UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA HELDER VERAS RIBEIRO FILHO

0 UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA HELDER VERAS RIBEIRO FILHO EFEITOS CARDIORRESPIRATÓRIOS DO β-citronelol: ENVOLVIMENTO DE FIBRAS AFERENTES VAGAIS E AÇÃO DIRETA EM MÚSCULOS LISO E CARDÍACO FORTALEZA 2015

1 HELDER VERAS RIBEIRO FILHO EFEITOS CARDIORRESPIRATÓRIOS DO β-citronelol: ENVOLVIMENTO DE FIBRAS AFERENTES VAGAIS E AÇÃO DIRETA EM MÚSCULOS LISO E CARDÍACO Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de pós-graduação em Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Farmacologia. Orientador: Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães FORTALEZA 2015

1 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde R369e Ribeiro Filho, Helder Veras. Efeitos cardiorrespiratórios do β-citronelol: envolvimento de fibras aferentes vagais e ação direta em músculos liso e cardíaco/ Helder Veras Ribeiro Filho. 2015. 79 f.: il. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2015. Área de concentração: Farmacologia. Orientação: Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães. 1. Citronellol. 2. Vagus Nerves. 3. Hipotensão. 4. Bradicardia. 5. Apneia. I. Título. CDD 615.1

2 HELDER VERAS RIBEIRO FILHO EFEITOS CARDIORRESPIRATÓRIOS DO β-citronelol: ENVOLVIMENTO DE FIBRAS AFERENTES VAGAIS E AÇÃO DIRETA EM MÚSCULOS LISO E CARDÍACO Aprovada em / /. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de pós-graduação em Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Farmacologia. Orientador: Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães (Orientador) Universidade Federal do Ceará (UFC) Prof. Dr. Nilbeto Robson Falcão do Nascimento Universidade Estadual do Ceará (UECE) Prof. Dr. Mohammed Saad Lahlou Universidade Federal do Ceará (UFC)

3 RESUMO β-citronelol é um monoterpeno encontrado no óleo essencial de diversas plantas aromáticas utilizadas na medicina popular para tratar hipertensão, como a Cymbopogon citratus. O β-citronelol possui propriedades hipotensoras e vasorrelaxantes, porém seu mecanismo ainda não está claro. Portanto, o presente estudo foi realizado para abordar essa questão em ratos normotensos. Para os experimentos in vivo, ratos Wistar macho foram submetidos a cateterização da artéria e veia femoral esquerda para registro da pressão arterial média e para administração de substâncias, respectivamente. Eletrodos permitiram o registro da frequência cardíaca e certos grupos de animais foram traqueostomizados para análise da frequência respiratória. Para os experimentos in vitro, os átrios direito e esquerdo, e anéis de artéria mesentérica foram suspensos em cubas para órgãos isolados sob condições fisiológicas. Em ratos anestesiados com uretana, injeções intravenosas (i.v.) de β-citronelol (5 e 10 mg/kg) causaram hipotensão, bradicardia e apneia em duas fases (fase 1 e fase 2), assim como em animais acordados (5, 10 e 20 mg/kg). A fase 1 dessa tríade (1 2 s de latência), foi abolida pela vagotomia bilateral (BV), pelo tratamento perineural com capsaicina (TP) ou pelo prétratamento com metilatropina (MA, i.v.), assim como pela injeção do β-citronelol dentro do ventrículo esquerdo, mas manteve-se inalterada pelo pré-tratamento i.v. com capsazepina, ondansetrona, suramina ou HC-030031. A fase 2 tardia de bradicardia foi também reduzida pela BV, TP ou MA, enquanto que a apneia de fase 2 foi abolida apenas pela suramina. Em preparações atriais, o β-citronelol induziu efeito cronotrópico e inotrópico negativos, os quais não parecem estar envolvidos com receptores muscarínicos ou adrenérgicos, ou alterações no influxo de cálcio. Em anéis de artéria mesentérica, com e sem endotélio, o β-citronelol relaxou totalmente pré-contrações de fenilefrina com equiparável potência. Esses resultados revelam que a fase 1 de efeitos do β-citronelol origina-se através de um reflexo vago-vagal resultante da estimulação de aferências pulmonares vagais, que parecem não envolver receptores TRPV1, TRPA1, 5- HT 3 ou P2X. A fase 2 de hipotensão e bradicardia parece resultar de uma ação de vasodilatação direta e de um efeito cardíaco depressor, respectivamente. Além disso, receptores P2X parecem estar envolvidos na mediação da resposta de fase 2 de apneia induzida por esse monoterpeno acíclico. Palavras-chave: β-citronelol. Reflexo vago-vagal. Fibras sensoriais pulmonares C.

4 ABSTRACT Cardiorespiratory effects of β-citronellol: involvement of vagal afferent fibers and direct actions on cardiac and smooth muscles. β-citronellol is a monoterpene found in the essential oil of various aromatic plants used in folk medicine to treat hypertension such as Cymbopogon citratus. β-citronellol possesses hypotensive and vasorelaxant properties, but the mechanism of such effects remains unclear. Therefore, the present study was undertaken to address this issue in normotensive rats. For in vivo experiments, male Wistar rats were subjected to catheterization of the left femoral artery and vein for mean arterial pressure monitoring and drug injection, respectively. Electrodes allowed heart rate recordings and some groups of rats were tracheostomized for respiratory rate analysis. For in vitro experiments, right and left atria, and mesenteric artery rings were suspended in organ baths at physiological conditions. In urethane-anesthetized rats, intravenous (i.v.) injections of β-citronellol (5 and 10 mg/kg) caused biphasic (phase 1 and phase 2) hypotension, bradycardia and apnea responses. Biphasic responses was observed also following i.v. injection of β-citronellol (5, 10 and 20 mg/kg) in unanesthetized rats. Phase 1 of this triad (onset time of 1-2 s) was abolished by bilateral vagotomy (BV), perineural treatment with capsaicin (PNT) or pretreatment with methylatropine (MA, i.v.), but remained unaltered by i.v. pretreatment with capsazepine, ondansetron, suramin or HC-030031. Phase 1 responses was absent when β-citronellol was injected into the left ventricle. The delayed phase 2 of bradycardia was also partially reduced by BV, PNT or MA while the apnea component of this phase 2 was only abolished by suramin. In atrial preparations, β-citronellol induced chronotropic and inotropic negative responses, an effect that was related to neither muscarinic and adrenergic receptor activation nor to altered calcium influx. In both endothelium-intact and denuded mesenteric artery rings, β-citronellol fully relaxed phenylephrine-induced contractions in a concentration-dependent manner and with equal potency. These findings reveal that the effects evoked by β-citronellol induced vago-vagal reflex due to stimulation of vagal pulmonary afferents, an effect that seems not involving TRPV1, TRPA1, 5-HT 3, or P2X receptors. Phase 2 hypotensive and bradycardiac responses to β- citronellol appears resulting from a direct vasodilatory effect upon vascular smooth muscle and cardiac depressor action, respectively. Furthermore, P2X receptors seem to be involved in the mediation of phase 2 apneic response to this acyclic monoterpene. Keywords: β-citronellol. Vago-vagal reflex. Pulmonary sensory C-fibers.

5 AGRADECIMENTOS Aos meus pais Fátima Maria Barros Veras e Helder Veras Ribeiro que me deram a oportunidade da formação acadêmica. Agradeço ainda por todos os ensinamentos de vida e pela confiança; Ao Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães por me orientar cientificamente e pessoalmente durante todos os anos de iniciação científica e de mestrado, agradeço ainda pela grande paciência e confiança; Aos Profs. Drs. Rodrigo Siqueira Bezerra de Siqueira e Mohammed Saad Lahlou, que muito colaboraram para meu desenvolvimento acadêmico e, sempre solícitos, colaboraram profundamente para o desenvolvimento e conclusão da presente dissertação; Ao Prof. Dr. Armênio Aguiar dos Santos, tecnicamente por permitir a realização de grande parte dos experimentos em seu laboratório de pesquisa e por ter sido de fundamental importância ao me fornecer a oportunidade de novos projetos; Ao Prof. Dr. Diego Veras Wilke, membro da banca de qualificação, pelas sugestões de melhoria da dissertação; Ao Prof. Dr. Jairo Diniz Filho por pacientemente ter me apresentado ao universo das metodologias in silico, com as quais prontamente me identifiquei e as quais escolhi para trabalhar durante os próximos anos; Ao Laboratório de Farmacologia do Músculo Liso (LAFARMULI), que é minha segunda casa há alguns anos, e aos seus membros, em especial Aclerton Pinheiro Pereira, Alfredo Augusto Vasconcelos da Silva, Daniel Maia Nogueira de Oliveira, Francisco José Batista, Kalinne Kelly Lima Gadelha, Larisse Tavares Lucetti, Patrícia da Fonseca Magalhães, Teresinha da Silva Brito e Thiago Brasileiro Vasconcelos, com os quais convivi a maior parte dos meus dias, pela ajuda técnica nos experimentos, pela colaboração na minha formação acadêmica, pelos ensinamentos de vida, pela paciência e por terem transformado o laboratório em um ambiente prazeroso de se trabalhar.

6 Aos membros do Laboratório Escola Prof. Luiz Capelo (LELC), onde realizei a maior parte dos experimentos, em especial à Camila Meirelles Souza Silva pelos ensinamentos técnicos e pela ajuda fundamental para realização dos experimentos; Aos Profs. do Departamento de Fisiologia e Farmacologia e aos funcionários pela dedicação e contribuição na minha formação acadêmica; Aos colegas de pós-graduação em Farmacologia pelo companheirismo; Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro; A todos meus amigos e familiares que muito me apoiaram e motivaram durante os anos de mestrado. Muito obrigado!

7 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Estrutura química do β-citronelol...12 Figura 2 Comparação estrutural do β-citronelol com outros compostos ativadores de reflexos vago-vagais...17 Figura 3 Modelo esquemático de sistema para registro in vivo de parâmetros cardiovasculares e respiratórios...28 Figura 4 Esquema dos protocolos experimentais realizados in vivo...31 Figura 5 Modelo esquemático do sistema de contratilidade para órgãos isolados..35 Figura 6 Traçados típicos das variações PA e FC em animais acordados submetidos a doses crescentes de β-citronelol...39 Figura 7 Gráficos das reduções máximas da PAM e FC produzida pela administração i.v. de β-citronelol em animais acordados...40 Figura 8 - Traçados típicos das variações de PA, FC e VR em animais anestesiados submetidos a doses crescentes de β-citronelol...42 Figura 9 Gráficos das reduções máximas da PAM e FC produzida pela administração i.v. de β-citronelol em animais anestesiados...43 Figura 10 Curso temporal das alterações cardiorrespiratórias induzidas pela administração i.v. de 10 mg/kg de β-citronelol em animais anestesiados...45 Figura 11 Traçados típicos dos efeitos do β-citronelol em animais bivagotomizados e submetidos a tratamento perineural com capsaicina...47 Figura 12 Gráficos das reduções máximas da PAM e FC de fase 1 ou fase 2 produzida pelo β-citronelol em animais bigavotomizados, após tratamento perineural com capsaicina ou após tratamento com metilatropina....48 Figura 13 Traçados típicos do efeito do β-citronelol no volume respiratório em animais anestesiados...50 Figura 14 Traçados típicos comparativos da administração de β-citronelol pela via intravenosa e pela via intraventricular...53 Figura 15 Gráficos comparativos dos efeitos do β-citronelol pela via intravenosa e pela via intraventricular...54 Figura 16 Traçado típico do efeito do β-citronelol em átrio isolado...56 Figura 17 Efeito cronotrópico e inotrópico do β-citronelol na presença ou na ausência de atropina...57

8 Figura 18 Efeito do pré-tratamento com β-citronelol na curva concentração-efeito ao isoproterenol...58 Figura 19 - Efeito do pré-tratamento com β-citronelol na curva concentração-efeito ao CaCl 2...59 Figura 20 Curva concentração-efeito ao β-citronelol em preparações de arterial mesentérica com ou sem endotélio pré-contraídas com fenilefrina...60 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Efeito do tratamento com antagonistas de receptores TRPV1, 5-HT 3, P2X e TRPA1 nas respostas cardiorespiratórias induzidas pelo β-citronelol...51

9 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BV Bivagotomia CEUA Cômite de Ético no Uso de Animais CPZ Capsazepina DMSO Dimetilsulfóxido ECG Eletrocardiograma EPM Erro padrão da média F1 Fase 1 F2 Fase 2 FC Frequência cardíaca FR Frequência respiratória i.p. intraperitonial i.v. intravenoso i.v.t. intraventricular MA Metilatropina NA Núcleo Ambíguo NTS Núcleo do trato solitário OND Ondansetrona PA Pressão arterial PAM Pressão arterial média SUR Suramina TP Tratamento perineural com capsaicina TRPA1 Receptor de potencial transiente anquirina do tipo 1 TRPV1 Receptor de potencial transiente vanilóide do tipo 1 VR Volume respiratório

10 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 12 1.1 Aspectos fitoquímicos do β-citronelol... 12 1.2 A utilização dos óleos essenciais constituídos de β-citronelol e seu potencial bioativo... 13 1.3 Efeitos cardiovasculares de óleos essenciais e seus constituintes terpênicos... 14 1.4 Relação estrutural do β-citronelol com outros compostos ativadores de reflexos vago-vagais... 16 1.5 A regulação reflexa da pressão arterial... 17 2 JUSTIFICATIVA... 22 3 OBJETIVOS... 23 4 MATERIAIS E MÉTODOS... 24 4.1 Animais... 24 4.2 Soluções e drogas... 24 4.3 Experimentos in vivo... 25 4.3.1 Procedimento de cateterização... 25 4.3.2 Implantação de fios para registro de Eletrocardiograma... 26 4.3.3 Registro de pressão arterial média, frequênca cardíaca e frequência respiratória... 26 4.3.4 Protocolos experimentais in vivo... 29 4.4 Experimentos in vitro... 33 4.4.1 Preparações de músculo liso e cardíaco... 33 4.4.2 Protocolos experimentais... 34 4.5 Análise estatística dos dados... 36 5 RESULTADOS... 37 5.1 O β-citronelol induz resposta hipotensora e bradicardizante bifásicas em ratos acordados... 37 5.2 O β-citronelol induz hipotensão, bradicardia e apneia de duas fases em ratos anestesiados... 41 5.3 O β-citronelol induz efeitos temporalmente comparáveis a respostas reflexas. 44

11 5.4 Os efeitos imediatos de fase 1 induzidos pelo β-citronelol dependem das fibras vagais e de mecanismo colinérgico... 46 5.5 O efeitos elicitados pelo β-citronelol não são originado pela ativação de receptores classicamente conhecidos... 51 5.6 A administração intraventricular do β-citronelol indica que o reflexo vagovagal é originado nos pulmões... 52 5.7 No coração, o β-citronelol induz efeito cronotrópico e inotrópico negativo.... 55 5.8 Na artéria mesentérica, o β-citronelol produz relaxamento da musculatura lisa... 60 6 DISCUSSÃO... 61 7 CONCLUSÃO... 67 REFERÊNCIAS...68 APÊNDICE A Comparação do efeito na PAM e FC induzido por duas doses sequenciais (intervalo de 10 minutos) de β-citronelol (10 mg/kg)... 76 APÊNDICE B Efeito dos tratamentos na PAM e FC... 76

12 1 INTRODUÇÃO 1.1 Aspectos fitoquímicos do β-citronelol O β-citronelol (beta-citronelol, 3,7-Dimetil-6-octen-1-ol, CAS no. 106-22-9), de peso molecular 156,27 g/mol (C 10 H 20 O), é um monoterpeno, sendo estruturalmente formado por duas unidades isoprênicas com cinco carbonos cada, com cadeia acíclica e função álcool (Figura 1). O β-citronelol existe na forma de dois enantiômeros, o (+)- citronelol característico da espécie Eucalyptus citriodora e o (-)-citronelol encontrado em óleos essenciais de rosas. Porém, a forma racêmica, (±)-citronelol, é a forma mais frequentemente encontrada (BAKKALI et al., 2008). Figura 1 - Estrutura química do β-citronelol. Fonte: SEBASTIÃO et al., 2011. O β-citronelol é, portanto, uma substância de ocorrência natural, constituinte de óleos essenciais produzidos por plantas aromáticas sob forma de um metabólito secundário. Os óleos essenciais são misturas complexas que podem conter cerca de 20 a 60 componentes em diferentes concentrações, sendo os compostos da classe dos monoterpenos, como por exemplo o β-citronelol, os mais representativos, constituindo 90% da composição desses óleos (BAKKALI et al., 2008).

13 1.2 A utilização dos óleos essenciais constituídos de β-citronelol e seu potencial bioativo Certas plantas que produzem o β-citronelol em seu óleo essencial são utilizadas por seu aroma ou mesmo para fins ornamentais, como a Rosa damascena Mill. (BABU et al., 2002), estando presente como ingrediente na formulação de diversas fragâncias na indústria cosmética (BUCLEY, 2007; BELSITO et al., 2008). O β-citronelol faz parte da composição de um extenso grupo de alimentos e produtos aromáticos, o que o torna uma substância de potencial capacidade de exposição a população. O β-citronelol foi detectado, por exemplo, na ordem de ppm (partes por milhão) em suco de laranja, cerveja, chá preto, entre outros (De VINCENZI et al., 1987; FEMA, 1997). Na década de 80, um estudo conduzido pelo National Institute for Occupational Safety estimou que em um período de 2 anos 163.706 trabalhadores norte americanos em 62 industrias foram expostos ao β-citronelol no ambiente de trabalho (NLM, 1997). Adicionalmente a esse uso diverso dos óleos essenciais que contêm o β- citronelol e do próprio como constituinte isolado, seu uso terapêutico também é relatado. O capim citronela (Cymbopogon winterianus Jowitt) e a Erva-cidreira-dearbusto (Lippia Alba (Mill) N. E. Brown), por exemplo, são plantas medicinais cujas folhas são utilizadas popularmente em municípios brasileiros no combate à febre, gripe, tosse (GHEDINI et al., 2002) e asma (BARBOSA et al., 2007). As folhas de Cymbopogon citratus, que também possui o β-citronelol como um de seus constituíntes, são utilizadas popularmente por seu efeito anti-hipertensivo (CARBAJAL et al., 1989). Ademais, seu constituinte majoritário e quimicamente relacionado ao β-citronelol, o citral, já foi investigado experimentalmente por produzir efeitos vasorrelaxantes (CHITRA et al., 2012). Como composto isolado, em experimentos utilizando animais de laboratório, o β-citronelol mostrou possuir atividade antinociceptiva e anti-inflamatória in vivo e in vitro em roedores (SU et al., 2010; BRITO et al., 2012; 2013), atividade antifúngica in vitro (PEREIRA et al., 2015) e efeitos antiespasmódicos em preparações de íleo isoladas de ratos (SADRAEI et al., 2013), assim como atividade anticonvulsivante em roedores (SOUSA et al., 2006).

14 1.3 Efeitos cardiovasculares de óleos essenciais e seus constituintes terpênicos Diversos óleos essenciais constituídos de terpenos tiveram seus efeitos cardiovasculares determinados experimentalmente através de sua administração por via intravenosa (i.v.) em ratos normotensos. Estudos prévios de nossa equipe mostraram que o óleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN) (LAHLOU et al., 1999), da Mentha x villosa (OEMV) (LAHLOU et al., 2001), do Ocimum gratissimum (OEOG) (LAHLOU et al., 2004), da Alpinia zerumbet (OEAZ) (LAHLOU et al., 2002) e da Aniba canelilla bark (OEAC) (LAHLOU et al., 2005) induziram uma redução dose-dependente da pressão arterial média (PAM) e da freqüência cardíaca (FC) em ratos normotensos. Efeitos similares foram observados após injeção i.v. dos principais constituintes desses óleos, tais como 1,8-cineol (LAHLOU et al., 2002), metil-eugenol (LAHLOU et al., 2004a), eugenol (LAHLOU et al., 2004b), óxido de piperitenona (LAHLOU et al., 2001) e terpinen-4-ol (LAHLOU et al., 2002), sugerindo que os efeitos cardiovasculares dos óleos estudados podem ser parcialmente atribuídos as ações do(s) seu(s) respectivo(s) principal(ais) constituinte(s). Uma série de argumentos sugere que o efeito hipotensor desses óleos essenciais, assim como de seus principais constituintes resulta, em grande parte, de uma ação vasodilatadora direta na musculatura lisa vascular enquanto a bradicardia é dependente da integridade do sistema nervoso autônomo (LAHLOU et al., 1999; 2001; 2005). Entretanto, a administração i.v. do óleo essencial do Croton zehntneri Pax et Hoffm (De SIQUEIRA et al., 2006), rico em anetol (42%) e estragol (46%), induz efeitos hipotensores e bradicardizantes principalmente de origem reflexa (reflexo vagovagal) através da ativação de receptores TRPV1 localizados nas terminações nervosas de fibras sensoriais vagais. De Menezes e colaboradores (2010) estudaram os efeitos cardiovasculares do óleo essencial de Cymbopogon winterianus, composto de monoterpenos tais como o citronelal, geraniol e β-citronelol (RODRIGUES et al., 2013), em ratos normotensos acordados. A administração por via i.v. do óleo provocou efeito hipotensor associado a taquicardia, porém, na maior dose administrada (20 mg/kg), produziu uma imediata e intensa bradicardia antes do efeito taquicardizante. O óleo essencial não induziu bradicardia em animais submetidos a bivagotomia, sendo sugerido pelos autores que o

15 efeito é mediado por fibras vagais. Por outro lado, a hipotensão induzida pelo óleo em doses menores que 20 mg/kg foi atribuída a um efeito vasorrelaxante direto comprovado em preparações isoladas de artéria mesentérica de forma independente do endotélio. Portanto, o óleo de Cymbopogon winterianus foi capaz de induzir respostas cardiovasculares mediadas por fibras nervosas vagais e através de mecanismos diretos na musculatura lisa de vasos. O óleo essencial da Aniba rosaeodora Ducke var. amazônica (Lauraceae), rico no monoterpeno linalol, também demonstrou ter efeitos cardiovasculares. De Siqueira e colaboradores (2014) demostraram que, quando administrado por via i.v. em ratos normotensos, o óleo induziu uma imediata hipotensão e bradicardia (denominada como fase 1) seguida por uma mais tardia hipotensão e bradicardia (fase 2). A primeira fase de eventos demonstrou ser dependente da estimulação de fibras aferentes vagais, de forma semelhante a dose de 20 mg/kg do óleo comentado anteriormente. Em de preparações de artéria mesentérica, o óleo foi capaz de produzir vasorrelaxamento, sendo portanto esse efeito direto o provável indutor da fase 2 de resposta hipotensora. Certos óleos essenciais, além de induzir efeitos diretos na musculatura lisa vascular, produzem alterações diretas em músculo cardíaco. O Eucaliptol (SOARES et al., 2005), por exemplo, mostrou ter efeito cardiodepressor direto em músculos papilares ventriculares esquerdos através do bloqueio de canais para cálcio, impedindo assim o influxo desse íon. Os efeitos cardiovasculares agudos do β-citronelol, foram estudados por Bastos e colaboradores (2010), que demonstraram que a administração i.v. de β-citronelol em ratos normotensos acordados induziu respostas hipotensoras dose-dependentes associadas a taquicardia. Além dos efeitos observados in vivo, foi mostrada também a capacidade do β-citronelol em provocar relaxamento em preparações de artéria mesentérica de ratos. A administração por via i.v. do monoterpeno carvacrol em ratos acordados (DANTAS et al., 2015), por sua vez, produziu hipotensão relacionada provavelmente a seu efeito vasorrelaxante direto na musculatura lisa. Em preparações atriais isoladas, o carvacrol induziu redução da frequência de contrações, sendo esse efeito relacionado a bradicardia associada a hipotensão observada in vivo. Outro monoterpeno, o eugenol (DAMIANI et al., 2004) também foi capaz de produzir efeitos diretos na musculatura

16 cardíaca. A adição desse monoterpeno em cubas para órgãos isolados contendo músculos papilares ventriculares esquerdos induziu um inotrópico negativo através de bloqueio do influxo de cálcio. 1.4 Relação estrutural do β-citronelol com compostos ativadores de reflexos vagovagais O β-citronelol, como um representante da classe dos monoterpenos, apresenta semelhança estrutural com outros monoterpenos como o linalol e o citral (Figura 2). O linalol, conforme já mencionado, produz efeitos cardiovasculares de hipotensão e bradicardia, sendo parte de seus efeitos mediados por respostas vagais. Esses efeitos cardiovasculares são caracteristicamente semelhantes aos induzidos pela administração i.v. de capsaicina, agonista do receptor de potencial transiente vanilóide do tipo 1 (TRPV1). A capsaicina, cuja cadeia alifática é semelhante a estrutura do β-citronelol (Figura 2), é uma ferramenta bastante utilizada para explorar a função de neurônios sensoriais uma vez que ativa neurônios aferentes vagais do tipo C, distribuídos sistemicamente e encontrados no coração e na camada adventícia de muitos vasos sanguíneos (BARJA et al., 1983; WHARTON et al., 1986). Segundo Rubino e Burnstock (1996), várias evidências indicam que os nervos sensoriais contribuem para o controle da função cardíaca e da regulação do tônus vascular. A administração i.v. de capsaicina em ratos normotensos resulta em um efeito trifásico na PA e bifásico na FC (DONNERER E LEMBECK, 1982). O primeiro desses efeitos é uma hipotensão imediata associada com bradicardia (fase A) mediadas por reflexo vago-vagal, seguida por um aumento levemente superior aos níveis basais da PA (efeito B) produzido por vasoconstrição direta, concluindo com uma queda gradual na pressão sanguínea associada a uma secundária e lenta bradicardia (efeito C) também mediadas por fibras sensoriais vagais. Stotz e colaboradores (2008) demonstraram que o citral, outro monoterpeno estruturalmente relacionado ao β-citronelol, ativa receptores TRPV1. Além disso, o próprio β-citronelol foi descrito por Ohkawara e colaboradores (2010) por ser capaz de ativar esses receptores em celular humanas isoladas, alem de ser descrito também por ativar receptores TRPA1 (receptor de potencial transiente anquirina do tipo 1), sendo esse o mecanismo de seu efeito repelentes contra insetos (KWON et al., 2010).

17 Os receptores TRPV1 e TRPA1, assim como receptores serotoninérgicos 5-HT 3 e purinérgicos P2X, estão presentes nas terminações nervosas de fibras aferentes vagais e, uma vez ativados, induzem respostas cardiorrespiratórias depressoras mediadas pelo reflexo vago-vagal (LUPINSKI et al., 2011). Figura 2 Comparação estrutural do β-citronelol com outros compostos ativadores de reflexos vago-vagais Fonte: National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Database; CIDs=8842, 638011, 6549 e 2548, respectivamente. 1.5 A regulação reflexa da pressão arterial A pressão arterial é dependente do débito cardíaco e da resistência periférica total, sendo o primeiro componente, por sua vez, definido como produto da FC pelo volume de efejão sistólico. Assim, em certas situações em que se faz necessário uma imediata elevação da pressão arterial, o aumento da frequência cardíaca, e ou o aumento na resistência periférica total contribui para tal elevação. A pressão arterial é, dessa forma, regulada ou comumente dita autorregulada, momento a momento por diversos sistemas e componentes do corpo humano, como o sistema nervoso autônomo, com o objetivo de proporcionar um aporte sanguíneo necessário à atividade dos tecidos e um meio de remover metabólitos ou distribuir substâncias endógenas para outros territórios,

18 obedecendo a um limite pressórico que não cause danos aos vasos que distribuem o sangue ou tecidos que o recebam (GUYTON, 1977). Os sistemas de controle e regulação da pressão arterial atuam em tempos de ação diferentes sendo, por exemplo, a regulação através da via renal de efeito mais lento uma vez que atua principalmente por mecanismos de controle do volume sanguíneo. A regulação através de vias neurais, por sua vez constitui-se como uma via mais rápida, sendo ambas essenciais para a manutenção da pressão arterial em níveis adequados frente às súbitas alterações que pode sofrer por imposição da demanda metabólica tecidual, por exemplo, causadas pela atividade física (GUYTON, 1977). Diferentes sistemas corporais estão envolvidos no controle da pressão arterial de forma integralizada. O ritmo respiratório, por exemplo, influencia diretamente a frequência cardíaca (ritmo sinusal). Vários reflexos neurais que comumente produzem redução na frequência cardíaca, apenas são operados na fase de expiração na qual existe aumento da atividade do nervo vago. Por outro lado, a inspiração, na qual a atividade vagal está diminuída, pode contribuir para o aumento na frequência cardíaca (OPENSHAW, 1979). Diversos mecanismos neuro-humorais trabalham momento a momento captando informações sensoriais periféricas e gerando respostas reflexas rápidas e efetivas para a manutenção da pressão arterial, como por exemplo, os baroreflexos, quimiorreflexos e reflexos cardiopulmonares. Os baroreflexos são constituídos por baroreceptores arteriais, cardiopulmonares e receptores localizados na adventícia do seio carotídeo e arco aórtico sensíveis a estímulos mecânicos. A tensão desses sensores ativa potenciais de ação que trafegam com destino a um centro integrador localizado no bulbo denominado de núcleo do trato solitário (NTS), onde a partir daí neurônios de segunda ordem podem fazer sinapses com neurônios simpáticos inibitórios e em paralelo através de outros neurônios de segunda ordem manter influência excitatória sobre neurônios parassimpáticos. A regulação da pressão arterial pelo baroreflexo é então feita através da modulação das eferências autonômicas em nível de coração, rins e leitos vasculares (ALBAGHDADI, 2007). Outro reflexo de relevante importância na regulação da pressão arterial é o quimiorreflexo. Variações na pressão parcial dos gases O 2 e CO 2 ou variações no ph sanguíneo estimulam células sensíveis a esse tipo de estímulo químico localizadas nos

19 corpos aórticos e carotídeos que levam essas informações através de fibras aferentes até o NTS. A partir daí, vias neurais provocam alterações na atividade eferente simpática e vagal para o coração, vasos sanguíneos e pulmões (MARSHALL, 1987). Além da pressão parcial de gases e do ph, agentes químicos podem estimular componentes reflexos que regulam a pressão arterial, como os reflexos cardiopulmonares vago-vagais. Os reflexos vago-vagais são caracterizados por possuírem componentes aferentes e eferentes vagais. O nervo vago é o décimo nervo craniano, caracterizado por uma trajetória que provê uma extensa inervação da região do pescoço, peito e abdômen, e regula, além das funções cardiovasculares, a respiração, resposta imune e o sistema digestório (CHANG et al., 2015). Esse nervo contém tanto fibras aferentes sensíveis a estímulos mecânicos quanto populações de fibras sensíveis a estímulos químicos e, quando estimuladas por esses últimos, as aferências podem dar inicio ao quimiorreflexo (VERBERNE et al., 2002). A função primária das fibras aferentes é captar informações sensoriais de regiões periféricas do organismo e levá-las até centros integradores como o NTS. Quimiorreflexos pulmonares, por exemplo, podem se originar através ativação de fibras sensoriais vagais não mielinizadas do tipo C que proveem a captação sensorial de todos os níveis do trato respiratório com suas terminações nervosas localizadas na proximidade dos capilares pulmonares e no epitélio das vias aéreas de condução (KWONG et al., 1998). Esse tipo de fibras corresponde a aproximadamente 75% das fibras vagais (JAMMES et al., 1982), possuem pequeno diâmetro e baixa velocidade de condução, e respondem a estímulos nocivos mecânicos, térmicos e químicos. (HOLZER et al., 1991). Quando estimuladas por substâncias químicas inaladas ou injetadas na circulação sanguínea, podem produzir como consequência fenômenos reflexos de hipotensão e bradicardia (LEE e YU, 2014). Assim como nos outros tipos de reflexos comentados, as informações sensoriais que trafegam através das fibras vagais são integradas no NTS, sendo, portanto esse núcleo o responsável por receber informações aferentes primárias de uma extensa variedade de receptores localizados perifericamente e importantes para o controle do sistema nervoso autônomo (KALIA et al., 1980). Posteriormente, neurônios de segunda ou terceira ordem projetam-se para o núcleo ambíguo (NA) e núcleo dorsal motor do nervo vago (CAMPAGNOLE-SANTOS et al., 2001). Assim, os neurônios pré-

20 ganglionares vagais localizam-se nesses dois grandes núcleos bulbares e suas fibras pósganglionares, no coração, inervam principalmente o nodo sinusal, a musculatura atrial e o nodo atrioventricular, estimulando a liberação de acetilcolina que ativa os receptores muscarínicos M 2. A estimulação de receptores muscarínicos M 2 leva então a redução da FC (GUYENET, 2006). Um típico reflexo vago-vagal com efeitos cardiovasculares e respiratórios e que tem por base a ativação de fibras aferentes vagais do tipo C é o reflexo de Bezold- Jarisch, descrito primeiramente pelo fisiologista Albert Von Bezold em 1867, e aprimorada a compreensão pelo farmacologista Adolf Jarisch na década de 40. O reflexo de Bezold-Jarisch é um quimiorreflexo iniciado pela ativação de receptores cardiopulmonares que se conectam com o sistema nervoso central através do nervo vago, sendo esse, portanto seu componente aferente (DAWES e WIDDICOMBE, 1953). A saída cardíaca, conforme descrita por Frink e James (1971) é através de um estreito funil envolvendo a artéria coronária principal esquerda. O componente eferente desse reflexo é também o vago, sendo essa via colaboradora tanto no aumento da atividade vagal cardíaca quanto na depressão da atividade simpática (DAWES e COMROE, 1954). O reflexo de Bezold-Jarisch produz uma imediata hipotensão, bradicardia e apneia, podendo ser ativado de forma experimental por agonistas de receptores TRPV1 como a capsaicina (HOLZER, 1991), agonistas 5-HT 3 serotoninérgicos como a fenilbiguanida (LUPINSKI et al., 2011), agonistas de receptores purinérgicos P2X como o αβ-metileno ATP (MCQUEEN et al., 1998), alcalóides do Veratrum (DAWES, 1947), nicotina e bradicinina (EVANS et al., 1991), adenosina e íons H + (SCHULTZ, 2001). Apesar de serem relatados muitas vezes como fenômenos meramente curiosos, como é o caso do reflexo de Bezold-Jarisch, estudos apontam a importância fisiopatológica desses reflexos cardiopulmonares. Aviado e Aviado (2001) mostraram, por exemplo, a importância desses reflexos como uma forma de defesa contra a inalação de substâncias químicas nocivas, servindo como mecanismo de defesa para a proteção de órgãos vitais. Clinicamente, o próprio reflexo de Bezold-Jarisch tem sido alvo de estudos, mostrando ser importante para a patofisiologia de muitas desordens cardiovasculares. Pacientes com infarto agudo do miocárdio apresentam evidências de bradicardia e hipotensão durante o ataque (ALLYN, 1983), sendo sugerido por Robertson e Robertson (1981) um possível efeito atenuante do reflexo de Bezold-

21 Jarisch contra os efeitos deletérios produzidos pela isquemia cardíaca. Além disso, as interações entre esse e outros reflexos, como o baroreflexo, são descritos como importantes mecanismos na regulação da pressão arterial sanguínea em condições fisiológicas e patofisiológicas (MANCIA et al., 1976; DONALD et al., 1978; VASQUEZ et al. 1997). Dessa forma, esses fatos demonstram a importância do estudo dos reflexos cardiopulmonares e a modulação química desses fenômenos pode propiciar uma nova abordagem dessas condições patofisiológicas.

22 2 JUSTIFICATIVA O β-citronelol é um monoterpeno acíclico constituinte de óleos essenciais utilizados na medicina popular para diversos fins. Além disso, por sua utilização como fragrância está presente na forma de ingrediente em muitos produtos cosméticos e aromatizantes. Apesar de ampla utilização do β-citronelol e de óleos essenciais que o contêm, seus efeitos cardiovasculares e respiratórios agudos foram pouco investigados. Estudos já mostraram efeitos vasorrelaxantes in vitro e efeitos hipotensores e bradicardizantes in vivo produzidos pelo β-citronelol, demonstrando sua capacidade em alterar de maneira aguda a pressão arterial e a frequência cardíaca, assim como provocar alterações diretas na contratilidade da musculatura lisa vascular. Semelhanças estruturais com outros compostos que induzem efeitos cardiorrespiratórios conhecidos e mais amplamente estudados direcionaram nossos estudos para a hipótese do β-citronelol de induzir reflexos vago-vagais com repercussões cardiovasculares e respiratórias. Dessa forma, nos propusemos a estudar mais detalhadamente o efeitos do β-citronelol sobre parâmetros cardiovasculares e respiratórios de ratos, especialmente os mecanismos que envolvem a participação de reflexos vago-vagais.

23 3 OBJETIVOS Objetivo geral Estudar os efeitos cardiovasculares e respiratórios agudos do β-citronelol. Objetivos específicos Avaliar o efeito de doses crescentes de β-citronelol na pressão arterial média, frequência cardíaca e respiratória, em animais normotensos anestesiados ou acordados Investigar o papel das fibras vagais nos efeitos induzidos pelo β-citronelol; Localizar o sítio anatômico, pulmonar ou cardíaco, de origem dos efeitos induzidos pelo β-citronelol; Avaliar o envolvimento os receptores TRPV1, TRPA1, 5-HT 3 ou P2X na mediação dos efeitos do β-citronelol; Determinar os efeitos do β-citronelol diretamente em preparações de átrio e de artéria mesentérica.

24 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Animais Ratos Wistar machos, pesando entre 280 e 320 g, provenientes do biotério central da Universidade Federal do Ceará (UFC), foram mantidos sob condição padrão de temperatura constante (22 ± 2 C) em gaiolas de polipropileno (410 x 320 x 160 mm) em grupos de seis animais sob ciclo de doze horas de luz e doze horas de escuridão, com livre acesso a comida e água. Durante o alojamento, a manipulação dos animais consistiu apenas de procedimentos necessários para troca de ração, água, limpeza e higienização das gaiolas. Os animais foram tratados com respeito às normas de cuidado e bem estar animal preconizadas pela Lei 11.794 de 2008 e pela Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais para Fins Científicos e Didáticos (DBCA) e todos os procedimentos aprovados pelo comitê de ética no uso de animais (CEUA) da Universidade Federal do Ceará (número 37/2014). 4.2 Soluções e drogas Para os experimentos in vivo, o β-citronelol ((±)-β-citronelol adquirido da Sigma, St. Louis, Estados Unidos) foi dissolvido em Tween 80 na concentração de 2 % em salina isotônica estéril, utilizando processo de sonicação para completa homogeneização da preparação. Todas as drogas administradas pela via i.v. foram injetadas em bolus em um volume de 0,1 ml, seguido de um flush de 0,2 ml com salina fisiológica. Estudos prévios mostraram que as injeções i.v. desse veículo (100 μl) não tiveram efeitos significantes no estado basal da pressão arterial média (PAM) ou frequência cardíaca (FC; LAHLOU et al., 2003, 2004 e 2005), sendo o procedimento confirmado também experimentalmente no presente trabalho. Os anestésicos 2,2,2- tribromoetanol e uretana foram adquiridos da Sigma (St. Louis, Estados Unidos) e o pentobarbital de sódio adquirido da Cristalia (São Paulo, Brasil), sendo todos administrados nos animais pela via intraperitonial (i.p.). A capsaicina, na concentração de 250 μg/ml, usada no tratamento perineural (TP) dos vagos foi preparada em solução de 1 % de Tween 80, 1 % de etanol e 98 % de salina fisiológica. A capsazepina foi primeiro solubilizada em dimetilsulfóxido (DMSO, adquirido da Sigma, St. Louis,

25 Estados Unidos) a 0,1 mol/l (aproximadamente 37 mg/ml) e posteriormente diluída com salina contendo 10 % de Tween 80 e 10 % de etanol até uma concentração final de 1 mg/ml, como previamente descrito por De Siqueira e colaboradores (2010). De forma semelhante, o HC-030031 foi primeiramente solubilizado em DMSO e posteriormente diluído com salina contendo 10 % de Tween 80 e 10 % de etanol. O cloridrato de ondansetrona (OND), a suramina sódica (SUR) e o brometo de metilatropina (MA), por sua vez, foram solubilizados diretamente em salina fisiológica. As doses dos agonistas e antagonistas foram escolhidas de acordo com as recomendadas na literatura e os antagonistas utilizados nos protocolos foram testados experimentalmente com seus respectivos agonistas, conforme descrito na seção Protocolos experimentais in vivo, para avaliação de sua eficácia na dose utilizada. Para os experimentos in vitro, o β-citronelol foi dissolvido em uma solução de 2 % de Tween 80 em água destilada. O isoproterenol, a atropina e a fenilefrina foram dissolvidos diretamente em água destilada e sonicados antes de seu uso. Todas as substâncias utilizadas nos experimentos in vitro foram adquiridas da Sigma (St. Louis, Estados Unidos) e foram preparadas imediatamente antes de cada experimento. O meio fisiológico utilizado para manutenção da viabilidade dos tecidos nas cubas para órgãos isolados foi a solução fisiológica modificada de Krebs-Henseleit, com a seguinte composição de sais (em mm): 118,0 NaCl; 5 KCl; 1,18 NaH 2 PO 4 ; 1,18 MgSO 4 7H 2 O; 2,50 CaCl 2 ; glicose e 11,1 NaHCO 3 ). O sais, todos de grau analítico, foram adquiridos da Sigma (St. Louis, Estados Unidos) ou Merck (Darmstadt, Alemanha). 4.3 Experimentos in vivo 4.3.1 Procedimento de cateterização Para o procedimento de cateterização, foi confeccionado um cateter (figura 3A) formado pela fusão de um cateter de polietileno PE-10 (Intramedic, Becton Dickinson, NJ, Estados Unidos) de tamanho aproximado de 3,5 cm, que é inserido dentro do vaso sanguíneo, com um cateter de polietileno PE-50 (Intramedic, Becton Dickinson, NJ, Estados Unidos) de tamanho aproximado de 12 cm, que é exteriorizado do animal. Antes da realização do procedimento cirúrgico de cateterização, independente do grupo de animais a serem utilizados, os mesmos foram anestesiados com injeção de tribromoetanol (250 mg/kg). Durante o procedimento cirúrgico, um

26 cateter foi implantado na aorta abdominal através da artéria femoral esquerda com o objetivo de registrar a pressão arterial média (PAM) e outro cateter implantado na veia cava inferior através da veia femoral esquerda para administração das drogas por via i.v. (Figura 3B). Ambos os cateteres implantados foram previamente preenchidos com solução de heparina em salina (3 %) para prevenir a coagulação sanguínea em seu interior e, logo em seguida, percorreram o tecido subcutâneo até serem exteriorizados na região dorsal do animal, a fim de evitar com que esse último deteriore-os no período de recuperação. Um grupo separado de animais, utilizado para os procedimentos experimentais nos quais foi administrado β-citronelol por via intraventricular (i.v.t.), foi submetido a outro procedimento de cateterização no momento do experimento. Um cateter de Teflon foi inserido na artéria carótida direita e avançado retrogradamente até estar posicionado dentro do ventrículo esquerdo. A posição do cateter foi primeiramente indicada pela característica do traçado de pressão pulsátil registrada dentro do ventrículo e confirmada por exame post mortem. 4.3.2 Implantação de fios para registro de Eletrocardiograma Três fios de aço inoxidável (D.E. 0,203 mm, Stainless Steel Teflon Coated, A.M. System ) foram fixados no tecido subcutâneo dos animais, bilateralmente em nível de músculo peitoral e em nível de músculo quadríceps esquerdo, para registro do eletrocardiograma (ECG). Depois de fixados, todos os fios foram exteriorizados através do mesmo orifício feito para exteriorização dos cateteres vasculares (Figura 3B). Após implantação dos fios de ECG e após procedimento de cateterização, os animais foram alojados individualmente em caixas de polipropileno com livre acesso a água e comida para recuperação de 24 h antes de qualquer experimento. 4.3.3 Registro de pressão arterial média, frequênca cardíaca e frequência respiratória Após recuperação, no momento dos experimentos, os animais pertencentes ao grupo experimental de animais anestesiados foram anestesiados com uretana (0,8 g/kg). Um grupo separado de animais usados nos protocolos experimentais com o antagonista de receptores purinérgicos, suramina, foi anestesiado com pentobarbital (50 mg/kg,

27 i.p.). O uso do pentobarbital nesse protocolo foi devido ao fato do agonista α,βmetilenoatp não induzir por completo seus efeitos cardiorespiratórios em animais anestesiados com uretana, conforme relatado por MCQUEEN e colaboradores (1998). Para a análise da frequência respiratória (FR), uma pequena cânula (sonda uretral nº 4, de aproximadamente 3 cm e com um orifício na região oposta a extremidade que foi inserida na traqueia, orifício pelo qual o animal poderá respirar espontaneamente, na posição supinada) foi inserida na traqueia e conectada a um módulo de espirometria ( ML-14, ADInstruments ). Os fios de aço inoxidável implantados nos animais foram conectados a um módulo Bio Amp (ML-132, ADInstruments ) para registro de ECG, o qual foi derivado para se obter FC. O cateter inserido na artéria femoral foi conectado a um transdutor de pressão (ML-0699, ADInstruments ) previamente calibrado com a ajuda de uma coluna de mercúrio. O transdutor, por sua vez, foi acoplado a um módulo de pressão sanguínea (MLT-112, ADInstruments ). Todos os módulos foram conectados a um sistema de aquisição de dados (Powerlab 8/5p, ADInstruments ) (Figura 3B).

28 Figura 3 Modelo esquemático de sistema para registro in vivo de parâmetros cardiovasculares e respiratórios A B Fonte: Autoria própria. Em A, imagem do cateter confeccionado pela fusão de um cateter PE- 10, segmento que vai de 0 a aproximadamente 4 cm, com um cateter PE-50, segmento que vai do centímetro 4 ao 16 da régua. A porção final do cateter é conectada a um segmento de aço de calibre semelhante para evitar o escoamento da solução de salina do interior do cateter. Em B, imagem do sistema para registro de alterações de pressão arterial, frequência cardíaca e frequência respiratória. A imagem mostra um animal anestesiado traqueostomizado com a cânula respiratória, os fios de ECG e o cateter inserido na artéria femoral conectados ao sistema de aquisição de dados. O cateter inserido na veia femoral está conectado a seringa para administração das substâncias em estudo. A imagem ilustra também um animal acordado com os cateteres e fios de ECG exteriorizados por sua região dorsal.

29 4.3.4 Protocolos experimentais in vivo Com o objetivo de investigar os efeitos cardiovasculares e respiratórios do β- citronelol, foram realizados protocolos experimentais in vivo, com registro de PAM, FC e FR, em animais acordados e em animais anestesiados. Antes de se iniciar qualquer experimento cardiovascular in vivo, um período de 15 a 20 minutos foi concedido para se obter um traçado estável de PAM, FC e FR. Uma vez atingida a estabilização dos parâmetros, os protocolos experimentais foram iniciados, sendo os mesmos divididos nas seguintes 5 séries, esquematizadas na figura 4: Série 1: Essa série de experimentos foi realizada para estabelecer a relação dose-efeito do β-citronelol nos parâmetros de PAM, FC e FR (esse parâmetro foi registrado apenas em animais anestesiados). Cada animal, anestesiado (n = 6) ou acordado (n = 5), recebeu doses crescentes de β-citronelol (1, 5, 10 e 20 mg/kg, i.v.) e as alterações no decorrer do tempo foram registradas. O intervalo entre as doses foi de 10 minutos para o reestabelecimento dos parâmetros cardiorrespiratórios e para ser evitado o fenômeno de taquifilaxia. Série 2: Essa série de experimentos foi realizada para caracterizar o curso temporal dos efeitos induzidos pelo β-citronelol. Doses isoladas de 10 mg/kg (n = 8) de β-citronelol, dose submáxima, foram utilizadas e tanto o tempo de inicio para as alterações cardiorrespiratórias quanto a duração dessas alterações foram mensuradas. Série 3: Essa série de experimentos foi realizada para avaliar a participação do vago e da via colinérgica eferente no efeito cardiorespiratório produzido pelo β-citronelol. Para esse propósito foi realizada uma vagotomia bilateral cervical, ou seja, depois de isolados, ambos os vagos foram cortados e 10 minutos após esse procedimento foi administrada a dose de 10 mg/kg de β-citronelol (n = 5). Ainda para avaliar a participação vagal, porém agora apenas a participação das fibras aferentes, foi utilizado um método bem conhecido de tratamento perineural bilateral cervical do nervo vago com capsaicina (Janscó & Such, 1983; Schelegle et al., 2000). O método consistiu no isolamento de ambos os vagos cervicais e logo em seguida segmentos do nervo de 2 a 3 mm foram envoltos por um swab de algodão embebido com capsaicina (250 μg/ml), sendo então os swabs removidos e a região irrigada com salina fisiológica. Esse procedimento produz a dessensibilização apenas das fibras aferente vagais do tipo C,

30 impedindo o tráfego de informações por essas fibras. Após 20 minutos do tratamento perineural com capsaicina, foi realizada a administração de 10 mg/kg de β-citronelol (n = 4). A eficiência do tratamento foi comprovada pela administração por via i.v. de capsaicina. Por fim, para avaliar a participação de receptores muscarínicos nos efeitos induzidos pelo β-citronelol, animais acordados foram tratados com um antagonista muscarínico que atua apenas perifericamente, não ultrapassando a barreira hematoencefálica, a metilatropina na dose de 1 mg/kg. Após 5 minutos do tratamento, foi realizada a administração de 10 mg/kg de β-citronelol (de SIQUEIRA et al., 2006; n = 5). Série 4: Essa série de experimentos foi realizada para determinar se os efeitos produzidos pelo β-citronelol eram mediados pela ativação de receptores TRPV1 (receptor de potencial transiente vanilóide do tipo 1), 5-HT 3 (receptor serotoninérgico), P2X (receptor purinérgico) ou TRPA1 (receptor de potencial transiente anquirina do tipo 1). Os animais foram tratados com administração intravenosa dos antagonistas capsazepina (2 mg/kg, n = 4), ondansetrona (30 μg/kg, n = 5), suramina (2 mg/kg, n = 5) ou HC-030031 (2 mg/kg, n = 4) e após 40 segundos, 5 minutos, 40 segundos ou 2 minutos, respectivamente, foram submetidos a administração de 10 mg/kg de β- citronelol. As doses e os intervalos de dose foram escolhidos baseados na literatura (MALINOWSKA et al., 2001; BAGCHI & DESHPANDE, 1999; MCQUEEN et al., 1988, De SIQUEIRA et al., 2014) e confirmados experimentalmente com seus respectivos agonistas, capsaicina (1 μg/kg, n = 3), serotonina (10 μg/kg, n = 4) e α,βmetilenoatp (100 μg/kg, n = 4). Série 5: Essa série de experimentos foi realizada para determinar a localização dos terminais das fibras aferentes do tipo C envolvidas na indução das respostas cardiorespiratórias pelo β-citronelol, comparando para tal os efeitos da dose de 5 mg/kg de β-citronelol injetada por via intravenosa e por via intraventricular (n = 5). O β- citronelol injetado dentro do ventrículo esquerdo contorna a circulação pulmonar e presumivelmente não tem acesso imediato as fibras pulmonares do tipo C.

Figura 4 Esquema dos protocolos experimentais realizados in vivo 31

Fonte: Autoria própria. Os protocolos foram divididos didaticamente em 5 séries, sendo em cada série indicado se foram utilizados animais acordados ou anestesiados. As abreviações são denominadas como: BCIT, β-citronelol; BV, bivagotomia; MA, metilatropina; CPZ, capsazepina; OND, ondansentrona; SUR, suramina; IV, intravenoso; IVT, intraventricular; PAM, pressão arterial média; FC, frequência cardíaca e FR, frequência respiratória. Todos os animais anestesiados foram anestesiados com uretana, com exceção dos animais utilizados para os protocolos com suramina, que foram anestesiados com pentobarbital. 32

33 4.4 Experimentos in vitro Para os experimentos in vitro foram utilizados dois tipos de tecidos cardiovasculares que estão envolvidos diretamente com a regulação da pressão arterial e que ao sofrerem ação direta de certas substâncias podem levar a alterações dos parâmetros de PAM e FC. Para tal, foram utilizados segmentos de artéria mesentérica superior, vaso de resistência responsável pela irrigação sanguínea de parte do pâncreas, parte do intestino delgado e grosso, e foram utilizados também o átrio direito e esquerdo, sendo no átrio direito onde se insere o nodo sinusal, responsável em primeira instância pela frequência cardíaca. 4.4.1 Preparações de músculo liso e cardíaco Os ratos Wistar foram anestesiados via i.p. com tribromoetanol (250 mg/kg) e, sem seguida, sacrificados por exsanguinação. A artéria mesentérica superior e os átrios direito e esquerdo foram rapidamente removidos do animal e imersos em placa de Petri contendo solução de fisiológica modificada de Krebs-Henseleit sob oxigenação para remoção de gordura e tecido conjuntivo aderido. Esse processo para ambos os átrios foi realizado a temperatura de 4 C com o objetivo de reduzir a atividade metabólica do tecido. A artéria mesentérica superior foi segmentada em pedaços de anéis de aproximadamente 2 mm e por dentro do lúmen da cada anel foram passadas duas peças triangulares de aço inoxidável (0,3 mm de diâmetro), ficando uma conectada a uma haste fixa dentro da cuba para órgãos isolados e a outra peça conectada através de uma linha ao transdutor de força (figura 5B). Diferentemente dos segmentos de artéria mesentérica que foram posicionados de forma circular, as preparações atriais foram posicionadas de forma longitudinal. Em cada extremidade atrial foram fixadas linhas, sendo a linha de uma extremidade conectada a haste fixa dentro da cuba e a linha da outra extremidade conectada ao transdutor de força. Para as preparações atriais submetidas a estimulação elétrica, a haste que sustenta os tecidos tem características especiais, sendo dotada de duas regiões circulares que criam um campo elétrico para permitir a estimulação elétrica. Dessa forma, os tecidos submetidos a estimulação ficaram posicionados entre as duas regiões circulares da haste. Cada tecido foi então montado dentro de uma cuba de 5 ml contendo solução fisiológica modificada de Krebs-Henseleit, a 37 C, constantemente aerada com mistura de 5 % CO 2 em O 2 e com ph de 7,4. As preparações foram suspensas por um transdutor

34 de força (ML870B60/C-V, ADInstruments), o qual foi conectado a um sistema de aquisição de dados ( Powerlab 8/30, ADInstruments), e alterações na tensão muscular foram medidas isometricamente, sendo expressas em g (figura 5A). A tensão basal aplicada as preparações, tanto artéria quanto átrio, foi de 0,5 g, sendo ao átrio direito permitido seu batimento rítmico espontâneo e ao átrio esquerdo sua estimulação artificial através de um estimulador LE 12406 (Panlab, Spain) com parâmetros de estimulação de 5 Hz, 0,5 ms e 5 V. Antes do inicio de qualquer experimento, os tecidos passaram por um período de estabilização de 1 hora, com ajuste de tensão e troca de solução nutridora a cada 15 minutos. As preparações de artéria mesentérica, após o período de estabilização, foram expostas a soluções despolarizantes de 60 mm de KCl até que fossem obtidas duas contrações de mesma amplitude, configurando assim a viabilidade da preparação. 4.4.2 Protocolos experimentais As preparações de artéria mesentérica, com ou sem endotélio, foram précontraidas com fenilefrina (1μM) e concentrações cumulativas de β-citronelol (1 1000 μm, com intervalo de 10 minutos entre cada concentração, n = 6) foram aplicadas na fase sustentada da pré-contração. Em relação as preparações atriais, uma curva concentração-efeito ao β-citronelol (0,1 1000 μm) foi construída para estabelecer seu efeito no comportamento cardíaco inotrópico (átrio esquerdo, n = 6) e cronotrópico (átrio direito, n = 6). A mesma curva foi produzida também na presença de atropina (1 ou 10 μm) para avaliar a participação do componente muscarínico e curvas de concentração-efeito ao isoproterenol (0,01 nm 100 nm, n = 6) foram construídas na presença ou na ausência de 200 μm de β- citronelol para caracterizar a participação do componente adrenérgico em seu efeito cardíaco. Por fim, com o objetivo de estudar a dependência da concentração extracelular de cálcio no efeito produzido pelo β-citronelol, curvas de concentração-efeito ao cálcio (CaCl 2; 3, 4 e 5 mm) (SOARES et al., 2005; WANG et al., 2004) foram produzidas na ausência ou presença de 200 μm de β-citronelol (n = 6).

35 Figura 5 Modelo esquemático do sistema de contratilidade para órgãos isolados A B Fonte: Imagens cedidas e criadas no próprio laboratório no qual foram realizados os experimentos pelo aluno de doutorado Francisco José Batista de Lima Júnior. Em A, figura representativa do sistema de contratilidade. Os equipamentos que compõem o sistema foram numerados da seguinte forma: 1, transdutor de força; 2, cilindro de mistura carbogênica; 3, sistema de aquisição de dados; 4, computador com software instalado; 5, visão da cuba para órgãos isolados e sua interação com os outros equipamentos;.6, visão geral das cubas para órgãos isolados em seus devidos suportes; 7, bomba de circulação térmica. Em B, imagem representativa e ampliada da cuba para órgãos isolados mostrando em 1, a recirculação de água para manutenção da temperatura ideal, em 2 linha que conecta a peça de aço (6) com o transdutor de força (3), em 4 o sistema para aeração da solução da cuba e em 5 o sistema para descarte da solução utilizada na cuba. Ao lado da cuba, demonstra-se a forma correta de acoplar as peças de aço ao tecido circular.

36 4.5 Análise estatística dos dados Para os dados in vivo, os resultados foram expressos como média ± EPM e n representou o número de experimentos. Alterações máximas na PAM e na FC foram expressas como o percentual de redução dos valores basais. Para os dados in vitro, observaram-se as respostas de deflexão positiva ou negativa dos traçados basais antes da adição de qualquer substância na preparação. Os valores de CI 50 foram calculados pela interpolação semi-logaritmica. A significância dos resultados (p < 0,05) foi realizada pelo teste t de Student pareado ou não-pareado, teste U de Mann-Whitney e pela análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias, seguido pelo teste de múltipla comparação de Holm-Sidak, quando apropriado. Todas as análises estatísticas foram feitas usando o programa SigmaStat (Systat Software Inc., Estados Unidos).

37 5 RESULTADOS 5.1 O β-citronelol induz resposta hipotensora e bradicardizante bifásicas em ratos acordados Os efeitos cardiovasculares do β-citronelol foram primeiramente caracterizados através de uma curva dose-resposta (1 20 mg/kg) avaliando-se os parâmetros de PAM e FC em animais acordados e normotensos. Os valores médios basais de PAM e frequência cardíaca foram 111,7 ± 6,9 mmhg e 450,98 ± 18,1 batimentos por minuto (bpm), respectivamente ( dados agrupados de 10 ratos). Os traçados típicos de pressão arterial e da frequência cardíaca derivada do ECG resultantes da administração intravenosa das doses de 1, 5, 10 e 20 mg/kg de β-citronelol estão representados na figura 6. A dose de 1 mg/kg de β-citronelol provocou uma resposta hipotensora monofásica com redução de 20,2 ± 4,5 % da PAM basal (p < 0,05; teste t de Student pareado) (Figura 6A), já as doses subsequentes produziram um comportamento pressórico caracteristicamente diferente: observou-se uma queda imediata na PAM, sendo denominada no presente trabalho como Fase 1 (F1), seguida por uma breve tentativa de recuperação da pressão arterial para níveis basais com uma sequencial hipotensão mais lenta e duradoura, denominada aqui como Fase 2 (F2). A redução da PAM da F1 foi de 49,9 ± 3,8 %, 55,3 ± 5,4 % e 67,4 ± 3,2 %, respectivamente, para as doses de 5, 10 e 20 mg/kg. Quando comparadas entre si a diferença de efeito entre as doses foi estatisticamente significante apenas para a dose de 5 mg/kg em relação a de 20 mg/kg ( p < 0,05, ANOVA de uma via). Já a redução da PAM da F2 foi de 20,2 ± 4,5 %, 42,9 ± 5,4 %, 59,8 ± 4,1 % e 72,6 ± 1,0 %, respectivamente, para as doses de 1, 5, 10 e 20 mg/kg, demonstrando significativamente a dependência de dose na F2 ( p < 0,05, ANOVA de uma via), conforme pode-se observar na Figura 7A. Em relação ao parâmetro de frequência cardíaca (Figura 6B), o β-citronelol causou, de forma semelhante ao efeito na pressão arterial média, uma resposta de 2 fases: uma imediata bradicardia (F1), seguida de uma tentativa de resolução do efeito com posterior bradicardia mais duradoura (F2), sendo essas duas fases observadas apenas a partir da concentração de 5 mg/kg (Figura 6B). Assim como no efeito na PAM, diferenças na magnitude dos efeitos bradicardizantes de F1 foram observadas apenas entre a dose de 5 mg/kg (redução de 74,1 ± 4,5 %) e a dose de 20 mg/kg (redução de

38 89,3 ± 1,9) (p < 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak). A F2 da bradicardia foi dependente da dose com reduções significativas da FC basal de 4,6 ± 2,6 %, 40,7 ± 8,6 %, 74,6 ± 5,3 % e 85,3 ± 4,7 %, respectivamente para as doses de 1, 5, 10 e 20 mg/kg (Figura 7B).

39 Figura 6 Traçados típicos das variações de PA e FC em animais acordados submetidos a doses crescentes de β-citronelol A B Traçados típicos das variações de pressão arterial (A) e de frequência cardíaca (B) mostrando o efeito hipotensor e bradicardizante do β-citronelol em animais acordados. Cada traçado representa o efeito de uma dose de β-citronelol ( 1, 5, 10 ou 20 mg/kg) administrada por via intravenosa indicada pela seta pontilhada, sendo construído em uma curva dose-resposta ao β-citronelol com intervalo de 10 minutos entre as doses administradas. A área cinza escuro do traçado representa a F1 e a área cinza claro representa a F2. Percebe-se nos traçados que a F1 é gerada apenas a partir da dose de 5 mg/kg, sendo a dose de 1 mg/kg capaz de gerar apenas uma resposta monofásica de hipotensão sem bradicardia significativa.

40 Figura 7 Gráficos das reduções máximas da PAM e FC produzida pela administração i.v. de β-citronelol em animais acordados A Redução na PAM (%) 100 80 60 40 20 medias medias Col 49 medias Col 60 medias Col 71 * # F1 F2 B 0 1 5 10 Dose (mg/kg) 20 100 F1 F2 Redução na FC (%) 80 60 40 20 # * 0 1 5 10 Dose (mg/kg) 20 Redução máxima da PAM (A, n = 5) e da FC (B, n = 5) resultante da administração intravenosa de β-citronelol (1, 5, 10 e 20 mg/kg) em ratos acordados. A F1 é representada pelas colunas de cor preta, mostrando-se presente a partir da dose de 5 mg/kg ( #p < 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak), e a F2 é representada pelas colunas de cor cinza, sendo a redução da PAM significante a partir da dose de 1 mg/kg ( *p < 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm- Sidak) e a redução da FC significante a partir da dose de 5 mg/kg (*p < 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak). Os dados são representados como média ± EPM e expressos como percentual de redução dos valores basais.

41 5.2. O β-citronelol induz hipotensão, bradicardia e apneia de duas fases em ratos anestesiados A administração de β-citronelol por via i.v. (1, 5 e 10 mg/kg) em ratos anestesiados com uretana (0,8 g/kg) induziu os seguintes efeitos na PAM e FC: uma resposta monofásica hipotensora e bradicardizante na dose de 1 mg/kg e a presença de 2 fases de hipotensão e de bradicardia, nas doses subsequentes de 5 e 10 mg/kg, como se pode observar na figura 8. Os animais anestesiados com uretana apresentaram valores médios basais de pressão arterial e frequência cardíaca de 93,5 ± 5,7 mmhg e 388,1 ± 12,6 batimentos por minuto (bpm), respectivamente (dados agrupados de 10 ratos). Em relação a F1 da resposta hipotensora, o β-citronelol provocou reduções na PAM de 39,2 ± 1,9 % e 47,0 ± 2,5 %, respectivamente para as doses de 5 e 10 mg/kg, que foram significativamente diferentes entre si (p < 0,05, teste t de Student nãopareado). Já em relação a F2 de resposta, o β-citronelol provocou reduções na PAM de 17,7 ± 4,7 %, 40,7 ± 2,8 % e 56,3 ± 5,4 %, significativamente diferentes entre si, demonstrando caráter de resposta dependente de dose (Figura 9A). A redução da FC (F1) foi de 80,4 ± 2,2 % e 75,4 ± 2,8 %, respectivamente, para as de 5 e 10 mg/kg, não demonstrando efeito dependente de dose (p > 0,05,teste t de Student não-pareado). Em relação a F2, o β-citronelol provocou reduções na FC de 18,3 ± 8,1 %, 37,0 ± 5,6 % e 59,8 ± 4,4 %, nas doses de 1, 5 e 10 mg/kg, respectivamente (Figura 9B). Além dos efeitos cardiovasculares, as doses de 5 e 10 mg/kg de β-citronelol provocaram alterações na FR. A dose de 5 mg/kg causou uma apneia que cursou com a F1 de hipotensão e bradicardia, já a dose de 10 mg/kg levou a uma apneia em duas fases, a primeira delas durante a F1 e a segunda durante a F2 de hipotensão e bradicardia, como se pode observar na Figura 8C. O curso temporal dessas respostas respiratórias foi avaliado através da dose de 10 mg/kg, como pode se observar na próxima seção.

42 Figura 8 - Traçados típicos das variações de PA, FC e VR em animais anestesiados submetidos a doses crescentes de β-citronelol A B C Figura 8. Traçados típicos das variações de pressão arterial (A), frequência cardíaca (B) e volume respiratório (C) mostrando a hipotensão, bradicardia e apneia (doses de 5 e 10 mg/kg) produzida pelo Β-citronelol em animais anestesiados com uretana. Cada traçado representa o efeito de uma dose de β-citronelol (1, 5 e 10 mg/kg) administrada por via intravenosa, sendo o intervalo de doses de 10 minutos. A área cinza escuro de cada traçado representa a fase 1 e a área cinza claro representa a fase 2. Pode-se observar nos traçados (A) de pressão arterial que a fase 1 de resposta de hipotensora está presente apenas a partir da dose de 5 mg/kg, sendo o mesmo válido para os traçados de frequência cardíaca (B). A apneia em duas fases é induzida apenas pela dose de 10 mg/kg. De forma diferente dos animais acordados, a dose de 1 mg/kg gera uma resposta monofásica hipotensora de F2 estatisticamente significante.

43 Figura 9 Gráficos das reduções máximas da PAM e FC produzida pela administração i.v. de β-citronelol em animais anestesiados A Redução na PAM(%) 100 80 60 40 20 * # F1 F2 0 1 5 10 Dose (mg/kg) B Redução na FC (%) 100 80 60 40 20 * # F1 F2 0 1 5 10 Dose (mg/kg) Redução máxima da PAM (A, n = 6) e da FC (B, n = 6) resultante da administração intravenosa de β-citronelol (1, 5 e 10 mg/kg) em ratos anestesiados com uretana. A F1 é representada pelas colunas de cor preta, mostrando-se presente a partir da dose de 5 mg/kg ( #p < 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak), e a F2 é representada pelas colunas de cor cinza, com redução significativa a partir da dose de 1 mg/kg ( *p < 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak). Os dados são representados como média ± EPM e expressos como percentual de redução dos valores basais.

44 5.3 O β-citronelol induz efeitos temporalmente comparáveis a respostas reflexas O comportamento temporal do efeito hipotensor, bradicardizante e respiratório induzido pelo β-citronelol foi caracterizado utilizando-se a dose de 10 mg/kg (n = 8, Figura 10). É importante notar que quando duas doses sequenciais de 10 mg/kg de β- citronelol foram injetadas em um mesmo animal, respeitando o intervalo de dose de 10 minutos, não houve diferença estatística na magnitude da hipotensão e da bradicardia em ambas as fases (1 ou 2), como pode-se observar no Apêndice 1. A imediata redução na FC produzida pelo β-citronelol ocorreu 1,6 ± 0,1 s após sua administração intravenosa. Paralelamente a esse evento (1,9 ± 0,1 s,p > 0,05, teste t de Student não-pareado),ou seja, com o mesmo tempo de latência, o β-citronelol induziu apneia. O evento seguinte observado foi a redução na PAM, 2,1 ± 0,1 s após a injeção de β-citronelol. Esses eventos cardiovasculares e respiratórios de início imediato que precederam uma resposta mais lenta e duradoura são os já denominados eventos de fase 1 (F1). A segunda fase de eventos (F2) teve pico de efeito mais tardio, 7,5 ± 0,2 s e 5,2 ± 0,5 s após administração de β-citronelol, respectivamente, para a resposta hipotensora e bradicardizante e 4,7 ± 0,2 s para a resposta apnéica. O tempo de duração, ou seja, de resolução dos efeitos cardiovasculares e respiratórios da F2 foi diferente para cada parâmetro. A apneia foi o primeiro efeito induzido pelo β-citronelol a se resolver, em 7,5 ± 0,4 s após sua administração, seguida pela resolução da resposta bradicardizante 40,5 ± 2,9 s e por fim, pelo retorno da PAM aos seus níveis basais, com duração de 1,8 ± 0,3 min (Figura 10).

45 Figura 10 Curso temporal das alterações cardiorrespiratórias induzidas pela administração i.v. de 10 mg/kg de β-citronelol em animais anestesiados Traçados típicos das alterações de PAM, FC e FR induzidas pela administração intravenosa de 10 mg/kg de β-citronelol, mostrando temporalmente seus efeitos bifásicos. Os tempos são expressos como média ± EPM na unidade de tempo de segundos (s) ou minutos (min). O primeiro intervalo de tempo foi calculado no momento da injeção de β-citronelol (indicado pela seta) até o pico da alteração do parâmetro, o segundo foi calculado do momento da injeção de β- citronelol até o pico da alteração de F2 e o terceiro tempo calculado do momento da administração até o completo retorno às condições basais. A pressão arterial (PA) foi expressa em mmhg, a frequência cardíaca (FC) em bpm (batimentos por minuto) e o volume respiratório (VR) foi expresso em ml/s.

46 5.4 Os efeitos imediatos de fase 1 induzidos pelo β-citronelol dependem das fibras vagais e de mecanismo colinérgico A administração intravenosa de 10 mg/kg de β-citronelol em animais submetidos a vagotomia bilateral em nível cervical foi incapaz de induzir a resposta hipotensora e bradicardizante característica da F1, demonstrando apenas um comportamento monofásico. De forma semelhante, o tratamento perineural do vago em nível cervical com solução de capsaicina (250 μg/ml) e o tratamento i.v. com 1 mg/kg de metilatropina aboliu a F1 de hipotensão e bradicardia evocada pelo β-citronelol (Figura 11). Em relação a F2, como mostrado na figura 12D, a bivagotomia, o tratamento perineural ou o tratamento com metilatropina reduziram de forma significante a bradicardia provocada pelo β-citronelol para valores de 18,8 ± 3,2 % (*p < 0,05, test t de Student pareado), 13,9 ± 2,0 % (#p < 0,05, test t de Student pareado) e 7,1 ± 1,5 % ( p < 0,05, test t de Student pareado), respectivamente. Ao contrário da interferência dos tratamentos mencionados acima na redução da frequência cardíaca induzida pelo β-citronelol, os mesmos não tiveram a capacidade de alterar a F2 da resposta hipotensora. Como se pode observar na Figura 12B, a bivagotomia, o tratamento perineural ou o tratamento com metilatropina não foram capazes de alterar significantemente a resposta hipotensora produzida pelo β-citronelol ( p > 0,05, ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak). Convém notar que a bivagotomia ou o tratamento perineural com capsaicina não alteraram de forma significativa os níveis de PAM ou FC basais, já o tratamento com metilatropina elevou os níveis basais da FC (Apêndice 2). Em relação as alterações respiratórias causadas pelo β-citronelol, o procedimento de bivagotomia aboliu a resposta apneica de F1, restando apenas a F2. Da mesma forma, o tratamento perineural com capsaicina aboliu apenas a F1 de apneia (Figura 13).

47 Figura 11 Traçados típicos dos efeitos do β-citronelol em animais bivagotomizados ou submetidos a tratamento perineural com capsaicina A B Traçados típicos mostrando o efeito da bivagotomia (BV) e do tratamento perineural com capsaicina (TP) no efeito hipotensor e bradicardizante induzido pela dose de 10 mg/kg de β-citronelol. Todos os tratamentos foram capazes de abolir a resposta de F1, gerando uma queda monofásica da PAM e FC. O retângulo mais escuro representa a F1 e o retângulo mais claro representa a F2.

48 Figura 12 Gráficos das reduções máximas da PAM e FC de fase 1 ou fase 2 produzida pelo β-citronelol em animais bigavotomizados, após tratamento perineural com capsaicina ou após tratamento com metilatropina. A FASE 1 100 Redução da PAM (%) 80 60 40 20 0 BV TP Antes do tratamento Após o tratamento MA B FASE 2 Redução da MAP (%) 100 80 60 40 20 0 BV TP Antes do tratamento Após o tratamento MA

49 C FASE 1 100 Antes do tratamento Após o tratamento Redução da FC (%) 80 60 40 20 0 BV TP MA D FASE 2 Redução da FC (%) 100 80 60 40 20 0 BV * # TP Antes do tratamento Após o tratamento MA Reduções máximas da PAM (A e B) e FC (C e D) de Fase 1 ou 2 produzidas pela injeção intravenosa de β-citronelol (10 mg/kg) na ausência (antes do tratamento; colunas brancas) ou após os tratamentos (bivagotomia, BV; tratamento perineural com capsaicina, TP ou metilatropina, MA). Os tratamentos aboliram a F1 de PAM e FC (A e C), porém não alteraram a F2 de hipotensão (p > 0,05, teste t de Student pareado). Para a FC, os tratamentos reduziram significativamente a bradicardia gerada pelo β-citronelol (*p < 0.05; #p < 0.05; p < 0.05, teste t de Student pareado).

50 Figura 13 Traçados típicos do efeito do β-citronelol no volume respiratório de animais anestesiados Traçados típicos dos volumes respiratórios (em ml/s) em animais anestesiados, mostrando a reposta bifásica de apneia (F1 e F2) provocada pelo β-citronelol. Controle representa o efeito do β-citronelol na frequência respiratória sem qualquer tratamento ou procedimento cirúrgico em duas diferentes doses (5 mg/kg, i.v. e 10 mg/kg, i.v.). Os outros traçados típicos representam o efeito do β-citronelol após bivagotomia (BV), tratamento perineural com capsaicina (TP), tratamento com suramina (SUR, animais anestesiados com pentobarbital), ou com a administração de 5 mg/kg de β-citronelol diretamente no ventrículo esquerdo (IVT). As setas pontilhadas indicam o momento da administração de β-citronelol.

51 5.5 Os efeitos elicitados pelo β-citronelol não são originados pela ativação de receptores classicamente conhecidos O tratamento prévio dos animais através da administração intravenosa de capsazepina, ondansetrona, suramina ou HC-030031 não afetou nenhuma das fases (F1 ou F2) da resposta hipotensora ou bradicardizante induzidas pela dose de 10 mg/kg de β-citronelol, como pode-se observar na tabela 1. A F1 de apneia, de forma semelhante, também não foi alterada por nenhum dos tratamentos. Entretanto, o tratamento com suramina foi capaz de abolir a segunda fase de apneia (Figura 13). A capacidade das substâncias mencionadas acima em antagonizar os receptores TRPV1, 5HT 2, P2X, foi testada utilizando-se, respectivamente, os agonistas capsaicina (1 μg/kg, n = 3), serotonina (10 μg/kg, n = 4) e α,β-metilenoadenosina 5 -trifosfato (100 μg/kg, n = 4). O tratamento prévio com capsazepina, ondansetrona, suramina foi capaz de abolir a resposta de F1 induzida, respectivamente, pelos agonistas anteriormente mencionados. Tabela 1 Efeito do tratamento com antagonistas de receptores TRPV1, 5-HT 3, P2X e TRPA1 nas respostas cardiorespiratórias induzidas pelo β-citronelol ΔPAM (%) ΔFC (%) β-citronelol (10 mg/kg) F1 F2 F1 F2 Antes da Capsazepina -47,7 ± 4,0-50,1 ± 2,7-76,4 ± 2,2-43,4 ± 8,6 Após a Capsazepina -43,8 ± 5,8-61,9 ± 3,2-75,6 ± 3,5-56,0 ± 3,4 Antes da Ondansetrona -50,3 ± 1,8-65,3 ± 5,4-64,7 ± 5,4-58,3 ± 2,8 Após a Ondansetrona -43,9 ± 8,8-70,1 ± 5,4-73,3 ± 4,8-60,9 ± 4,4 Antes da Suramina -45,2 ± 2,4-55,1 ± 1,0-77,5 ± 4,0-55,6 ± 5,1 Após a Suramina -41,6 ± 0,7-57,0 ± 1,7-75,6 ± 2,1-47,0 ± 2,3 Antes do HC-030031-42,2 ± 4,5-53,6 ± 1,6-74,3 ± 1,7-53,9 ± 2,3 Após o HC-030031-35,4 ± 4,6-52,2 ± 3,0-78,7 ± 2,0-58,5 ± 8,4 Reduções máximas na PAM e FC induzidas por injeções intravenosas de 10 mg/kg de β- citronelol na ausência (antes) e na presença (após) de tratamentos com capsazepina (n = 4), ondansetrona (n = 5), suramina (n = 5) e HC-030031 (n = 5). As colunas F1 representam as respostas de fase 1 e as colunas de F2, as de fase 2. Os quatro tratamentos realizados não interferiram nas respostas de F1 ou F2 induzidas pelo β-citronelol ( p > 0,05, teste t de Student pareado).

52 5.6 A administração intraventricular do β-citronelol indica que o reflexo vagovagal é originado nos pulmões A administração pela via intraventricular, diretamente no ventrículo esquerdo, da dose de 5 mg/kg de β-citronelol produziu um efeito hipotensor e bradicardizante monofásico, sendo a mesma incapaz de gerar uma resposta imediata de F1, como pode se observar na Figura 14. Comparativamente, a mesma dose de 5 mg/kg de β-citronelol, injetada por via intravenosa, foi capaz de induzir uma resposta bifásica de hipotensão e bradicardia. Em relação a F2, como apresentado na figura 15, o β-citronelol administrado por via intraventricular induziu uma resposta hipotensora de magnitude semelhante (redução de 47,3 ± 4,2% na PAM basal, p > 0,05, teste t de Student não-pareado) à resposta hipotensora induzida pela administração pela via intravenosa. Por outro lado, a redução na FC provocada pela injeção intraventricular de β-citronelol foi menor (14,8 ± 1,9%) em comparação com a administração por via intravenosa (36,9 ± 5,6%, p < 0,05, teste t de Student não-pareado). O tempo de latência para se alcançar o pico da hipotensão foi de 7,6 ± 1,0 s quando o β-citronelol foi injetado por via intraventricular, valor não significativamente diferente (p > 0,05, teste t de Student pareado) de 7,2 ± 1,1 s observado quando administrado por via i.v. Por outro lado, a latência para o pico da resposta bradicardizante foi 2,3 ± 0,2 s, latência menor (p < 0,05, teste t de Student pareado) do que a observada pela administração i.v. do β-citronelol (5,6 ± 0,4 s). Diferentemente do efeito induzido pela administração intravenosa, a injeção de β-citronelol (5 mg/kg) dentro do ventrículo esquerdo não foi capaz de provocar nenhum das fases da apneia, F1 ou F2, como pode-se observar na figura 13. A dose de 10 mg/kg de β-citronelol também foi administrada diretamente no ventrículo esquerdo (n = 3), porém todos os animais sofreram hipotensão severa e morreram.

53 Figura 14 Traçados típicos comparativos da administração de β-citronelol pela via intravenosa e pela via intraventricular A B Traçados típicos da pressão arterial (PA, em mmhg) e frequência cardíaca (FC, em bpm) mostrando o efeito comparativo da administração da dose de 5 mg/kg de β-citronelol pela via intravenosa (traçados da coluna esquerda) e pela via intraventricular ( traçados da coluna direita). A administração por via intravenosa produz um efeito bifásico,tanto na PA quanto na FC, representado pelo plano de fundo cinza escuro (F1) e pelo plano de fundo cinza claro (F2). Já a administração da mesma dose de β-citronelol foi incapaz de produzir tal comportamento bifásico.

54 Figura 15 Gráficos comparativos dos efeitos do β-citronelol pela via intravenosa e pela via intraventricular A Redução na PAM (%) 100 80 60 40 20 0 Controle Intraventricular -Citronelol (5 mg/kg) B 100 Redução na FC (%) 80 60 40 20 0 * Controle Intraventricular -Citronelol (5 mg/kg) Em A, reduções máximas na PAM (F2) induzidas pela dose de 5 mg/kg de β-citronelol por via intravenosa (controle) ou pela via intraventricular, demonstrando que não há diferença estatística na F2 de hipotensão entre as duas vias de administração (p > 0,05, teste t de Student pareado). Em B, reduções máximas na FC (F2) demonstrando que a bradicardia é reduzida quando o β-citronelol é administrado pela via intravenosa (*p < 0,05, teste t de Student pareado).

55 5.7 No coração, o β-citronelol induz efeito cronotrópico e inotrópico negativo. Adições cumulativas de β-citronelol nas cubas de órgãos isolados (0,1 1000 μm) produziram redução na frequência de batimentos do átrio direito e redução na amplitude de contração do átrio esquerdo, com efeitos reversíveis, como se pode observar na Figura 16. O efeito cronotrópico negativo no átrio direito foi significante a partir da concentração de 100 μm ( p < 0,05; ANOVA de uma via, seguido pelo teste de Holm-Sidak) e a redução máxima na frequência dos batimentos foi de 45,3 ± 18,8% na maior concentração utilizada (1000 μm). Em relação ao átrio esquerdo, o β-citronelol reduziu significantemente a amplitude de contrações a partir da concentração de 1 μm (10,7 ± 1,9 %; p < 0,05; ANOVA de uma via) e a redução máxima de amplitude foi de 44,6 ± 5,7 % na maior dose utilizada (1000 μm), como se pode observar no gráfico da figura 17B. Esses efeitos cronotrópicos e inotrópicos negativos produzidos pelo β- citronelol não foram modificados quando adicionou-se atropina previamente nas cubas, na concentração de 1 ou 10 μm (p > 0,05; ANOVA de duas vias). A estimulação β-adrenérgica através da adição cumulativa de isoproterenol nas cubas (0,01 100 nm) produziu aumento na frequência de batimentos (Emax de 81,1 ± 12,9%) no átrio direito e aumento na amplitude de contração do átrio esquerdo (Emax de 113,8 ± 16,5%). Como se pode observar nos gráficos A e B da figura 18, esses efeitos induzidos pelo isoproterenol nos átrios não foram alterados em presença de 200 μm de β-citronelol (p > 0,05; ANOVA de duas vias). A elevação na concentração extracelular de Ca 2+ através de adições cumulativas de CaCl 2 (3, 4 e 5 mm) provocou um aumento na amplitude de contrações do átrio esquerdo com efeito máximo de 49,3 ± 5,8%. A adição prévia de β-citronelol (200 μm ou 600 μm) não foi capaz de alterar o efeito produzido por esse aumento de Ca 2+ extracelular (p > 0,05; ANOVA de uma via, figura 19).

56 Figura 16 Traçado típico do efeito do β-citronelol em átrio isolado Traçado típico representando a curva concentração-efeito do β-citronelol (10 1000 μm) e seu efeito sobre a contratilidade do átrio direito isolado. As setas verticais representam a adição de cada concentração de β-citronelol e cada segmento de traçado foi colhido nos cinco segundos anteriores a próxima concentração de β-citronelol. O intervalo de tempo entre as concentração foi de cinco minutos, tempo suficiente para a completa estabilização da frequência e amplitude de contrações.