre a inibição do esvaziamento gástrico (GUYTON e HALL, 1997; GANONG, 2006). Portanto, a ingestão de iogurte com teor reduzido de gordura e evitar o consumo de iogurte com outros alimentos ricos em lipídios aceleram o esvaziamento gástrico e expõem por menor tempo as bactérias ao ph estomacal. log UFC/mL_ 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0-1 0 30 60 90 120 Tempo (min) Gráfico 5: Sobrevivência das bactérias do iogurte sob ph estomacal: ph 1,5 ( ) e 2,0 ( ). Figura 1: Esvaziamento gástrico após ingestão de 250mL de iogurte FONTE: Berrada e cols. (1991) Resistência a antibiótico Não houve formação de halo na presença dos antibióticos penicilina G, tetraciclina e amoxicilina. Foi observada a formação de halo de inibição para os antibióticos 8

estreptomicina, oxacilina, gentamicina e amoxicilina com ácido clavulânico, cujos tamanhos dos halos podem ser vistos na tabela 2. Raio do halo (mm) Amoxicilina Amoxicilina Gentamicina Estreptomicina Oxacilina Tetraciclina Penicilina + Ácido G Clavulânico 145-65 85 55 - - Tabela 2: Resultado do antibiograma das bactérias do iogurte sob diferentes antibióticos. O símbolo - indica que não houve formação de halo O tratamento antibiótico com amoxicilina e ácido clavulânico, gentamicina, estreptomicina ou oxacilina podem requerer uma recolonização intestinal a partir da ingestão de iogurte para repor a flora e assim evitar a exposição da mucosa intestinal às bactérias patogênicas. A amoxicilina com ácido clavulânico é uma combinação de um antibiótico β- lactâmico com um inibidor da enzima β-lactamase, já a oxacilina é um antibiótico β-lactâmico naturalmente resistente à β-lactamase, indicando que a ação de resistência das bactérias do iogurte frente à penicilina G e à amoxicilina se deve à ação da β-lactamase. Já a gentamicina e a estreptomicina são antibióticos da classe dos aminoglicosídeos, indicando que o tratamento com outros antibióticos dessa classe também apresentem inibição, como a neomicina, a amicacina e a netilmicina, por exemplo (OPLUSTIL, 2004). CONCLUSÃO A temperatura ideal para a produção do iogurte está entre 35 e 45ºC, enquanto a temperatura 55ºC leva à gradual inviabilização das bactérias. O leite, quanto ao seu teor de gordura, não interfere significativamente na produção do iogurte, podendo ser utilizado leite com teor reduzido de gordura na sua produção, atendendo assim à preferência do consumidor brasileiro. As bactérias do iogurte mantiveram-se viáveis sob refrigeração de 7ºC mesmo após 21 dias de conservação, apresentando o iogurte número de UFC/mL acima do estabelecido pela legislação brasileira e, portanto, sua vida de prateleira é superior que 21 dias. Sob ph estomacal, as bactérias mantiveram-se viáveis por tempo suficiente para que boa parte do iogurte possa atingir o intestino com concentração satisfatória de bactérias viáveis. As bactérias apresentam resistência à tetraciclina e aos antibióticos β-lactâmicos sem mecanismo de resistência à β-lactamase, porém sensibilidade aos β-lactâmicos com agente inibidor da β-lactamase e aos antibióticos da classe aminoglicosídicos, logo o tratamento 9

antibiótico com essas duas últimas classes podem requerer ingestão de iogurte para recolonizar a flora intestinal, protegendo assim contra infecções patogênicas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AQUARONE, E; BORZANI, W; SCHMIDELL, W; LIMA, U. de A. Biotecnologia industrial Vol. 4: biotecnologia na produção de alimentos. São Paulo: Edgard Blücher, 2001. BEAL, C; SKOKANOVA, J; LEATRILLE, E; MARTIN, N; CORRIEU, G. Combined effects of culture conditions and storage time on acidification and viscosity of stirred yogurt. Journal of Dairy Science, Thiverval-Grignon, v. 82, n. 4, p. 673-681, 1999. BEHMER, M. L. A. Tecnologia do leite. 13 ed. São Paulo: Nobel, 1999. BERRADA, Nabil; LEMELAND, Jean-François; LAROCHE, Gilles; THOUVENOT, Pierre; PIAIA, Martine. Bifidobacterium from fermented milks : survival during gastric transit. Journal of Diary Science, Paris, vol. 74, n. 2, 1991. BRASIL. Resolução nº 5, de 13 de novembro de 2000. Oficializar os Padrões de Identidade e Qualidade (PIQ) de Leites Fermentados. Diário Oficial da União, Brasília, 2000. Seção 1, página 9. BRASIL. Resolução RDC nº 2, de 7 de janeiro de 2002. Aprova o regulamento técnico de substâncias bioativas e probióticos isolados com alegação de propriedades funcionais e ou de saúde, e dá outras previdências. Diário Oficial da União, Brasília, 2002. EVANGELISTA, J. Tecnologia de alimentos. 2 ed. São Paulo: Editora Atheneu, 2001. GANONG, W. F. Fisiologia médica. 22 ed. Rio de Janeiro: McGraw-Hill Interamericana do Brasil, 2006. GILLILAND, S. E. Acidophilus Milk products: a review of potential benefits to consumers. Journal of Diary Science, Stillwater, v. 72, n. 10, p. 2483-2494, 1989. GROSSO, C. R. F; FÁVARO-TRINDADE, C. S. Stability of free and immobilized Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in acidified milk and of immobilized B. lactis in yoghurt. Brazilian Journal of Microbiology. São Paulo, v. 35, n. irreg; p. 151-156, 2004. 10

GUYTON, A. C; HALL, J. E. Tratado de fisiologia médica. 9 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1997. HOU, R. C. W; LIN, M. Y; WANG, M. M. C; TZEN, J. T. C. Increase of viability of entrapped cells of Lactobacillus desbrueckii ssp. bulgaricus in artificial sesame oil emulsions. Journal of Diary Science, Taichung, vol. 86, n. 2, 2003. JAY, J. M. Microbiologia de alimentos. 6 ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. MALAJOVICH, M. A. Biotecnologia. Rio de Janeiro: Axcel Books do Brasil, 2004. OPLUSTIL, C. P; ZOCCOLI, C. M ; TOBOUTI, N. R ; SINTO, S. I. Procedimentos básicos em microbiologia clínica. 2 ed. São Paulo: Sarvier, 2004. PEREZ, K. J; GUARIENTI, C; BERTOLIN, T. E; COSTA, J. A. V; COLLA, L. M. Viabilidade de bactérias láticas em iogurte adicionado de biomassa da microalga Spirulina platensis durante o armazenamento refrigerado. Alimentos e Nutrição, Araraquara, v. 18, n. 1, p. 77-82, jan/mar 2007. SAAD, S. M. I. Probióticos e prebióticos: o estado da arte. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, São Paulo, v. 42, n. 1, jan/mar 2006. TEJADA-SIMON, M. V; LEE, J. H; USTUNOL, Z; PESTKA, J. J. Ingestion of yogurt containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium to potentiate immunoglobulin A respondes to cholera toxin en mice. Journal of Dairy Science, East Lansing, v. 82, n. 4, p. 649-660, 1999. WANG, K.-Y; LI, S.-L; LIU, PERNG, D.-S; SU, Y.-C; WU, D.-C; JAN, C.-M; LAI, C.-H; WANG, T.-N; WANG, W.-M. Effects of ingesting Lactobacillus- and Bifidobacterium-containings yogurt in subjects with conolized Helicobacter pylori. The American Journal of Clinical Nutrition, Taiwan, v. 80, n. irreg; p. 737-741, 2004. 11