DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE BOVINA POR MEIO DE HISTOPATOLOGIA

DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE BOVINA POR MEIO DE HISTOPATOLOGIA Francielle David Charro 1, Ana Luiza Alves Rosa Osório 2 1 Aluna do Curso de Medicina Veterinária da UFMS, Iniciação Científica, Modalidade Voluntária PIBIC 2 Professora da UFMS, Departamento de Medicina Veterinária; e-mail: analudmv@nin.ufms.br RESUMO: A vigilância epidemiológica realizada em matadouros constitui uma importante estratégia dos programas de erradicação e controle de tuberculose bovina, sempre que um diagnóstico preciso possa ser obtido a partir de lesões sugestivas dessa doença. Na presente pesquisa, realizou-se o estudo anatomopatológico e pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes em seis amostras teciduais provenientes da inspeção post mortem de bovinos em matadouros-frigoríficos de Mato Grosso do Sul. As lesões sugestivas de tuberculose concentraram-se em linfonodos da região torácica e pulmão. Nos cortes histológicos sob coloração de Ziehl-Neelsen-Faraco foi possível identificar bacilos alcool-ácido resistentes em quatro das seis amostras. Sob coloração de HE três amostras apresentaram granuloma sugestivo de tuberculose e três mostraram lesões difusas, caracterizadas por necrose, sem organizar granuloma. O exame histopatológico, sob coloração de HE, é considerado sugestivo de tuberculose, e sob coloração especial de Ziehl-Neelsen-Faraco, evidencia a presença de bacilos álcool-ácido resistentes, ressaltando-se que os dois recursos diagnósticos se complementam. Palavras-chave: Mycobacterium bovis, tuberculose bovina, bacilos álcool-ácido resistentes. Ziehl-Neelsen-Faraco INTRODUÇÃO Os métodos diretos para o diagnóstico da tuberculose bovina são realizados por meio do exame anatomopatológico de amostras teciduais, obtidas durante a inspeção de carcaças ao abate, com lesões sugestivas da doença e pelo isolamento de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) em cultura (Corner 1994, Souza et al. 1999, Abanto 2000). O diagnóstico bacteriológico é um método seguro e considerado padrão-ouro, mas requer meios de cultivo específicos, descontaminação da amostra, além de longo tempo para a detecção das primeiras colônias (Corner 1994, Pinto et al. 2002). O exame anatomopatológico evidencia as lesões provocadas por Mycobacterium bovis, embora não sejam consideradas patognomônicas (Brasil 2005). O exame histopatológico, sob coloração de HE, permite a verificação da presença de granuloma, o que é considerado sugestivo de tuberculose (Andrade et al. 1991), e sob coloração especial de Ziehl-Neelsen-Faraco, presença de bacilos alcoolácido resistentes (BAAR) (Corner 1994) A fucsina de Ziehl é um sistema para coloração de bactérias álcool-ácido-resistentes em esfregaços de material colhido em áreas diversas ou em amostras teciduais. Utilizado

também em esfregaços de meios de cultura específicos para micobactérias (método de Ziehl- Neelsen). Essas apresentam grande quantidade de lipídeos (ácido micólico) em suas paredes. Tal particularidade faz com que essas bactérias, submetidas a uma coloração por solução de fucsina e ácido fênico, se impregnem pelo corante. Após uma descoloração por solução de ácido clorídrico em álcool, elementos celulares e outras bactérias se descoram, mas as micobactérias mantêm a coloração. Vem daí o uso da expressão "bacilos álcool-ácidoresistentes". Essas características tintoriais se mantêm enquanto a membrana bacteriana estiver íntegra. Com a ruptura da mesma, desaparece a característica álcool-ácido-resistente. Após coloração pela fucsina de Ziehl, procede-se à coloração de fundo com solução de azul de metileno ou outro contracorante ) (Corner 1994,, Brasil 2005). Em cortes histológicos Faraco citado por Michalany (1980) modificou a técnica de coloração desenvolvida por Franz Ziehl e Friederich Neelsen para esfregaços contendo micobactérias. Tal modificação se baseou no reengorduramento dos bacilos com substância oleosa de origem mineral e vegetal. O objetivo deste estudo foi realizar o diagnóstico histopatológico de lesões sugestivas de tuberculose para pesquisa de granuloma e de BAAR. MATERIAIS E MÉTODOS OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS TECIDUAIS COM LESÕES SUGESTIVAS DE TUBERCULOSE Foram utilizadas seis amostras de órgãos com lesões sugestivas de tuberculose, selecionadas durante a inspeção sanitária de abate, de bovinos condenados por tuberculose no período de Agosto de 2008 a Dezembro de 2008, nos matadouros-frogoríficos Garantia em Amambai e Fibrasil, em Eldorado, MS. EXAME HISTOPATOLÓGICO As amostras coletadas foram fixadas em formol 10% e processadas para exame histopatológico. Fragmentos com aproximadamente 1,5 cm de espessura abrangendo, quando possível, a zona de transição entre a área lesada e a área aparentemente normal foram fixados em formol 10% por período mínimo de 48 horas. As amostras foram processadas pela técnica rotineira de inclusão em parafina, microtomizadas a 4 µm, sendo obtidas três lâminas histológicas de cada amostra (Behmer et al., 1976).

Uma lâmina foi corada pela hematoxilina-eosina (HE) com o propósito de observar lesões histológicas. Duas foram submetidas à coloração de Ziehl-Neelsen-Faraco (Copetti 1996), juntamente com controles positivo e negativo para que fosse investigada a presença de BAAR. COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN-FARACO Inicialmente lâminas histológicas foram desparafinadas e hidratadas com solução de reengorduramento (40% de vaselina liquida e 60% de terebentina), sendo duas trocas de 10 minutos em estufa a 60 o C. Depois de enxugadas com papel de filtro as lâminas foram banhadas por três vezes em álcool etílico 95%. Em seguida, as lâminas foram cobertas na sua totalidade com solução de fucsina fenicada de Ziehl (1 g de fucsina básica, 100 ml de álcool etílico PA, 5 g de ácido fênico cristalizado e 100 ml água destilada). Depois de 30 minutos as lâminas foram lavadas em água corrente de baixa pressão, por 10 minutos, e em seguida cobertas com solução diferenciadora de álcool-ácido (1 ml de ácido clorídrico e 100 ml de álcool 70%) por aproximadamente 2 minutos, ou até os cortes ficarem rósea pálido, quando foram novamente lavados e contracorados com solução de verde de malaquita durante 10 minutos, em temperatura ambiente. Após a última lavagem, as lâminas permaneceram em estufa a 45 até completa secagem. Finalmente, os cortes foram clarificados com xilol e montadas com entelan (Copetti 1996). A leitura foi feita em até 100 campos microscópios e o resultado foi dado em número de cruzes conforme escala semiquantitativa (quadro 1) (Brasil 2005). Número Total de Número de bacilo álcool-ácido resistente Resultado Campos Observados observados por campo 100 Não foram encontrados Negativo 100 Menos de 1 BAAR por campo Positivo (+) 50 De 1 a 10 BAAR por campo Positivo (++) 20 Mais de 10 BAAR por campo Positivo (+++) Quadro 1. Escala semiquantitativa para contagem dos bacilos álcool-ácido resistentes em lâminas histológicas coradas por Ziehl-Neelsen-Faraco RESULTADOS

A maioria das amostras examinadas exibia lesões nodulares de diferentes tamanhos, de coloração amarelada e aspecto caseoso, caseocalcificado ou calcificado (Fig. 1a,b). a b Fig. 1. Lesões nodulares em linfonodo retrofaringeo (a) e em lobo inferior do pulmão (b) de carcaça condenada ao abate Os achados histopatológicos de três das seis amostras caracterizaram-se por granulomas que consistiam de um centro de necrose caseosa ou de calcificação circundado por intensa proliferação de células mononucleares, muitas vezes alongadas, formando células epitelióides, células gigantes de Langhans e de uma zona circunscrita de linfócitos. Neutrófilos, intactos ou degenerados, foram notados na periferia da área do centro necrótico. Algumas lesões estavam envolvidas por cápsula fibrosa (Fig. 2). As demais amostras evidenciaram lesões difusas, caracterizadas por necrose, sem organizar granuloma.

Fig. 2. Fotomicrografia de secção de pulmão exibindo com lesão sugestiva de tuberculose. Granuloma com necrose de calcificação central, circundado por células epitelióides e gigantes de Langhans, envolvido por cápsula fibrosa. HE.400X Fig. 3. Fotomicrografia de secção de pulmão exibindo bacilos álcool-ácido-resistentes. Coloração de Ziehl-Neelsen-Faraco. 400X

A concordância entre o exame histopatológico sob coloração de Ziehl-Neelsen-Faraco e a sob coloração de HE está sumarizada no Quadro 2. AMOSTRAS Histopatologia 1. Pulmão 2. Pulmão 3. Linfonodo COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN- FARACO Positivo (+) Positivo (+) Positivo (+) COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA- EOSINA Lesões difusas, caracterizadas por necrose, sem organizar o granuloma Lesões difusas, caracterizadas por necrose, sem organizar o granuloma Presença de granuloma completo 4. Linfonodo Negativo Presença de granuloma completo 5. Pulmão 6. Pulmão Positivo (++) Negativo Lesões difusas, caracterizadas por necrose, sem organizar o granuloma Presença de granuloma completo Quadro 2. Exames hitológicos corados por Ziehl-Neelsen-Faraco e por hematoxilina-eosina DISCUSSÃO Nos cortes histológicos sob coloração de Ziehl-Neelsen-Faraco foi possível identificar BAAR em quatro das seis amostras. Nas duas amostras onde não foi possível identificar BAAR o exame histopatológico foi sugestivo de tuberculose (Quadro 2). Esse fato pode ser explicado em função do estágio de progressão da lesão resultante da reação de hipersensibilidade do tipo tardia, quando o tubérculo desenvolve necrose de caseificação central, fibrose periférica com circunscrição da lesão, que pode evoluir para resolução e calcificação (Morris et al., 1994; Neill et al., 1994). Pois, sabe-se que as características tintoriais se mantêm enquanto a membrana bacteriana estiver íntegra. Com a ruptura da mesma, desaparece a característica álcool-ácido-resistente (Corner 1994, Brasil 2005). Assim sendo, estas duas amostras, possivelmente, também não seriam identificadas em cultura microbiológica. Pois, em muitas situações amostras não evidenciam crescimento de colônias

apesar da evidência da lesão, o que pode ocorrer em função de quantidade reduzida de bactérias viáveis nas lesões, além de outras causas (CPZ 1988, Marcondes et al. 2006). O exame histopatológico, sob coloração de HE, aplicado isoladamente constitui-se em uma técnica de diagnóstico presuntivo para a tuberculose bovina, e pode ser satisfatório em regiões nas quais a prevalência da doença é elevada, mas não deve ser confiável em todas as situações (Andrade et al. 1991, Corner, 1994). Esse diagnóstico nos tecidos pode ser melhorado se a coloração com corantes específicos para micobactérias forem empregados (Michalany 1980). A concordância observada entre o exame histopatológico sob coloração de Ziehl- Neelsen-Faraco e a sob coloração de HE observada em nosso estudo foi semelhante a observada por Martins (2004) que também utilizou as duas técnicas para analisar 63 lesões post mortem sugestivas de tuberculose. CONCLUSÃO O exame histopatológico, sob coloração de HE, é considerado sugestivo de tuberculose, e sob coloração especial de Ziehl-Neelsen-Faraco, evidencia a presença de bacilos alcool-ácido resistentes, ressaltando-se que os dois recursos diagnósticos se complementam. REFERÊNCIAS Andrade, G.B.; Riet-Correa, F.; Mielke, P.V. et al 1991. Estudo histológico e isolamento de micobactérias de lesões similares à tuberculose em bovinos no Rio Grande do Sul. Pesq Vet Bras.11(3-4) 81-86 Behmer, O. P.; Talosa, E. M. C.; Freitas, A. G. Manual de técnicas para histologia normal e patológica. São Paulo: EDART, 1976. 256 p. Brasil/MS/ FUNASA/CENEPI/CRPHF 2005. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. Rio de Janeiro, 2005. 3ª ed. comemorativa. 240 p Copetti, N. 1996. Métodos de Colorações Histológicas e Citológicas. Faculdade de Medicina UFRGS. 118 p

Corner L.A. 1994. Post mortem diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle. Vet. Microbiol. 40: 53-63. CPZ - Centro Panamericano de Zoonosis - Manual de normas y procedimientos técnicos para la bacteriologia de la tuberculosis III. Sensibilidad del Mycobacterium tuberculosis a las drogas. La identificación de micobactérias. Buenos Aires, 1988. 63 p. Marcondes, André Guaragna; Shikama, Maria de Lourdes M; Vasconcellos, Sílvio Arruda; Benites, Nílson Roberti; Morais, Zenaide Maria de; Roxo, Eliana 2006. Comparação entre a técnica de cultivo em camada delgada de ágar Middlebrook 7H11 e meio de Stonebrink para isolamento de Mycobacterium Bovis em amostras de campo. Bra. J Vet Re. Anim Sci 43(3) 362-369 Martins, S. C. Pesquisa de bacilos alcool-ácido resistentes em cortes histológicos de lesões sugestivas de tuberculose em bovinos. 2004. 46 p. UFMS. Dissertação de Mestrado. Campo Grande, 2004. Michalany J. Técnicas histológicas em anatomia patológica. São Paulo. Editora Pedagógica Universal. 1980 Morris, R.S., Pfeiffer, D.U., Jackson, R., 1994. The epidemiology of Mycobacterium bovis infections. Vet Microbiol 40, 153-177. Neill, S.D., Pollock, J.M., Bryson, D.B., Hanna, J., 1994. Pathogenisis of Mycobacterium bovis infection in cattle. Vet Microbiol 40, 41-52. Pinto P.S.A., Faria J.E., Viloria M.I.V., Bevilacqua P.D. 2002. Exame microbiológico da tuberculose como subsídio à inspeção post-mortem de bovinos. Rev. Bras. Saúde Prod. Ani. 3 (1):10-15. Souza A.V., Sousa C.F.A, Souza R.M., Ribeiro R.M.P., Oliveira AL. 1999. A importância da tuberculose bovina como zoonose. Hig Alim13 (59):22-27.