BIOLOGIA MOLECULAR Bases moleculares e fisiológicas da resistência à insulina Autores: José Barreto Campello Carvalheira Henrique Gottardello Zecchin Médicos e Pós-Graduandos do Departamento de Clínica Médica Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas Mario José Abdalla Saad* Professor Livre-Docente do Departamento de Clínica Médica Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas Introdução Após a descoberta da insulina por Banting e Best em 1922, o diabete em humanos foi considerado uma doença causada exclusivamente pela deficiência de secreção desse hormônio. Entretanto, dez anos depois, Himsworth 1 notou variações nas respostas de pacientes diabéticos à insulina e sugeriu que a insensibilidade à insulina, e não a deficiência na secreção desse FIGURA 1 ESTÁGIOS DO DESENVOLVIMENTO DO DM-2 *Endereço para correspondência: Departamento de Clínica Médica Faculdade de Ciências Médicas Universidade Estadual de Campinas Rua Tessália Vieira de Camargo, 126 13081-970 Campinas SP Tel.: (19) 3788-8950 E-mail: msaad@fcm.unicamp.br hormônio, era o mecanismo fisiopatológico em muitos diabéticos. Essa idéia foi desacreditada até o desenvolvimento do radioimunoensaio por Berson e Yalow 2, que mostraram definitivamente que pacientes com diabete iniciado na vida adulta (tipo 2) tinham altos níveis de insulina circulante. Estudos posteriores de Roth 3, Reaven 4,5, Olefsky 6, e outros sedimentaram as bases para a idéia de que a resistência à insulina é essencial para o desenvolvimento do diabete. Atualmente, acredita-se que a fisiopatologia do diabete tipo 2 envolve alterações em três sistemas orgânicos que conspiram para produzir um metabolismo anormal de glicose e lipídeos 7 : fígado, tecidos periféricos (músculo e adiposo) e célula β, apesar de existir certa incerteza em relação à lesão primária e à importância relativa dos diferentes tecidos. A resistência à insulina, que é definida como um estado de menor resposta metabólica aos níveis circulantes de insulina, é agora reconhecida como uma característica inerente do DM-2 e contribui para as anormalidades em todos os tecidos acima mencionados. Vários estudos epidemiológicos prospectivos em diversos grupos populacionais indicaram que o DM-2 progride em paralelo com a piora da ação insulínica, começando com resistência periférica à insulina e terminando com a redução na secreção de insulina (figura 1). Na maioria dos pacientes, a resistência à insulina pode ser detectada muito antes da deterioração do metabolismo glicídico. Resistência à insulina é um estado comum associado a obesidade, envelhecimento, hábito de vida sedentário, bem como a predisposição genética. O desequilíbrio da regulação do metabolismo de carboidratos e lipídeos decorrente da resistência à insulina gera um círculo vicioso com maior redução da sensibilidade à insulina. As células β pancreáticas inicialmente compensam o estado de resistência à insulina aumentando a secreção desse hormônio. Com o avançar da resistência, as células β falham em responder apropriadamente à glicose, levando ao desenvolvimento de intolerância à glicose. Anualmente, 5% a 10% dos pacientes intolerantes à glicose desenvolvem diabete com a piora da resistência à insulina. Mesmo na ausência de diabete, a resistência à insulina é uma característica marcante de outras doenças. Resistência à insulina e hiperinsulinemia estão associadas a anormalidades, tais como: hipertrigliceridemia, baixos níveis de HDL, aumento na secreção de VLDL, distúrbios de coagulação, aumento da resistência vascular, mudanças nos níveis de hormônios esteróides e aumento de peso. Desse modo, a resistência à insulina está freqüentemente associada com obesidade central, hipertensão, síndrome dos ovários policísticos, dislipidemia e Volume 5 / Número 1/ 2002 33 Sem título-12 33
aterosclerose. Essa constelação de sintomas é chamada de síndrome plurimetabólica 8. Não está claro se a resistência à insulina é a responsável direta por todos esses sintomas. Entretanto, a associação de resistência à insulina e essas alterações metabólicas é aceita universalmente. Nesta revisão, será abordada a fisiopatologia da resistência à insulina, mas antes de considerar as bases moleculares desse estado é essencial que se compreenda a ação insulínica em células normais. FIGURA 2 MECANISMO MOLECULAR DE AÇÃO DA INSULINA Transmissão intracelular do sinal insulínico A figura 2 mostra um esquema simplificado das etapas de sinalização intracelular desde a ligação da insulina ao seu receptor até a ativação do transporte de glicose. A sinalização intracelular da insulina começa com a sua ligação a um receptor específico de membrana, uma proteína heterotetramérica com atividade quinase, composta por duas subunidades α e duas subunidades β. A ligação da insulina à subunidade α estimula a autofosforilação da região intracelular da subunidade β do receptor. Uma vez ativado, o receptor de insulina fosforila vários substratos protéicos em tirosina, incluindo membros da família dos substratos dos receptores de insulina (IRS1/2/3/4), Shc, Gab-1 e Cbl. A fosforilação em tirosina das proteínas IRS cria sítios de reconhecimento para moléculas contendo domínios com homologia a Src 2 (SH2). Dentre essas, destaca-se a fosfatidilinositol 3-quinase (PI 3-quinase). As funções fisiológicas do IRS-1/2 foram recentemente estabelecidas através da produção de camundongos sem os genes que codificam o IRS-1 e IRS-2 ( knockout de IRS-1 e IRS-2). O camundongo que não expressa IRS-1 apresenta resistência à insulina e retardo de crescimento, mas não é hiperglicêmico 9. Foi demonstrado que o IRS-2 poderia compensar parcialmente a ausência de IRS-1, o que explicaria o fenótipo de resistência à insulina sem hiperglicemia do camundongo knockout de IRS-1. O camundongo que não expressa o IRS-2 foi recentemente gerado 10 e apresentou um fenótipo diferente do camundongo sem IRS-1: hiperglicemia acentuada devido a diversas anormalidades na ação da insulina nos tecidos periféricos e falência da atividade secretória das células β acompanhada de redução significativa da massa de células β pancreáticas. A fosforilação das proteínas IRSs cria sítios de ligação para a PI 3-quinase, promovendo sua ativação. Atualmente, a PI 3- quinase é a única molécula intracelular inequivocamente considerada essencial para o transporte de glicose 11. As proteínas-alvo conhecidas dessa enzima são a AKT e as isoformas atípicas da PKC (ζ e λ), porém a função das proteínas-alvos da PI 3-quinase no transporte de glicose ainda não está bem estabelecida 12 16. Permanecem obscuros os mecanismos pelos quais as etapas iniciais da sinalização insulínica convergem para as vesículas que contêm GLUT4 incitando o transporte dessas vesículas para a superfície celular. No estado basal, GLUT4 é continuamente reciclado entre a membrana celular e os vários compartimentos intracelulares. Após o estímulo com insulina, a taxa de exocitose das vesículas contendo GLUT4 aumenta intensamente, além de ocorrer uma pequena diminuição na taxa de internalização. A exocitose estimulada por insulina é similar à exocitose de vesículas sinápticas 17,18. As vesículas de GLUT4, em particular, contêm as proteínas V-SNARE, VAMP2 e VAMP3, que fisicamente interagem com seus pares t-snare (sintaxina 4 e SNAP23) na membrana celular durante a translocação das vesículas de GLUT4. Apesar dessas interações serem essenciais para a translocação do GLUT4, nenhuma dessas proteínas parece ser alvo da insulina. É tentador especular que alterações específicas dos complexos de proteína SNARE e/ou vias de sinalização que atuam paralelamente à via da PI 3-quinase também contribuem para a resistência à insulina. Mecanismos celulares de resistência à insulina A seguir, serão abordados alguns dos avanços recentes no entendimento da gênese da resistência à insulina. Inicialmente, avaliaremos o efeito da obesidade e da hipertensão na modulação da sensibilidade à insulina e em seguida a influência dos fatores genéticos na indução da resistência à insulina. Obesidade O impacto negativo do aumento da quantidade de gordura corporal sobre a sensibilidade à insulina pode ser claramente demonstrado na maioria dos indivíduos, assim como a redução da resistência à insulina observada com a perda de peso e o exercício físico 19,20. Assim, pesquisadores vêm sendo atraídos pela procura de um fator produzido pelo tecido adiposo que module a sensibilidade insulínica. Inicialmente os ácidos graxos livres (AGL) foram implicados nesse processo, mas nos últimos anos vários hormônios produzidos por adipócitos foram descritos, bem como o papel que desempenham no desenvolvimento da resistência à insulina. n O papel dos ácidos graxos livres (AGL) na resistência à insulina relacionada à obesidade. Dentre as moléculas sinalizadoras produzidas por adipócitos, os AGL têm sido implicados na patogênese da resistência à insulina. Os AGL são gerados através da lipólise, principalmente nos adipócitos. Em indivíduos obesos insulino-resistentes pode- 34 HIPERTENSÃO Sem título-12 34
se encontrar níveis elevados de AGL no plasma. A resistência à insulina relacionada à obesidade leva à redução dos efeitos antilipolíticos da insulina. Outro mecanismo através do qual a obesidade poderia contribuir para a maior produção de AGL é a hiperatividade do sistema nervoso simpático, o que já foi demonstrado tanto em pacientes obesos como em diabéticos tipo 2. Os AGL são captados pelo fígado e músculo esquelético e se contrapõem aos efeitos da insulina, inibindo a captação e oxidação de glicose. Estudos recentes 21 23 propuseram que a elevação de AGL plasmático resultaria em ativação da proteína quinase C-θ (PKCθ), uma serina-quinase, levando à fosforilação em serina do IRS- 1, o que reduz a capacidade do IRS-1 de se ligar e ativar a PI 3- quinase, resultando em transmissão reduzida do sinal de insulina em direção à translocação de GLUT4 para a membrana celular. Dessa forma, os ácidos graxos livres podem reduzir a captação de glicose celular interferindo diretamente na cascata de proteínas envolvidas na transmissão do sinal de insulina, e não através da inibição da atividade da hexoquinase (figura 3). n Adipocinas: TNF-α, leptina, adiponectina e resistina. Além de sua função de depósito de lipídeos, os adipócitos produzem e secretam hormônios, coletivamente chamados de adipocinas, que podem influenciar intensamente o metabolismo e o gasto energético. O TNF-α foi primeiro identificado como uma citocina endógena produzida por macrófagos e linfócitos após estímulo inflamatório. O TNF-α é expresso em muitos tipos de células, incluindo o tecido adiposo. Adipócitos de animais obesos e humanos hiperexpressam TNF-α em quantidades positivamente correlacionadas ao índice de massa corporal e à hiperinsulinemia, e a redução de peso diminui a expressão do TNF-α 24. Embora a liberação local de TNF-α exerça pouco efeito sobre as concentrações sistêmicas dessa citocina, as concentrações locais de TNF-α livre e ligado à membrana estão aumentadas na obesidade. Spiegelman et al. recentemente propuseram que o TNF-α é capaz de alterar a transmissão do sinal de insulina através do aumento da fosforilação em serina do IRS-1 e possivelmente de outras proteínas IRS 25. O IRS-1 fosforilado em serina inibe a atividade tirosino-quinase do receptor de insulina e é também menos fosforilado em tirosina, reduzindo assim a sinalização de insulina. Foi elaborada a hipótese de que a fosforilação do IRS-1 em serina induzida pelo TNF-α ativa um fator inibitório adicional sobre o receptor de insulina, provavelmente uma tirosina fosfatase ou um inibidor de serina-fosfatase, inibindo ainda mais a atividade tirosina quinase do receptor de insulina 26. Camundongos com ausência total do receptor de TNF-α (principalmente das isoformas p55 e p75 do receptor) apresentam melhora da sensibilidade à insulina 27. Em 1994, Friedman 28 identificou a leptina como um hormônio derivado de adipócitos e permitiu classificar o tecido adiposo como parte do sistema endócrino. A leptina reduz o peso corporal através de receptores específicos em áreas hipotalâmicas que regulam o gasto energético e a saciedade 29. FIGURA 3 EFEITO DOS AGL NAS VIAS DE TRANSMISSÃO DO SINAL DE INSULINA A deficiência na produção de leptina, bem como mutações no seu receptor em roedores, causa obesidade acentuada com hiperglicemia e resistência à insulina. Em alguns desses camundongos, a administração de leptina exógena melhora a tolerância à glicose e a sensibilidade à insulina, independentemente de seus efeitos na ingestão alimentar, provavelmente por modular vias neuroendócrinas que controlam as ações da insulina no fígado 30,31, embora a leptina possa exercer alguns de seus efeitos de forma direta nos hepatócitos 32. A adiponectina é um hormônio derivado de adipócitos. A redução da expressão dessa proteína está implicada no desenvolvimento de resistência à insulina em modelos animais de obesidade e lipoatrofia 33. A adiponectina reduz a resistência à insulina através da redução do conteúdo intracelular de triglicérides no músculo e fígado em camundongos obesos. Esse efeito é resultado do aumento da expressão de moléculas envolvidas tanto na metabolização de ácidos graxos quanto na dissipação de energia no músculo. Além disso, a resistência à insulina em camundongos lipoatróficos foi completamente revertida com a combinação de doses fisiológicas de adiponectina e leptina, mas apenas parcialmente pela adiponectina ou leptina isoladas. Esses dados indicam um possível papel terapêutico da reposição de adiponectina na resistência à insulina e diabete tipo 2. Resistina é a adipocina mais recentemente descoberta. Estudos iniciais sugeriram que a resistina poderia causar resistência à insulina, uma vez que seus níveis estavam aumentados em camundongos obesos e eram reduzidos por drogas antidiabéticas da classe das tiazolidinodionas. Além disso, a administração de anticorpo anti-resistina parecia melhorar a glicemia e a ação insulínica em camundongos obesos 34. Entretanto, estudos subsequentes não confirmaram esses achados iniciais 35. Hipertensão arterial Pacientes com hipertensão arterial apresentam intolerância a carboidratos, hiperinsulinemia e resistência à insulina em relação aos controles normotensos. Essas alterações podem persistir, independentemente do sucesso do tratamento farmacológico da hipertensão, e estão presentes em indivíduos obesos e não-obesos. Entretanto, há diferenças raciais importantes, e foi demonstrada a associação da resistência à Volume 5 / Número 1/ 2002 35 Sem título-12 35
insulina/hiperinsulinemia e hipertensão arterial (HA) em caucasóides, mas não em negróides ou índios Pima. Além dessas possíveis diferenças raciais, a presença de resistência à insulina só é observada em 50% dos indivíduos hipertensos. Atualmente, o mecanismo mais aceito para o desenvolvimento de hipertensão em pacientes com resistência à insulina é a existência de resistência à ação insulínica no endotélio vascular, podendo dificultar a ação vasodilatadora desse hormônio e/ou facilitar a vasoconstrição 36. Estudos em indivíduos com obesidade, ou com hipertensão arterial e resistência à insulina na utilização de glicose, demonstram que o aumento dos níveis de insulina nesses pacientes não é acompanhado de vasodilatação como em indivíduos normais. Além dos efeitos metabólicos da insulina, a ativação da PI 3-quinase, pelo menos em célula endotelial, estimula a produção de óxido nítrico (NO), fato que pode explicar a ação vasodilatadora da insulina. Assim, a insulina ativa seu receptor, que induz a fosforilação em tirosina dos IRSs, que, por sua vez, ligam-se à PI 3-quinase e a ativam; a PI 3-quinase, atuando através de outra enzimas vai finalmente estimular a produção de NO, que é um potente vasodilatador 37. Nesse sentido, é possível que mecanismos reguladores da PI 3-quinase no fígado, músculo e tecido adiposo venham a induzir resistência à ação insulínica na utilização de glicose. A diminuição da atividade da PI 3-quinase no endotélio pode induzir resistência à ação vasodilatadora da insulina e contribuir para a HA. Em resumo, a regulação das vias de transmissão do sinal insulínico em diferentes tecidos unifica os mecanismos moleculares que induzem resistência à insulina e HA. Corroborando esses dados, o camundongo sem IRS-1 apresenta redução da produção de NO, e, conseqüentemente, o relaxamento da aorta endotélio-dependente está reduzido nesse animal 37. Assim, na ausência de IRS-1, observa-se resistência à insulina associada a alterações hemodinâmicas encontradas na síndrome plurimetabólica. Isso reforça a hipótese de que defeitos moleculares comuns possam induzir resistência à insulina e HA. Fatores genéticos Existem fortes evidências para um papel importante de fatores genéticos no desenvolvimento de resistência à insulina 38, entretanto a identificação dos genes responsáveis pelo desenvolvimento da resistência à insulina têm sido extremamente difícil. Talvez a análise do genoma humano auxilie a revelar os fatores genéticos envolvidos nesse estado. O estudo de formas raras de diabete tem sido a forma mais efetiva para definir genes que causam resistência à insulina. Embora resistência à insulina seja o defeito mais precoce detectado na maioria dos pacientes com DM-2 38, mutações do receptor de insulina são muito raras e são usualmente observadas em pacientes com diferentes síndromes de resistência grave à insulina 39. Em torno de 0,1% 1% do DM-2 de herança materna, associado com defeitos na audição, têm mutações do DNA mitocondrial. Algumas formas de diabete lipoatrófico são causadas por mutações de laminas nucleares A/C 40, enquanto a síndrome de Wolfram (diabete, atrofia óptica e surdez) é causada por uma proteína ainda não caracterizada que possui dez segmentos transmembrana 41. Tentativas de identificar diabetogenes responsáveis pelas formas mais comuns de DM-2 dependem de estudos de linkage ou estudos de genes candidatos. A fase de pré-seqüenciamento do projeto genoma humano 42 permitiu rastreamento do genoma para identificação de regiões cromossômicas que estão ligadas com o DM-2 (cosegregação). Um locus na posição 2q37, designado NIDDM1, está ligado ao diabete e corresponde a um polimorfismo de um único nucleotídeo no gene que codifica a calpaina 10 43. Esse locus parece agir junto com outro gene no cromossomo 15 para aumentar a suscetibilidade para o DM-2 44. Outros loci envolvidos com DM-2 são o 20q12 e 1q21-24, mas os diabetogenes específicos ainda não foram determinados 45,46. Muitos genes candidatos envolvidos na ação insulínica têm sido examinados na procura de genes de suscetibilidade a resistência à insulina. Embora algumas formas variantes de muitos destes genes tenham sido identificadas, alguns desses mostraram associação com resistência à insulina ou diminuição da função da proteína estudada. Polimorfismos do IRS-1 e mutações do PPARγ apresentam redução da sensibilidade insulínica 21,22. Entretanto, para a maioria dos indivíduos, os genes envolvidos no desenvolvimento de resistência à insulina permanecem desconhecidos. Resistência à insulina e diabete tipo 2 processo inflamatório subclínico Estudos transversais têm demonstrado que marcadores inflamatórios e de disfunção endotelial podem predizer o desenvolvimento do diabete e ganho de peso em adultos 49. As associações mais significativas com marcadores inflamatórios são observadas com o índice de massa corporal. De fato, os adipócitos, especialmente nos obesos, produzem uma grande variedade de citocinas pró-inflamatórias e outros mediadores, como a leptina, TNF-α, IL-6 e PAI-1. Há mais de 100 anos, Williamson et al. mostraram que o tratamento com altas doses de salicilatos, incluindo salicilato sódico e aspirina, reduzia a intensidade da glicosúria em pacientes diabéticos e, em 1957, Reid et al. demonstraram que o tratamento com aspirina por 10 a 14 dias melhorava os resultados dos testes de tolerância à glicose oral em pacientes diabéticos 50. O mecanismo através do qual o salicilato pode afetar a homeostase de glicose permaneceu desconhecido até que Yin et al. descobriram que essa droga inibe a atividade de uma serina-quinase conhecida por IkB quinase-β (IKK-β) 51. Essa serina-quinase participa da via de transmissão do sinal de TNF-α e IL-1, importantes no desenvolvimento do processo inflamatório, que culmina com a regulação de fatores de transcrição, como o NF-κB. NF-κB corresponde a uma família de fatores de transcrição celulares envolvidos na expressão de uma grande variedade de genes que regulam a resposta inflamatória 52. NF-κB permanece seqüestrado no citoplasma por proteínas inibitórias, IkB, que são fosforiladas por um complexo de quinases conhecidas por IKK. IKK é composto de 2 quinases, IKK-α e IKK-β, as quais fosforilam IκB desencadeando a sua degradação e permitindo assim a translocação do NF-κB para o núcleo. A atividade quinase de IKK é estimulada pelo TNF-α e pela hiperexpressão de MEKK1 e NIK; por outro lado, os agentes antiinflamatórios aspirina e salicilato sódico inibem especificamente a IKK-β, evitando assim a ativação, pela NF-kB, de genes envolvidos na resposta inflamatória (figura 4). 36 HIPERTENSÃO Sem título-12 36
FIGURA 4 VIAS DE COMUNICAÇÃO DO SINAL DE TNF-α E IL-1 Para testar a hipótese de que a resistência à insulina pode envolver a ativação induzida por lipídeos de uma cascata de serinaquinases envolvendo a IKK-β, Kim et al. 53 estudaram a transmissão do sinal de insulina em ratos durante clamps euglicêmicoshiperinsulinêmicos após infusão de lipídeos, antecedida ou não de tratamento com salicilato. A infusão de lipídeos reduziu a captação de glicose estimulada por insulina e a ativação da PI 3-quinase associada ao IRS-1 no músculo esquelético, mas o pré-tratamento com salicilato evitou esses efeitos induzidos por lipídeos. Para examinar o mecanismo de ação do salicilato, o autor estudou os efeitos da infusão de lipídeos na sinalização de insulina em camundongos knockout de IKK-β. Ao contrário da resposta observada no animal controle, o camundongo que não expressa IKK-β não apresentou a alteração na sinalização de insulina observada após a infusão de lipídeos. Em resumo, altas doses de salicilatos e inativação da IKK-β evitaram a resistência à insulina induzida por lipídeos no músculo esquelético, bloqueando defeitos induzidos por lipídeos na sinalização e ação da insulina, e representam uma classe terapêutica potencial para diabete tipo 2. Em estados de resistência à insulina, alguns mediadores, como TNF-α e AGL, levam à ativação do IKK através de vias de sinalização intermediárias. Tal ativação, por sua vez, indiretamente aumenta o número de resíduos de serina e treonina fosforilados no IRS-1, transformando-o em uma proteína com ação inibitória sobre o sinal de insulina. Na presença de salicilatos, a atividade do IKK é inibida, reduzindo a fosforilação do IRS-1 em serina e treonina e permitindo que esse substrato seja mais fosforilado em tirosina, podendo se ligar e ativar a PI 3-quinase, iniciando vias de sinalização reguladoras do metabolismo 54. Recentemente Yuan et al. 55 investigaram o efeito de altas doses de salicilatos na resistência à insulina de animais obesos (camundongos ob/ob) e demonstraram uma melhora acentuada da resistência a esse hormônio, associada à redução dos níveis de AGL e triglicerídeos. Nesse mesmo estudo, o uso de outros antiinflamatórios que inibem as cicloxigenases não alterou a sensibilidade à insulina, sugerindo que o efeito independe da inibição dessas enzimas. O efeito dos salicilatos parece ser conseqüência da inibição da serina-quinase IKK-β. Tais dados sugerem que pode ocorrer um fenômeno inflamatório (provavelmente subclínico) na patogênese da resistência à insulina, na obesidade e no diabete tipo 2, e a serina-quinase IKK-β aparece como uma molécula com grande potencial terapêutico para melhora da sensibilidade à insulina. Perspectivas Houve um progresso científico considerável na compreensão dos mecanismos de ação da insulina e nas alterações moleculares que levam à resistência à insulina. No entanto, muitas lacunas permanecem. É necessário definir algumas das etapas das vias de transmissão do sinal de insulina, elucidar os mecanismos de inter-relação ( cross-talk ) com outros hormônios, determinar a suscetibilidade genética da resistência à insulina e as interações entre os genes e o ambiente. Esses estudos irão propiciar novos insights em relação a diabete e resistência à insulina, talvez permitindo uma abordagem terapêutica individualizada, incluindo a prevenção dessas doenças. Bibliografia recomendada 1. HIMSWORTH HP. Diabetes mellitus: its differentiation into insulin-sensitive and insulin insensitive types. Lancet, v. 1, p. 117 121, 1936. 2. YALOW RS, BERSON SA. Plasma insulin concentrations in nondiabetic and early diabetic subjects. Diabetes, v. 4, p. 254 260, 1960. 3. KAHN CR et al. The syndromes of insulin resistance and acanthosis nigricans. Insulin-receptor disorders in man. N Engl J Med, v. 294, p. 739 745, 1976. 4. OLEFSKY J, FARQUHAR JW, REAVEN G. 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