UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA BIOTECNOLOGIA DA REPRODUÇÃO ANIMAL Criopreservação de Embriões Vicente José de F. Freitas Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução www.uece.br/lfcr
Plano de Aula Apresentar os princípios da criopreservação de embriões. Discutir as técnicas de criopreservação. Apresentar os fatores que afetam o sucesso da técnica. Apresentar as considerações finais.
Conceito Redução ou mesmo parada de todos os fenômenos biológicos (movimentos moleculares, reações químicas e atividades enzimáticas) a temperaturas inferiores a -150 C.
Histórico Espécie Referência Murina Whittingham et al., 1972 Bovina Wilmut & Rowson, 1973 Ovina Willadsen et. al., 1976 Caprina Bilton & Moore, 1977
Vantagens Otimização das biotecnologias reprodutivas. Conservação de material genético: extinção/produção. Prevenção de perdas de animais vivos durante o transporte.
Princípio da criopreservação O protocolo empregado na criopreservação de uma célula deve ser suficientemente lento para prevenir a cristalização da água intracelular e suficientemente rápido para prevenir a exposição das células a elevadas concentrações de eletrólitos antes da congelação.
Crioprotetores Proteção celular: a) Redução da formação de cristais de gelo. b) Redução do ponto crioscópico da água. c) Aumento da estabilidade da membrana celular. Tipos: a) Permeáveis: a) propilenoglicol, glicerol, etilenoglicol, dimetilssulfóxido (DMSO). b) Não permeáveis: a) polivinilpirrolidona, polietilenoglicol, ficoll, dextran e álcool polivinílico
Tipos de Criopreservação 1. Congelação clássica (lenta): 1. Também conhecida como método de congelação clássica, tradicional ou de equilíbrio. 2. Esta técnica foi padronizada e largamente utilizada no âmbito comercial e industrial. 3. Criação de um delicado balanço entre vários fatores que determinam a formação de cristais de gelo, fraturas, danos tóxicos e osmóticos, permitindo trocas entre os meios extra e intracelular sem que ocorram sérios efeitos osmóticos e deformidades celulares.
Tipos de Criopreservação 1. Vitrificação: 1. Esta técnica pode ser considerada um método de criopreservação em que a formação de cristais de gelo é totalmente eliminada. 2. A solidificação é atingida pelo aumento extremo da viscosidade e não pela cristalização, chegando diretamente à fase vítrea. 3. Permite a passagem pela zona crítica de temperatura de maneira rápida, o que impede o desenvolvimento de injúrias ocasionadas pela formação dos cristais de gelo. 4. A concentração do crioprotetor traz efeitos tóxicos e hipertônicos, aumentando o risco de injúrias causadas pelo choque osmótico e pela toxicidade celular
Congelação Lenta 1. Princípio: 1. Equilíbrio progressivo entre os crioprotetores utilizados e o compartimento aquoso do embrião. 2. Crioprotetores: 1. Glicerol, etilenoglicol, DMSO, propanodiol. 3. Cristalização (seeding): 1. Deve ser induzida pelo operador antes que ocorra de maneira espontânea. 2. Evita a congelação de células em temperaturas excessivamente baixas.
Congelação Lenta Exemplo de curva de congelação de embriões (caprinos e ovinos)
Congelação Lenta Equipamentos programáveis para congelação de embriões
Vitrificação Estado líquido estado vítreo (amorfo) Crioprotetores com alto grau de viscosidade: Etilenoglicol e DMSO Alta velocidade na criopreservação (imersão direta no NL)
Vitrificação Open Pulled Straw (OPS): Palheta de 0,25 ml esticada (diâmetro interno pequeno )
Vitrificação Kit para vitrificação pelo método de OPS:
Fatores que influenciam no sucesso da técnica 1) Estádio de desenvolvimento embrionário: Embriões mais tardios (blastocistos) apresentam maior taxa de sobrevivência Melhor taxa de sobrevivência
Fatores que influenciam no sucesso da técnica 2) Qualidade do embrião Embriões de melhor qualidade apresentam maior taxa de sobrevivência
Fatores que influenciam no sucesso da técnica 3) Espécie animal: Zebuínos apresentam menor taxa de sobrevivência embrionária
Considerações Ambas as técnicas (congelação lenta e vitrificação) podem ser utilizadas para criopreservação de embriões. A eficiência das duas técnicas podem variar de acordo com diversos fatores que devem ser levados em consideração.