CITOLOGIA E FISIOLOGIA DA CÉLULA BACTERIANA

CITOLOGIA E FISIOLOGIA DA CÉLULA BACTERIANA Prof a. Dr a. Vânia Lúcia da Silva ÁRVORE FILOGENÉTICA DA VIDA Classificação dos seres vivos, de acordo com Whittaker (1969) 1

ÁRVORE FILOGENÉTICA DA VIDA Classificação dos seres vivos, de acordo com Woese (1991) Proteobactérias Espiroquetas Deinococos Bactérias hipertermófilas Flavobactérias Cianobactérias e Proclorófitas DOMÍNIO BACTERIA Cytophaga Chlamydia Planctomyces Nitrospira e Deferribacter Bactérias Gram positivas Verrucomicrobios Bactérias verdes sulfurosas Bactérias verdes não-sulfurosas 2

Halófitas Euryarchaeota Termófilas Metanogênicas DOMÍNIO ARCHAE Crenarchaeota CITOLOGIA BACTERIANA BACTÉRIAS - células procariontes, constituindo os menores seres vivos e os mais simples estruturalmente, embora complexos e diversificados do ponto de vista bioquímico e metabólico - ADAPTAÇÃO Características básicas dos procariontes: Ausência de compartimentos dentro da célula - metabólitos dispersos no citoplasma; Ausência de núcleo verdadeiro - cromossomo bacteriano disperso no citoplasma Morfologia Bacteriana: As células bacterianas são caracterizadas morfologicamente pelo seu tamanho, forma e arranjo. Tamanho: 0,3 /0,8 µm até 10/25 µm. As espécies de interesse médico variam entre 0,5 a 1,0 µm por 2 a 5 µm. Forma e arranjo: - Cocos (formas esféricas): grupo homogêneo em relação a tamanho, sendo células menores (0,8 a 1,0 µm). 3

Diplococos: cocos agrupados aos pares. Ex.: Neisseria (meningococo) Tétrades: agrupamentos de quatro cocos Sarcinas: agrupamento de oito cocos em forma cúbica. Ex.: Sarcina Estreptococos: cocos agrupados em cadeias. Ex.: Streptococcus Estafilococos: cocos em grupos irregulares, lembrando cachos de uvas. Ex.: Staphylococcus Bacilos ou bastonetes: cilíndricos, forma de bastão, podendo ser longos ou delgados, pequenos e grossos, extremidade reta, afilada, convexa ou arredondada. Diplobacilos: bastonetes agrupados aos pares. Estreptobacilos: bastonetes agrupados em cadeias. Paliçada: bastonetes agrupados lado a lado como palitos de fósforos. 4

Formas helicoidais ou espiraladas: células de forma espiral. Espirilos: possuem corpo rígido e se movem às custas de flagelos externos, dando uma ou mais voltas espirais em torno do próprio eixo. Espiroquetas: são flexíveis e locomovem-se às custas de filamentos axiais (flagelos periplasmáticos), podendo das várias voltas completas em torno do próprio eixo. Ex.: Gênero Treponema Formas de transição Bacilos muito curtos: cocobacilos. Ex.: Prevotella Espirilos muito curtos, assumindo formas de vírgula: vibriões. Ex.: Vibrio cholerae 5

CITOLOGIA BACTERIANA A observação interna das estruturas celulares dá-nos uma idéia de como a bactéria funciona no ambiente. A figura a seguir representa as diversas estruturas bacterianas: Flagelos ESTRUTURAS CELULARES EXTERNAS Estruturas especiais de locomoção, constituídas pela proteína flagelina, que formam longos filamentos que partem do corpo da bactéria e se estendem externamente à parede celular. O flagelo propulsiona a bactéria por movimento rotatório => dependente de energia fornecida pela diferença de potencial de membrana (fluxo de íons H). Distribuição dos flagelos: atríquias (sem flagelo) a) monotríquio b) anfitríquio c) lofotríquio b) peritríquio 6

Estrutura dos flagelos Filamento axial dos espiroquetas http://artureduardo.blogspot.com/2008/02/o-nanomundo-revela-as-falhas.html Fímbrias Estruturas filamentosas mais curtas e delicadas que os flagelos, semelhantes a pêlos, que se originam da membrana plasmática, e são usados para fixação, e não para motilidade. São constituídas por uma proteína denominada pilina. Estão relacionadas com a aderência às superfícies mucosas (fímbrias comuns) => colonização. Pili F => relacionado com a transferência de material genético durante a conjugação bacteriana (fímbrias ou pili sexual codificadas pelo plasmídeo F). 7

Fímbria sexual Fímbria comum Cápsula Camada que circunda a célula bacteriana externamente a parede celular, de consistência viscosa e de natureza polissacarídica (polissacarídeo extracelular) ou polipeptídica. Pode ser evidenciada por métodos especiais de coloração (tinta nanquim). Funções: proteção da célula bacteriana contra desidratação, permitir a fixação da bactéria em várias superfícies, evitar a adsorção de bacteriófagos na célula bacteriana. Relacionada à virulência da bactéria, pois confere resistência à fagocitose pelas células de defesa do corpo em uma mesma espécie, amostras encapsuladas são mais virulentas que as não-encapsuladas AUMENTA A CHANCE DE INFECÇÃO. 8

Camadas mucosas (ou mucóide) São estruturas que recobrem a parede celular mas que não têm uma organização bem definida como a cápsula, também constituídos de polissacarídeos. Têm um papel importante na adesão das bactérias a tecidos dos hospedeiros. Tal como a cápsula, a sua presença nas bactérias poderá dificultar a fagocitose e, eventualmente, a ação de anticorpos. Podem ainda ter uma função importante ao nível da prevenção da dissecação uma vez que possuem um conteúdo grande em água, tal como a cápsula. Camadas S São estruturas de natureza protéica que recobrem a parede celular Existem em bactérias Gram + e Gram -, sendo comum em archea. Têm uma estrutura complexa, mas nitidamente diferente da estrutura capsular. Podem ter como funções a proteção da célula bacteriana contra íons e flutuações de ph, stress osmótico, etc. Pode também contribuir para a virulência de algumas espécies bacterianas. 9

Parede Celular Estrutura rígida que recobre a membrana citoplasmática e dá forma às células, além de proteção, mantendo a pressão osmótica intrabacteriana e prevenindo expansão e eventual rompimento da célula. Composição: peptidioglicano (mucopeptídeo ou mureína) estrutura rígida da parede: N-acetilglicosamina (NAG) ácido N-acetilmurâmico (NAM) tetrapeptídeo (4 aminoácidos) Devido as propriedades da parede celular, as bactérias podem ser divididas em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS e GRAM NEGATIVAS, de acordo com a sua resposta à coloração de GRAM. Composição do tetrapeptídeo Contém L e D aminoácidos, sempre ligado ao NAM. Ligações cruzadas entre o COOH terminal do aminoácido de um tetrapeptídeo e o grupo NH 2 do aminoácido do tetrapeptídeo vizinho. L-alanina D-ácido glutâmico L-lisina D-alanina L-alanina D-ácido glutâmico L-lisina D-alanina Ligação cruzada 10

PAREDE DAS GRAM POSITIVAS Possuem maior quantidade de peptidioglicano, o que torna a parede dessas bactérias mais espessa e rígida. Composta por peptidioglicano e ácidos teicóicos (cadeias de polifosfato com resíduos de ribitol e glicerol) ou ácidos lipoteicócicos. Ácidos teicóicos Peptideoglicano Membrana citoplasmática Citoplasma Os ácidos teicóicos/lipoteicóicos estão ligados ao peptidioglicano APENAS nas bactérias Gram positivas, nunca nas Gram negativas. PAREDE DAS GRAM NEGATIVAS Mais complexa - a quantidade de peptidioglicano é menor, e possui uma membrana externa envolvendo a fina camada de peptidioglicano, que se situa no espaço periplasmático. MEMBRANA EXTERNA: Serve como barreira seletiva que controla a passagem de algumas substâncias. Estrutura: bicamada assimétrica, contendo fosfolipídios, semelhante à MP. Internamente => camada de fosfolipídeos e lipoproteína, que está ancorada ao peptidioglicano. Externamente => camada impermeável de lipopolissacarídeo (LPS) molécula anfipática. 11

LPS 3 segmentos ligados covalentemente: lipídio A, cerne do polissacarídeo e antígenos O. A porção lipídica do LPS é também chamada de ENDOTOXINA. O LPS pode ser tóxico, causando febre, diarréia, destruição de hemácias e um choque potencialmente fatal. Efeito protetor nas bactérias Gram negativas intestinais (resistência à solubilização pelas enzimas intestinais e bile). LOS Bactérias Gram negativas do trato respiratório e genital possuem uma membrana externa relativamente hidrofóbica e susceptível a solubilização pela bile. Essas bactérias têm como característica a presença de um análogo do LPS que não possui o antígeno O, sendo por isso chamado de LIPOOLIGOSACARÍDEO => LOS Esse glicolipídeo é expresso predominantemente pelas bactérias presentes nas mucosas, tais como espécies de Neisseria. Carboidratos do core: glicose, galactose, N- acetilglicosamina e carboidratos incomuns 12

A membrana externa das bactérias Gram negativas contém proteínas (OMP), que formam canais por onde penetram diversas substâncias. Lipopolissacarideo Membrana externa Espaço periplasmático lipoproteínas e Peptideoglicano Espaço periplasmático Membrana citoplasmática Citoplasma Essas proteínas presentes na membrana externa das Gram negativas constituem aprox. 50% da membrana, não relacionadas com as proteínas da MP, e possuem diversas funções. Implicação da estrutura da parede celular bacteriana - COLORAÇÃO DE GRAM Baseado nas propriedades da parede celular (substâncias lipídicas na camada externa) 1884 Hans Christian Joachim Gram Experimentos com pneumococos corantes seletivos para bactérias Desenvolvimento de um protocolo de coloração de esfregaços bacterianos Permitiu a divisão destes organismos em 2 grandes grupos - visualização por microscopia óptica Revolução no diagnóstico das doenças infecciosas. 13

PAREDE CELULAR DAS MICOBACTÉRIAS Bacilos aeróbios, imóveis, não-formadores de esporos, de parede celular complexa rica em lipídios e ceras, especialmente ácidos micólicos que são ligados covalentemente a lipidios (ácidos arabnogalactâmicos). Causadores da tuberculose e da lepra. Estrutura da parece celular: A parede celular das micobactérias é responsável por muitas características das bactérias (por exemplo, ácido resistência, crescimento lento, resistência aos detergentes, resistência aos antibióticos e antissépticos comuns). Nutrientes solúveis em água entram nas células através de porinas. Os diferentes lipídios da parede celular das micobactérias formam uma bicamada assimétrica que atuam como barreira a substâncias aquosas tornando a superfície celular hidrofóbica e resistente a numerosos desinfetantes, álcoois e ácidos. Porina Arabnogalactose LPS Lipídios acil (ceras) Gram + Peptídeoglicano Bi-camada lipídica Ácido Micólico Glicolipídio (lipoarabnomanana) Gram - Micobacterias 14

PAREDE CELULAR DAS ARCHEOBACTERIAS Semelhante a outros procariotos, as arqueobactérias possuem uma parede para manter a integridade celular. O peptidioglicano nas arqueas é denominado pseudopeptidioglicano, e a diferença está no tipo de ligação entre o NAM e o NAG. Nenhum D-aminoácido é encontrado, somente L-aminoácidos. Em algumas arqueas, a parede pode ser composta por glicoproteínas com grande proporção de aminoácidos como aspartato e o glutamato => CAMADA S Membrana Citoplasmática Aproximadamente 10 nm e separa a parede celular do citoplasma. É constituída de fosfolipídeos e proteínas. Desempenha importante papel na permeabilidade seletiva da célula funciona como barreira osmótica. Difere da membrana citoplasmática dos eucariotos por: - não apresentar esteróis em sua composição; - ser sede de numerosas enzimas do metabolismo respiratório; 15

ESTRUTURAS CELULARES INTERNAS Área citoplasmática Citoplasma: 80 % de água, ácidos nucléicos, proteínas, carboidratos, compostos de baixo peso molecular, lipídios, íons inorgânicos. Sítio de reações químicas. Ribossomos: ligados a uma molécula de mrna, são chamados de poliribossomos. Presentes em grande número nas células bacterianas. São menores ribossomos 70S Grânulos de reserva (inclusões): os procariotos podem acumular no citoplasma substâncias sob a forma de grânulos, constituídos de polímeros insolúveis (ex.: grânulos de glicogênio, amido, lipídios, polifosfato, enxofre e óxido de ferro). Microscopia de luz polarizada, revelando os grânulos de enxôfre no interior da bactéria Thiomargarita namibiensis 16

Área citoplasmática Ribossomos: ligados a uma molécula de mrna, são chamados de poliribossomos. Presentes em grande número nas células bacterianas. São menores ribossomos 70S Tipo de rrna em procariotos Número aproximado de nucleotídeos Localização da subunidade 16s 1542 30s 5s 120 50s 23s 2904 50s Área nuclear Nucleóide: cromossomo bacteriano, constituído por uma única molécula dupla fita circular de DNA não delimitado por membrana nuclear e sem a presença de histonas. Contém as informações necessárias à sobrevivência da célula e é capaz de replicação. Plasmídeos: elementos extracromossomais, moléculas menores de DNA, também dupla fita, circulares, cujos genes não codificam características essenciais, mas podem conferir vantagens seletivas para as bactérias que os possuem (ex.: genes de resistência a antibióticos, metais tóxicos, produção de toxinas, etc). São capazes de auto-duplicação independente do cromossomo bacteriano, e podem existir várias cópias dentro da célula. 17

Esporos Também chamados de endósporos (porque se formam dentro da célula). Esporos contém pouca água no citoplasma, possuem parede celular muito espessa, são altamente refráteis, e altamente resistentes a agentes físicos e químicos, devido a sua capa impermeável de proteína tipo queratina. Função: proteção da célula vegetativa das adversidades do meio ambiente (limitação de nutrientes, temperatura, e dessecação). Sua formação leva em torno de 6 horas. Têm pouca atividade metabólica, pode permanecer latente por longos períodos - forma de sobrevivência, e não de reprodução. Ex. Bacillus e Clostridium. 18

FISIOLOGIA BACTERIANA As células procarióticas são compostas por água, macromoléculas, apresentando também uma menor quantidade de outros compostos orgânicos e íons. Todos os organismos vivos necessitam de compostos para sua nutrição, crescimento e multiplicação. Esses compostos são utilizados para a formação dos constituintes celulares e na obtenção de energia. VIAS ANABÓLICAS E CATABÓLICAS Dentro da célula bacteriana ocorrem reações químicas catalisadas por enzimas. O conjunto de transformações da matéria orgânica é denominado METABOLISMO e compreende basicamente dois processos: Quebra de compostos orgânicos complexos em compostos mais simples, com liberação de energia. Ex.: Degradação do açúcar. Construção de moléculas orgânicas complexas a partir de moléculas simples, com gasto de energia. Ex.: formação das proteínas. CATABOLISMO ANABOLISMO 19

NUTRIÇÃO DOS MICRORGANISMOS Os microrganismos necessitam de um ambiente propício com todos os constituintes físicos e químicos necessários para seu crescimento. As substâncias ou elementos retirados do ambiente são utilizadas como blocos para a construção da célula. NUTRIENTES Os nutrientes podem ser de vários tipos, dispostos em três categorias, de acordo com a sua concentração e importância na célula bacteriana: macronutrientes, micronutrientes e fatores de crescimento. MACRONUTRIENTES Macronutrientes Carbono (Compostos orgânicos, CO 2 ) Oxigênio (O Nitrogênio (NH Hidrogênio (H Fósforo (PO 4 ) Enxofre (SO (O 2, H 2 O, comp. orgânicos) (NH 4, NO 3, N 2, comp. org.) (H 2, H 2 O, comp. Orgânicos) (SO 4, HS, S, comp. enxofre) gramas Funções Constituintes de carboidratos, lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos mg Potássio (K + ) Atividade enzimática Cálcio (Ca 2+ ) Resistência ao calor do endosporo Magnésio (Mg 2+ ) Cofator de enzimas, complexos estabiliza ribossomos e membranas Ferro (Fe (Fe 2+ /Fe 3+ com ATP, 3+ ) Constituição de citocromos, cofator de enzimas, cofator de proteínas transportadores de elétrons 20

MICRONUTRIENTES FATORES DE CRESCIMENTO São compostos que alguns tipos celulares necessitam em quantidades muito pequenas. Embora a maioria dos microrganismos seja capaz de sintetizá-los, alguns microrganismos necessitam que eles sejam adicionados ao meio de cultura. Estes compostos entram na composição das células ou de precursores dos constituintes celulares. Aminoácidos Purinas e pirimidinas Colesterol Heme Vitaminas 21

Vitaminas requeridas pelos microrganismos e suas funções FONTES DE CARBONO E ENERGIA PARA O CRESCIMENTO BACTERIANO As bactérias, de acordo com a fonte de carbono e de energia que utilizam, podem ser classificadas em diferentes tipos nutricionais: CARBONO ENERGIA HETEROTRÓFICOS AUTOTRÓFICOS FOTOTRÓFICOS QUIMIOTRÓFICOS Microrganismos que utilizam carbono orgânico Microrganismos que utilizam carbono inorgânico (CO 2 ) Microrganismos que utilizam energia radiante (luz) Microrganismos que utilizam energia química (compostos químicos) 22

Diversidade Metabólica entre os organismos Os microrganismos exibem os mais diversos mecanismos nutricionais. A nutrição ocorre predominantemente pela absorção, através da oxidação de substâncias com alto valor energético, preferencialmente os açúcares. PROCESSO DE NUTRIÇÃO EM PROCARIOTOS 1) Nutrição em Gram positivos => Estas bactérias sintetizam uma série de exoenzimas, as quais são liberadas no meio, clivando os nutrientes, que são captados por proteínas transportadoras. 2) Nutrição em Gram negativos => Devido à presença de uma membrana externa (LPS), as bactérias Gram negativas apresentam um grande número de porinas associadas à camada lipopolissacarídica, e que permitem a passagem de moléculas hidrofílicas, de baixa massa molecular. => No espaço periplasmático dessas células, são encontrados proteases, fosfatases, lipases, nucleases e enzimas de degradacão de carboidratos. 23

FORMAS DE OBTENÇÃO DE ENERGIA I Fermentação: processo no qual os compostos orgânicos são parcialmente degradados Lática: Alcoólica: Aceto-butírica: Acética: Propiônica: ácido lático etanol ácido butírico e acetona ácido acético (vinagre) ácido propiônico => Libera energia de açúcares (2 ATP) ou moléculas orgânicas; => Não requer oxigênio (mas pode ocorrer na presença deste); => Não requer o uso do ciclo de Krebs ou cadeia de transporte de elétrons; => Utiliza uma molécula orgânica como aceptor final de elétrons II - Respiração a) RESPIRAÇÃO AERÓBICA: processo onde os compostos orgânicos são completamente degradados, e o O 2 é o aceptor final dos elétrons. 24

b) RESPIRAÇÃO ANAERÓBICA: processo no qual os compostos orgânicos são completamente degradados, e uma molécula diferente do O 2 é o aceptor final dos elétrons (SO 4, CO 3, NO 3, fumarato, etc) A quantidade de ATP gerada na respiração anaeróbica varia de acordo com o microrganismo e a via. Devido a somente uma parte do ciclo de Krebs funcionar sob condições anaeróbias, o rendimento de ATP nunca é tão alto quanto o da respiração aeróbica. REQUERIMENTOS FÍSICOS E AMBIENTAIS PARA O CRESCIMENTO MICROBIANO Quando falamos em crescimento microbiano no referimos ao número e não ao tamanho das células. Os microrganismos em crescimento estão, na verdade, aumentando o seu número e se acumulando em colônias COLÔNIAS => grupos de células => visualização sem utilização de microscópio. CONDIÇÕES NECESSÁRIAS PARA O CRESCIMENTO MICROBIANO Químicos Água Macronutreintes Micronutrientes Fatores de crescimento Físicos (ambientais) Temperatura ph Pressão Osmótica O 2 25

Temperatura Cada tipo de bactéria apresenta uma temperatura ótima de crescimento. Acima do limite, ocorre desnaturação protéica e conseqüente morte celular. Temperaturas inferiores levam a uma desaceleração das atividades metabólicas. Mecanismos de termoestabilidade das proteínas Os microrganismos termófilos e hipertermófilos apresentam vários mecanismos de termoestabilidade das suas enzimas, como resultado de um pequeno número de mutações altamente específicas. 1) Composição de aminoácidos: alto conteúdo de alanina, arginina aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos. 2) Pontes dissulfeto, interações hidrofóbicas 3) Ligações a metais e modificações pós-traducionais. 4) Teor de bases G-C. 5) Fitanol/ácidos graxos-saturados. 6) Interações com co-fatores. 26

ph A maioria das bactérias cresce melhor dentro de variações pequenas de ph, sempre perto da neutralidade, entre ph 6,5 e 7,5. Pressão Osmótica A capacidade dos microrganismos se adaptar a pressões osmóticas chama-se OSMOADAPTAÇÃO. Os microrganismos são frequentemente encontrados em ambientes onde a concentração do soluto é igual o seu citoplasma (meio isotônico). 27

Halotolerantes: toleram altas concentrações de sais-10% NaCl Halofílicos: requerem altos níveis de NaCl (Vibrio cholerae). Oxigênio O oxigênio pode ser inócuo, indispensável ou letal para as bactérias, o que permite classificá-las em: OXIBIÔNTICAS ANOXIBIÔNTICAS Aeróbios Aeróbios obrigatórios Microaerófilos Anaeróbios obrigatórios Extremamente sensíveis Aerotolerantes Anaeróbios facultativos 28

Por que o oxigênio é letal para os anaeróbios? Incapacidade de eliminação ou capacidade limitada de eliminar produtos do metabolismo do oxigênio molecular. Redução do Oxigênio O 2 + e - = O 2- (ânion superóxido) O 2 + 2 e - = H 2 O 2 (peróxido de hidrogênio) O 2 + 3 e - = H 2 O + OH - (radical hidroxila) O 2 + 4 e - = H 2 O (água => redução total) Espécies Reativas do Oxigênio (EROs) Estratégias de defesa dos microrganismos: mecanismos antioxidantes 29

REPRODUÇÃO BACTERIANA As bactérias se multiplicam por DIVISÃO BINÁRIA SIMPLES, um processo devido à formação de septos na região do mesossomo, que se dirigem da superfície para o interior da célula, dividindo a bactéria em duas células filhas. A fissão é precedida pela duplicação do DNA, que se processa de modo semiconservativo, e cada célula filha recebe uma cópia do cromossomo da célula-mãe. O período da divisão celular depende do tempo de geração de cada bactéria Tempo de geração: tempo necessário para um célula se dividir em duas 30

CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO Quando uma bactéria é semeada em um meio apropriado, nas condições apropriadas, o seu crescimento segue uma curva definida e característica: A Fase LAG: pouca divisão celular, os microrganismos estão se adaptando ao meio em que estão crescendo. As células aumentam de volume, mas não se dividem. B Fase exponencial (log): crescimento exponencial, divisões celulares sucessivas, grande atividade metabólica. C Fase estacionária: decréscimo na taxa de divisão celular, onde a velocidade de crescimento = velocidade de morte D Fase de declínio ou morte: condições impróprias para o crescimento, meio deficiente em nutrientes e rico em toxinas, onde as células mortas excedem o número de células vivas 31