Índice Introdução...1 1.1. Enquadramento...2 1.2. Motivação...5 1.3. Objectivos e metodologia...6 1.4. Limitações do estudo...7 1.5. Estrutura da dissertação...8 Capítulo 1. Micotoxicologia...11 1. O que são micotoxinas...12 1.1. Perspectiva histórica... 14 1.2. Avaliação de risco das micotoxinas para a saúde... 18 1.3. Micotoxinas frequentemente detectadas... 21 1.4. Controlo de micotoxinas... 22 1.5. Gestão de risco de micotoxinas... 29 2. Produção de micotoxinas e sua presença em alimentos...30 2.1. Pré-colheita... 31 2.2. Pós-colheita... 35 2.3. Processamento dos alimentos... 35 2.4. Cadeia alimentar... 36 2.5. Presença e distribuição de micotoxinas em comodidades agrícolas... 36 2.6. Medidas de prevenção e controlo na contaminação por micotoxinas... 37 3. Fungos produtores de micotoxinas...38 3.1. Fisiologia e Ecologia... 40 3.2. Taxinomia e nomenclatura dos géneros produtores de micotoxinas... 43 4. Detecção, quantificação e identificação de fungos filamentosos em comodidades agrícolas e alimentos...55 4.1. Métodos de cultivo... 56 4.2. Métodos de não-cultivo... 58 4.3. Quantificação de fungos em alimentos... 58 5. Métodos de determinação de micotoxinas...59 5.1. Métodos de determinação da produção de micotoxinas por fungos... 59 5.2. Métodos de determinação de micotoxinas em alimentos... 60 5.3. Validação de métodos... 63 vi
Capítulo 2. Revisão bibliográfica: OTA em uvas e seus derivados...66 1. Micotoxinas em uvas e vinhos: ocratoxina A...67 1.1. OTA em uvas, vinho e outros produtos vitícolas...68 1.2. Contribuição do vinho para a exposição da população Europeia à OTA... 77 1.3. Potenciais riscos para a saúde da presença de OTA em vinho... 78 1.4. Hipóteses para a contaminação dos vinhos com OTA... 79 2. A videira: biologia, ecologia e cultivo...81 2.1. O clima Mediterrânico... 83 2.2. Ciclo vegetativo anual da videira... 85 2.3. Composição morfológica e química das uvas... 87 2.4. Os inimigos da vinha... 88 2.5. Cultivo da vinha em território nacional... 91 3. Espécies produtoras de OTA...94 3.1. Espécies produtoras de OTA nas uvas... 96 3.2. Biologia e ecologia dos Aspergillus secção Nigri... 97 3.3. Taxinomia da secção Nigri... 100 4. Determinação de OTA em uvas e vinho...109 4.1. Determinação de OTA em vinho... 110 4.2. Determinação de OTA em uvas... 118 Capítulo 3.Materiais e Métodos...121 1. Área de estudo...122 1.1. Região Demarcada dos Vinhos Verdes... 122 1.2. Região Demarcada do Douro... 125 1.3. Região Alentejo... 126 1.4. Região Ribatejo... 128 1.5. Região Dão... 129 1.6. Região Madeira... 129 1.7. Locais estudados... 130 1.8. Caracterização climática e bioclimática dos locais de estudo... 130 1.9. Regime de temperaturas... 131 1.10. Regime de precipitações... 133 1.11. Insolação... 135 1.12. Temperatura e precipitação em Setembro... 136 1.13. Caracterização bioclimática dos locais estudados... 137 1.14. Castas... 138 1.15. Vinhas amostradas... 139 vii
1.16. Caracterização climática dos anos de estudo... 139 1.17. Estados de maturação estudados... 141 1.18. Total de amostras de uvas analisadas... 141 1.19. Análise de mostos... 143 2. Plano de amostragem...144 2.1. Colheita dos cachos... 145 2.2. Transporte para o laboratório... 145 3. Enumeração de fungos filamentosos...145 3.1. Isolamento de fungos das uvas... 148 3.2. Meios de cultura usados no isolamento de estirpes... 149 3.3. Conservação das estirpes isoladas... 150 3.4. Segurança e higiene no laboratório de micologia... 152 3.5. Identificação e caracterização dos fungos...153 3.6. Manuais de identificação... 156 3.7. Preparação de Aspergillus para observação ao SEM... 156 3.8. Confirmação da identificação de Aspergillus secção Nigri... 157 3.9. Diferenciação de Penicillium... 157 3.10. Perfis de metabolitos secundários de estirpes de Penicillium... 158 3.11. Fotografias dos espécimens identificados...158 4. Avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes de Aspergillus...159 4.1. Estirpes analisadas... 159 4.2. Reagentes químicos e materiais... 159 4.3. Rastreio de produção de OTA pelas estirpes... 159 4.4. Ensaio interlaboratorial... 161 5. Construção duma base de dados para documentação da micoflora das uvas...161 5.1. Software... 162 5.2. Modelo da base de dados... 162 5.3. Estrutura da base de dados... 163 Formulários... 167 5.4. Questionários... 168 6. Determinação da OTA em uvas...170 6.1. Reagentes químicos e materiais... 170 6.2. Colheita e preparação das amostras... 171 6.3. Validação de método de extracção de OTA em uvas... 171 6.4. Experiências de adição de padrão... 172 6.5. Comparação dos métodos com uvas naturalmente contaminadas... 172 6.6. Extracção com solução bicarbonada e PEG... 173 6.7. Extracção com metanol acidificado... 174 6.8. Limpeza da amostra por imunoafinidade... 174 viii
6.9. Quantificação... 174 7. Avaliação da influência da composição química do estado de maturação e variedade de uva na produção de OTA...175 7.1. Estirpe e inóculo... 175 7.2. Amostras de uvas... 175 7.3. Determinação da composição de açúcares e ácidos orgânicos das uvas... 176 7.4. Avaliação da produção de OTA nas uvas... 176 7.5. Detecção, quantificação, e confirmação da OTA... 177 7.6. Preparação do padrão de OTA... 177 7.7. Detecção e quantificação por HPLC- FL... 178 7.8. Identificação e confirmação da OTA...179 7.9. Calibração... 179 7.10. Procedimentos de segurança... 180 8. Análise dos dados...180 8.1. Software... 181 8.2. Testes estatísticos realizados... 181 8.3. Representação gráfica de estatísticas... 182 8.4. Árvores de decisão... 183 8.5. Avaliação do desempenho dos métodos de extracção... 185 Objectivos e plano de trabalho...187 Capítulo 4.Resultados...189 1. Caracterização da micoflora das uvas...190 1.1. Micoflora normal das uvas... 190 1.2. Micoflora das uvas após plaqueamento com desinfecção superficial... 222 1.3. Podridão detectada nos bagos... 223 1.4. Fungos filamentosos detectados no mosto... 224 2. Espécies produtoras de OTA detectadas...226 2.1. Penicillium... 226 2.2. Aspergillus... 227 2.3. Relação entre estirpes produtoras de OTA e a restante micoflora na vindima... 232 2.4. Relação entre o clima e as espécies produtoras de OTA... 235 3. Aspergillus ibericus...238 3.1. Estirpes de A. ibericus analisadas... 238 3.2. Caracterização morfológica das estirpes... 239 1.1. Comparação com a morfologia de outras espécies da secção Nigri... 240 3.3. Caracterização dos esporos de A. ibericus por SEM e comparação com outras espécies da secção Nigri... 242 ix
3.4. Classificação de espécies com base no tamanho dos esporos... 248 4. Análise de OTA nas uvas...252 4.1. Validação do procedimento de extracção com adição de OTA a amostras de uvas... 253 4.2. Comparação dos procedimentos de extracção com amostras naturalmente contaminadas. 254 4.3. OTA nas uvas... 257 5. Avaliação do potencial ocratoxigénico das estirpes em meio de uva...263 5.1. Avaliação do potencial ocratoxigénico de A. carbonarius 01UAs263 em uvas de diferentes variedades e estados de maturação... 265 Capítulo 5.Discussão dos resultados...268 1. Micoflora das uvas...269 1.1. Micoflora de uvas normais... 269 1.2. Micoflora das uvas após desinfecção superficial dos bagos... 282 1.3. Podridão detectada nos bagos... 283 1.4. Micoflora do mosto... 284 2. Espécies de Aspergillus da secção Nigri produtoras de OTA...285 2.1. Estirpes OTA + e maturação das uvas... 287 2.2. Variação da incidência de estirpes OTA + com a região de origem... 288 2.3. Relação entre estirpes OTA + e a restante micoflora das uvas... 290 3. Aspergillus ibericus...291 4. Concentração de OTA nas uvas portuguesas...293 5. Avaliação do potencial ocratoxigénico das estirpes em meio de uva...294 6. Outros perigos micotoxigénicos nas uvas...295 6.1. T. roseum e seus metabolitos... 295 6.2. Alternaria e alternariol... 296 6.3. Penicillium e patulina... 296 Capítulo 6. Conclusões e trabalho futuro...298 Epílogo...304 Referências bibliográficas...308 Anexo I... 331 1. Parâmetros bioclimáticos...332 1.1. Parâmetros relacionados com o regime de temperaturas... 332 1.2. Parâmetros relacionados com o regime de precipitações (mm)... 333 2. Índices bioclimáticos...333 x
2.1. Índice de termicidade (I t )... 333 2.2. Índice de continentalidade (I c )... 333 2.3. Índice ombrotérmico anual (I o )... 334 2.4. Índices ombrotérmicos estivais compensáveis (I osc )... 334 2.5. Caracterização bioclimática territorial... 334 Anexo II... 339 xi