Prof (a) Dra Luciana D. Carvalho

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1 Universidade Federal de Juiz de Fora Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia. Disciplina: MICROBIOLOGIA GERAL E APLICADA A ENFERMAGEM Prof (a) Dra Luciana D. Carvalho

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4 Bibliografia TRABULSI, L.R. Microbiologia, 5ª Ed., Atheneu, MURRAY, PATRICK R.; PFALLER, MICHAEL A.; ROSENTHAL, KEN S. Microbiologia Médica. 5 ed. Ed. Elsevier, TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R. & CASE, C.L. Microbiologia, 6ª edição, Editora Artmed, Porto Alegre, SANTOS, ROMANOS & WIGG. Introdução à virologia humana, Ed.Guanabara-Koogan, JAWETZ, E.; MELNICK, J.L. & ADELBERG, E. Microbiologia Médica. 22ª Ed. McGraw-Hill Interamericana do Brasil, 2001.

5 Morfologia Bacteriana Luciana Debortoli de Carvalho

6 Bactérias BACTÉRIAS - células procariontes, constituindo os menores seres vivos e os mais simples estruturalmente, embora complexos e diversificados do ponto de vista bioquímico e metabólico - ADAPTAÇÃO Morfologia Bacteriana: As células bacterianas são caracterizadas morfologicamente pelo seu tamanho, forma e arranjo. Tamanho: 0,3 /0,8 m até 10/25 m. As espécies de interesse médico variam entre 0,5 a 1,0 m por 2 a 5 m.

7 Morfologia dos Procariotos Forma da célula: cocos bacilos vibriões espirilos Espiroquetas Formas de transição Arranjos Cocos agrupamentos de indivíduos após a divisão seguem um padrão uniforme auxiliam na identificação do gênero bacteriano Vibrião

8 Forma e arranjo: - Cocos (formas esféricas): grupo homogêneo em relação a tamanho, sendo células menores (0,8 a 1,0 m). Diplococos: cocos agrupados aos pares. Ex.: Neisseria (meningococo) Tétrades: agrupamentos de quatro cocos Sarcinas: agrupamento de oito cocos em forma cúbica. Ex.: Sarcina Estreptococos: cocos agrupados em cadeias. Ex.: Streptococcus Estafilococos: cocos em grupos irregulares, lembrando cachos de uvas. Ex.: Staphylococcus

9 Bacilos ou bastonetes: cilíndricos, forma de bastão, podendo ser longos ou delgados, pequenos e grossos, extremidade reta, afilada, convexa ou arredondada. Diplobacilos: bastonetes agrupados aos pares. Estreptobacilos: bastonetes agrupados em cadeias. Paliçada: bastonetes agrupados lado a lado como palitos de fósforos.

10 Formas helicoidais ou espiraladas: células de forma espiral. Espirilos: possuem corpo rígido e se movem às custas de flagelos externos, dando uma ou mais voltas espirais em torno do próprio eixo. Espiroquetas: são flexíveis e locomovem-se provavelmente às custas de contrações do citoplasma, podendo dar várias voltas completas em torno do próprio eixo. Ex.: Gênero Treponema

11 Além desses três tipos morfológicos, existem algumas formas de transição. Quando os bacilos são muito curtos, podem se assemelhar aos cocos, sendo então chamados de cocobacilos (Ex: Brucella melitensis). Quando as formas espiraladas são muito curtas, assumindo a forma de vírgula, eles são chamados de vibrião (Ex: V. cholerae). Formas de transição Vibrião Bacilos muito curtos: cocobacilos. Ex.: Prevotella Espirilos muito curtos, assumindo formas de vírgula: vibriões. Ex.: Vibrio cholerae

12 CITOLOGIA DA CÉLULA BACTERIANA

13 Características básicas dos procariontes: CITOLOGIA BACTERIANA Ausência de compartimentos dentro da célula - metabólitos dispersos no citoplasma; Ausência de núcleo verdadeiro - cromossomo bacteriano disperso no citoplasma A observação interna das estruturas celulares dá-nos uma idéia de como a bactéria funciona no ambiente. A figura a seguir representa as diversas estruturas bacterianas:

14 CITOLOGIA BACTERIANA Pili / Nogueira & Silva Filho (2010)

15 Fímbrias Estruturas Externas dos Procariotos Estruturas filamentosas mais curtas e delicadas que os flagelos, semelhantes a pêlos, que se originam da membrana plasmática, e são usados para fixação, e não para motilidade. São constituídas por uma proteína denominada pilina. Estão relacionadas com a aderência às superfícies mucosas (fímbrias comuns) => colonização. Pili F => relacionado com a transferência de material genético durante a conjugação bacteriana (fímbrias ou pili sexual codificadas pelo plasmídeo F).

16 Estruturas Externas dos Procariotos Cápsula e Camada Limosa (Glicocálix) * composição: glicoproteínas e/ou polissacarídeos * função: - adesão - proteção contra dessecamento e fagocitose

17 Estruturas Externas dos Procariotos Flagelos * apêndices longos (10-20 m) e finos (20 nm) * helicoidais * distribuídos em número variável * Composição de proteína: flagelina * Estrutura: - corpo basal (motor) - gancho - filamento Função: locomoção Monotríquio (polar) Lofotríquio Anfitríquio (polar) Peritríquio

18 Parede Celular Estruturas Internas dos Procariotos Estrutura rígida que recobre a membrana citoplasmática e dá forma às células, além de proteção, mantendo a pressão osmótica intrabacteriana e prevenindo expansão e eventual rompimento da célula. Composição: peptidioglicano (mucopeptídeo ou mureína) estrutura rígida da parede: N-acetilglicosamina (NAG) ácido N-acetilmurâmico (NAM) tetrapeptídeo (4 aminoácidos)

19 Parede Celular Devido as propriedades da parede celular, as bactérias podem ser divididas em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS e GRAM NEGATIVAS, de acordo com a sua resposta à coloração de GRAM. Gram positivas: 90% da parede formados de peptideoglicano (até 20 camadas) nm Gram negativas: 10 % de peptideoglicano (1-2 camadas) 2-3 nm

20 PAREDE DAS GRAM POSITIVAS Possuem maior quantidade de peptidioglicano, o que torna a parede dessas bactérias mais espessa e rígida. Composta por peptidioglicano e ácidos teicóicos (cadeias de polifosfato com resíduos de ribitol e glicerol) ou ácidos lipoteicócicos. Ácidos teicóicos Peptideoglicano Membrana citoplasmática Citoplasma Os ácidos teicóicos/lipoteicóicos estão ligados ao peptidioglicano APENAS nas bactérias Gram positivas, nunca nas Gram negativas.

21 PAREDE DAS GRAM NEGATIVAS Mais complexa - a quantidade de peptidioglicano é menor, e possui uma membrana externa envolvendo a fina camada de peptidioglicano, que se situa no espaço periplasmático. MEMBRANA EXTERNA: Serve como barreira seletiva que controla a passagem de algumas substâncias. Estrutura: bicamada assimétrica, contendo fosfolipídios, semelhante à MP. Internamente => camada de fosfolipídeos e lipoproteína, que está ancorada ao peptidioglicano. Externamente => camada impermeável de lipopolissacarídeo (LPS) molécula anfipática.

22 A membrana externa das bactérias Gram negativas contém porinas, que formam canais por onde penetram diversas substâncias. Lipopolissacarideo Membrana externa Espaço periplasmático lipoproteínas e Peptideoglicano Espaço periplasmático Membrana citoplasmática Citoplasma Maior rigidez à parede celular Seus componentes são tóxicos quando injetados em animais Participa do processo de nutrição formando canais de passagem

23 LPS 3 segmentos ligados covalentemente: lipídio A, cerne do polissacarídeo e antígenos O. A porção lipídica do LPS é também chamada de ENDOTOXINA. O LPS pode ser tóxico, causando febre, diarréia, destruição de hemácias e um choque potencialmente fatal.

24 A Coloração de Gram

25 Membrana Citoplasmática Estruturas Internas dos Procariotos Aproximadamente 10 nm e separa a parede celular do citoplasma. É constituída de fosfolipídeos e proteínas. Desempenha importante papel na permeabilidade seletiva da célula funciona como barreira osmótica. Difere da membrana citoplasmática dos eucariotos por: - não apresentar esteróis em sua composição; - ser sede de numerosas enzimas do metabolismo respiratório; - controlar a divisão bacteriana através do mesossomo.

26 3.2. Estruturas Internas dos Procariotos Inclusões Citoplasmáticas Reserva de energia e de blocos estruturais: * poli- -hidroxibutirato, amido e outros * polifosfatos (grânulos metacromáticos) * enxofre * magnetita (Fe 3 O 4 ) (bactérias magnéticas usam para orientação) Magnetobulus multicellularis (UFRJ)

27 Estruturas Internas dos Procariotos Área citoplasmática Ribossomos: ligados a uma molécula de mrna, são chamados de poliribossomos. Presentes em grande número nas células bacterianas. São menores ribossomos 70S Tipo de rrna em procariotos Número aproximado de nucleotídeos 16s s 5s s 23s s Localização da subunidade

28 Área nuclear Nucleóide: cromossomo bacteriano, constituído por uma única molécula dupla fita circular de DNA não delimitado por membrana nuclear e sem a presença de histonas. Contém as informações necessárias à sobrevivência da célula e é capaz de replicação. Plasmídeos: elementos extracromossomais, moléculas menores de DNA, também dupla fita, circulares, cujos genes não codificam características essenciais, mas podem conferir vantagens seletivas para as bactérias que os possuem (ex.: genes de resistência a antibióticos, metais tóxicos, produção de toxinas, etc). São capazes de auto-duplicação independente do cromossomo bacteriano, e podem existir várias cópias dentro da célula.

29 FISIOLOGIA BACTERIANA Os microrganismos necessitam de um ambiente propício com todos os constituintes físicos e químicos necessários para seu crescimento. As substâncias ou elementos retirados do ambiente são utilizadas como blocos para a construção da célula. NUTRIENTES Os nutrientes podem ser de vários tipos, dispostos em três categorias, de acordo com a sua concentração e importância na célula bacteriana: macronutrientes, micronutrientes e fatores de crescimento.

30 MACRONUTRIENTES Macronutrientes Carbono (Compostos orgânicos, CO 2 ) Oxigênio (O 2, H 2 O, comp. orgânicos) gramas Funções Nitrogênio (NH 4, NO 3, N 2, comp. org.) Hidrogênio (H 2, H 2 O, comp. Orgânicos) Constituintes de carboidratos, lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos Fósforo (PO 4 ) Enxofre (SO 4, HS, S, comp. enxofre) Potássio (K + ) Cálcio (Ca 2+ ) mg Atividade enzimática Resistência ao calor do endosporo Magnésio (Mg 2+ ) Cofator de enzimas, complexos com ATP, estabiliza ribossomos e membranas Ferro (Fe 2+ /Fe 3+ ) Constituição de citocromos, cofator de enzimas, cofator de proteínas transportadores de elétrons

31 MICRONUTRIENTES

32 FATORES DE CRESCIMENTO São compostos que alguns tipos celulares necessitam em quantidades muito pequenas. Embora a maioria dos microrganismos seja capaz de sintetizá-los, alguns microrganismos necessitam que eles sejam adicionados ao meio de cultura. Estes compostos entram na composição das células ou de precursores dos constituintes celulares. Aminoácidos Purinas e pirimidinas Colesterol Heme Vitaminas

33 Vitaminas requeridas pelos microrganismos e suas funções

34 FONTES DE CARBONO E ENERGIA PARA O CRESCIMENTO BACTERIANO As bactérias, de acordo com a fonte de carbono e de energia que utilizam, podem ser classificadas em diferentes tipos nutricionais: CARBONO ENERGIA HETEROTRÓFICOS AUTOTRÓFICOS FOTOTRÓFICOS QUIMIOTRÓFICOS Microrganismos que utilizam carbono orgânico Microrganismos que utilizam carbono inorgânico (CO 2 ) Microrganismos que utilizam energia radiante (luz) Microrganismos que utilizam energia química (compostos químicos)

35 Principais tipos nutricionais dos microrganismos

36 Os microrganismos exibem os mais diversos mecanismos nutricionais. A nutrição ocorre predominantemente pela absorção, através da oxidação de substâncias com alto valor energético, preferencialmente os açúcares. PROCESSO DE NUTRIÇÃO EM PROCARIOTOS 1) Nutrição em Gram positivos => Estas bactérias sintetizam uma série de exoenzimas, as quais são liberadas no meio, clivando os nutrientes, que são captados por proteínas transportadoras. 2) Nutrição em Gram negativos => Devido à presença de uma membrana externa de caráter hidrofóbico (LPS), as bactérias Gram negativas apresentam um grande número de porinas associadas à camada lipopolissacarídica, e que permitem a passagem de moléculas hidrofílicas, de baixa massa molecular. => No espaço periplasmático dessas células, são encontrados proteases, fosfatases, lipases, nucleases e enzimas de degradacão de carboidratos.

37 FORMAS DE OBTENÇÃO DE ENERGIA I Fermentação: processo no qual os compostos orgânicos são parcialmente degradados Lática: Alcoólica: Aceto-butírica: Acética: Propiônica: ácido lático etanol ácido butírico e acetona ácido acético (vinagre) ácido propiônico => Libera energia de açúcares (2 ATP) ou moléculas orgânicas; => Não requer oxigênio (mas pode ocorrer na presença deste); => Não requer o uso do ciclo de Krebs ou cadeia de transporte de elétrons; => Utiliza uma molécula orgânica como aceptor final de elétrons

38 II - Respiração a) RESPIRAÇÃO AERÓBICA: processo onde os compostos orgânicos são completamente degradados, e o O 2 é o aceptor final dos elétrons.

39 b) RESPIRAÇÃO ANAERÓBICA: processo no qual os compostos orgânicos são completamente degradados, e uma molécula diferente do O 2 é o aceptor final dos elétrons (SO 4, CO 3, NO 3, fumarato, etc) A quantidade de ATP gerada na respiração anaeróbica varia de acordo com o microrganismo e a via. Devido a somente uma parte do ciclo de Krebs funcionar sob condições anaeróbias, o rendimento de ATP nunca é tão alto quanto o da respiração aeróbica.

40 REQUERIMENTOS FÍSICOS E AMBIENTAIS PARA O CRESCIMENTO MICROBIANO Quando falamos em crescimento microbiano no referimos ao número e não ao tamanho das células. Os microrganismos em crescimento estão, na verdade, aumentando o seu número e se acumulando em colônias COLÔNIAS => grupos de células => visualização sem utilização de microscópio. CONDIÇÕES NECESSÁRIAS PARA O CRESCIMENTO MICROBIANO Químicos Água Macronutreintes Micronutrientes Fatores de crescimento Físico-químicos (ambientais) Temperatura ph Pressão Osmótica O 2

41 Temperatura Cada tipo de bactéria apresenta uma temperatura ótima de crescimento. Acima do limite, ocorre desnaturação protéica e conseqüente morte celular. Temperaturas inferiores levam a uma desaceleração das atividades metabólicas.

42 ph A maioria das bactérias cresce melhor dentro de variações pequenas de ph, sempre perto da neutralidade, entre ph 6,5 e 7,5.

43 Pressão Osmótica A capacidade dos microrganismos se adaptar a pressões osmóticas chama-se OSMOADAPTAÇÃO. Os microrganismos são frequentemente encontrados em ambientes onde a concentração do soluto é igual o seu citoplasma (meio isotônico).

44 Halotolerantes: toleram altas concentrações de sais-10% NaCl Halofílicos: requerem altos níveis de NaCl (Vibrio cholerae).

45 Presença de Oxigênio pode ser inócuo, indispensável ou letal para as bactérias, o que permite classificá-las em:

46 Oxigênio O oxigênio pode ser inócuo, indispensável ou letal para as bactérias, o que permite classificá-las em:

47 Por que o oxigênio é letal para os anaeróbios? Incapacidade de eliminação ou capacidade limitada de eliminar produtos do metabolismo do oxigênio molecular. Redução do Oxigênio O 2 + e - = O 2- (ânion superóxido) O e - = H 2 O 2 (peróxido de hidrogênio) O e - = H 2 O + OH - (radical hidroxila) O e - = H 2 O (água => redução total) Espécies Reativas do Oxigênio (EROs)

48 Estratégias de defesa dos microrganismos: mecanismos antioxidantes

49 Reprodução bacteriana As bactérias se multiplicam por divisão binária simples, um processo devido à formação de septos na região do mesossomo, que se dirigem da superfície para o interior da célula, dividindo a bactéria em duas células filhas. A fissão é precedida pela duplicação do DNA, que se processa de modo semiconservativo, e cada célula filha recebe uma cópia do cromossomo da célulamãe. O período da divisão celular depende do tempo de geração de cada bactéria Tempo de geração: tempo necessário para um célula se dividir em duas

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51 CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO Quando uma bactéria é semeada em um meio apropriado, nas condições apropriadas, o seu crescimento segue uma curva definida e característica: A Fase LAG: pouca divisão celular, os microrganismos estão se adaptando ao meio em que estão crescendo. As células aumentam de volume, mas não se dividem. B Fase exponencial (log): crescimento exponencial, divisões celulares sucessivas, grande atividade metabólica. C Fase estacionária: decréscimo na taxa de divisão celular, onde a velocidade de crescimento = velocidade de morte D Fase de declínio ou morte: condições impróprias para o crescimento, meio deficiente em nutrientes e rico em toxinas, onde as células mortas excedem o número de células vivas

52 CULTIVO DE MICRORGANISMOS IN VITRO Para cultivar microrganismos em sistemas artificiais, deve-se obedecer a requisitos básicos, como a utilização de um meio com aporte nutritivo adequado para o microrganismo, além de condições fisico-químicas adequadas para seu desenvolvimento. Meio de Cultura: mistura de compostos nutrientes necessários ao crescimento microbiano. O meio de cultura deve atender as exigências nutricionais específicas gênero ou da espécie que se deseja cultivar. do Algumas bactérias crescem em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios especiais e há bactérias que não são capazes de crescer em nenhum meio de cultura já desenvolvido.

53 O que deve conter um meio de cultura? a) Quantidade de água necessária b) Substâncias nutritivas em quantidades adequadas Fonte de energia Fonte de carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo Fonte de sais e íons Fatores de crescimento c) Condições físico-químicas adequadas Temperatura adequada (termófilos, mesófilos e psicrófilos) ph adequado (2 à 9) Pressão osmótica adequada Atmosfera de incubação (aeróbios, anaeróbios, microaerófilos)

54 Classificação dos meios de cultura Estado Físico Quanto ao estado físico, os meios de cultura podem ser: Líquidos Sólidos (1,5% de Agar p/v) Semi-sólidos (0,5 a 0,75% de Agar p/v) Agar: polissacarídeo obtido a partir de algas, que funciona como agente solidificante. Não tem função nutritiva no meio de cultura (PF = 95 C)

55 Composição MEIOS SINTÉTICOS OU QUIMICAMENTE DEFINIDOS: meios em que todos os constituintes são conhecidos. Utilizados para cultura de cianobactérias e algas (fotolitoautotróficos). Neste caso a fonte de carbono seria o CO 2. MEIOS COMPLEXOS: meios que contém ingredientes de composição química desconhecida. Utilizados para cultura de microrganismos com requerimentos nutricionais complexos ou desconhecidos. Podem conter peptonas (hidrolisados de proteínas preparadas por digestão proteolítica parcial de carne, caseína, soja ou gelatina), extrato de carne e/ou extrato de levedura.

56 Composição MEIO SIMPLES: meio que permite o crescimento de espécies pouco exigentes como as Enterobacteriaceae. Ex: caldo nutritivo (peptona, NaCl, extrato de carne); água peptonada. MEIOS RICOS: meio basal enriquecido com ovo, soro ou sangue, substâncias que permitem o crescimento de bactérias muito exigentes em termos nutricionais e que se encontram em número reduzido. Meios caracterizados por ausência de inibidores. Podem ou não ser diferenciais. Exemplos: Agar sangue, Brain and Heart Infusion (BHI)

57 Meios de enriquecimento São meios líquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras, facilitando o isolamento de um microrganismo de interesse. Ex.: caldo de selenito de sódio => permite enriquecimento de Salmonella sp e Shigella sp nas fezes. Não Inoculado Inoculado caldo de selenito de sódio

58 Meio seletivos/ seletivos-diferenciais Permitem apenas o crescimento das bactérias de interesse, pois possuem substâncias inibidoras de outros grupos bacterianos. Exemplos: Meio McConkey Meio EMB Agar Manitol Salgado Agar McConkey Agar EMB Agar Manitol

59 Meios de transporte Meios que servem para o transporte e conservação de um material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais microrganismos. O papel principal deste meio é manter os microrganismos vivos. Ex: meio de Stuart para bactérias frágeis como Neisseria gonorrhoeae. Meio de Stuart

60 Meios redutores Meios adicionados de agentes redutores (tioglicolato de sódio, cisteína) que se combina com o oxigênio eliminando-o do meio de cultivo. Ex.: Ringer PRAS, para anaeróbios

61 Cultivo de bactérias aeróbias Amostra biológica Plantio Primário Incubação à temperatura o C por 24H/ O2 Bico de Bunsen Crescimento bacteriano

62 Cultivo de bactérias microaerófilas (Métodos de produção de CO 2 ) Amostra biológica Plantio Primário Incubação à temperatura o C por 24H Bico de Bunsen Crescimento bacteriano

63 Cultivo de anaeróbios (Métodos de produção de ambiente anaeróbio) Método físico Método químico 90% Nitrogênio, 10% CO 2 Jarra Gas Pak Incubação na estufa bacteriológica

64 Método químico e físico Câmara Anaeróbica 85% Nitrogênio, 10% Hidrogênio, 5% CO 2

65 Bibliografia TRABULSI. Microbiologia. Atheneu Editora, MADIGAN et al., Microbiologia de Brock, 10 a edição. TORTORA et al., Microbiologia 8 a. Ed. Artmed editora.