UTILIZAÇÃO DO BAGAÇO DO SISAL (AGAVE SISALANA) PARA PRODUÇÃO DE LICOR ATRAVÉS DE HIDROLISE ENZIMÁTICA.

UTILIZAÇÃO DO BAGAÇO DO SISAL (AGAVE SISALANA) PARA PRODUÇÃO DE LICOR ATRAVÉS DE HIDROLISE ENZIMÁTICA. D. S. Figueiroa (1), S. S. Oliveira (1), R. P. Veloso, G. F. Franklin (1), L. S. C. Oliveira (1) Unidade Acadêmica de Engenharia Química Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) Campina Grande-PB (1) E-mail: deividfigueiroa@gmail.com RESUMO Nos últimos anos tem-se intensificado as pesquisas com os resíduos lignocelulósicos, como bagaço de cana de açúcar, na produção de etanol de segunda geração, pois esses materiais, são fontes abundantes de carboidratos, têm um grande potencial de bioconversão, baixo valor agregado e são normalmente, desperdiçados. Neste trabalho pretendeu-se produzir por hidrolise enzimática licor glicosídico do bagaço do sisal (Agave sisalana) previamente tratado, visando avaliar seu potencial na conversão de celulose em glicose. Com os resultados obtidos encontrou-se a melhor condição de conversão 27,7438 g/l de glicose, após 36 horas. Conclui-se assim, que a metodologia proposta obteve resultados significativos no que diz respeito a solubilização da hemicelulose e na remoção da lignina seguindo os pré-tratamento ácido e básico, respectivamente, o que influenciou nos bons resultados de conversão de celulose em glicose, a partir da hidrólise enzimática. glicose. Palavras-chave: sisal (Agave sisalana), hidrólise enzimática, produção de 1960

INTRODUÇÃO O melhoramento da qualidade de vida e o crescimento populacional, tem gerado uma dependência cada vez maior por energia. No entanto tem-se percebido nos últimos anos uma mudança climática drástica e a diminuição das fontes de combustíveis fósseis. É nesse contexto que se têm intensificado Pesquisa e Desenvolvimento de fontes energéticas alternativas, utilizando matérias-primas renováveis, em particular os abundantes resíduos agrícolas e agro-industriais, denominados de biomassas residuais (1). Além das biomassas residuais existem biomassas vegetais que a eles não são dadas as devidas importâncias por não se extrair ou retirar dos mesmos, materiais que possam ter uso industrial que gerem alto valor agregado. Nesse contexto no Brasil, podemos citar como exemplo dessa biomassa, o sisal ou (agave sisalana). O sisal é uma planta trazida do México que se adaptou no clima semi-árido. Seu valor comercial está limitado ao beneficiamento da sua fibra, pois esta é utilizada na fabricação de vassouras, tapetes, bolsas, e outros produtos. Para a extração dessa fibra a planta passa por uma etapa chamada de desfibramento em que se remove a parte verde da folha, restando apenas a fibra, onde temos que 4% são aproveitadas na forma de fibra, 16% são resíduos sólidos e 80% são resíduos líquidos (2). Este resíduo sólido, o bagaço, é constituído também de materiais lignocelulósicos que acabam se perdendo no processo de desfibramento e que muitas vezes são descartados. O bagaço de sisal é constituído por celulose, hemicelulose e lignina, na proporção aproximada de 30 a 40 % de celulose (fração mássica em base seca), 25 a 40 % de hemicelulose, 22 a 30 % de lignina e traços de minerais, cera e outros compostos (3). O sisal (Agave sisalana) pode ser uma matéria-prima ideal para produção de etanol de segunda geração, tanto a fibra quanto o bagaço, por serem esses materiais de custo relativamente baixo, a biomassa vegetal ser disponível no Brasil, por não ser usado como fonte de alimento e ao mesmo tempo, ser uma fonte de celulose. Segundo Santos (2012) (4), a biomassa lignocelulósica contém cerca de 20% a 60% de celulose. A celulose é um polissacarídio constituído de monômeros de glicose ligados entre si e pode ser totalmente convertida a glicose por um processo de hidrolise enzimática, após a etapa do pré-tratamento para desorganização da 1961

matriz lignina-carboidrato que protege a celulose. A glicose é a molécula que participa do processo de conversão da biomassa lignocelulósica em açucares fermentáveis. No entanto, ainda se encontra entraves para produção industrial do etanol de segunda geração o que se faz necessária a realização de inúmeras pesquisas biotecnológicas, Sticklen (2008) (5) ; Rubin (2008) (6) ; Lynd et al. (2008) (7), citado por Lima (2009) (1), abrangendo os três principais pilares da produção do etanol celulósico: a produção de biomassa viável, o desenvolvimento de degradadores de parede celular e a otimização da fermentação dos açúcares formados. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi produzir licor do bagaço do sisal (Agave sisalana) por hidrolise enzimática visando avaliar seu potencial na conversão de celulose em glicose. MATERIAIS E MÉTODOS Matéria-prima: O bagaço do sisal, utilizado no presente trabalho, foi fornecido pela fazenda Montevidéu da Zona Rural do município de Nova Floresta- PB. Esta biomassa foi inicialmente lavada e seca à temperatura 65 o C em estufa. A cada 8 horas as amostras foram pesadas até que a massa permanecesse constante, em seguida foram moídas em moinho de facas. Caracterização do bagaço do sisal: umidade, cinzas, celulose, hemicelulose e lignina: A caracterização do bagaço do sisal: umidade, cinzas, celulose, hemicelulose e lignina, foram realizadas no presente trabalho utilizando a metodologia usada para análise de matérias lignocelulósicos baseada nas normas TAPPI citadas no Documento 236 da Embrapa por Morais et al. (2010) (8). Pré-tratamentos: No presente trabalho foi realizado um pré-tratamento químico do bagaço do sisal, em um reator MAITEC forno INTI, com controle de pressão e temperatura. Pré-tratamento ácido: O pré-tratamento ácido foi realizado em reator pressurizado: pesou-se uma alíquota de 50g de bagaço de sisal e colocou-se no reator, e posteriormente adicionou-se 500 ml de uma solução H2SO4 1%, ajustouse a temperatura do reator para 120 ºC e manteve-a constante por uma hora para que ocorresse a reação, em seguida o material foi lavado com água destilada e 1962

filtrado a vácuo para separar o resíduo do licor rico em xilose, depois o material foi seco em estufa de circulação forçada a 60 C até atingir massa constante. Pré-tratamento alcalino: Para o pré-tratamento alcalino 50g do material, tratado anteriormente em meio ácido, foi transferido para o reator pressurizado em seguida adicionou-se 500 ml de solução NaOH 4%, a reação ocorreu a temperatura de 120 C mantendo-se o tempo constante de 1hora, em seguida o material foi filtrado e lavado com água destilada até o ph se igualar a ao da água de lavagem, depois secou-se o material em estufa de circulação forçada a 60 C até atingir massa constante. Determinação da atividade enzimática: A determinação da atividade enzimática baseou-se na metodologia proposta por Ghose (1987), que mediu a atividade celulolítica em termos de unidades de papel de filtro por mililitro da solução enzimática original. Hidrólise enzimática: A hidrólise enzimática do bagaço do sisal pré-tratado foi realizada com o auxílio de um planejamento fatorial 22 verificando-se a influência das variáveis de entrada: carga enzimática e porcentagem de massa seca de sisal e volume reacional. A hidrólise foi realizada em frascos Erlenmeyers de 250 ml contendo: o bagaço do sisal seco, extrato enzimático de celobiohidrolases (CBHs), endo-1,4- beta-glucanases (EGS) de nome comercial Celluclast 1.5L Novozyme, 8,21 FPU/mL) e 0,28g de beta-glicosidase (Powercell) e tampão de citrato de sódio nas condições do planejamento experimental e três gotas de solução de tetraciclina (10mg/mL em 70% de etanol) para prevenir o crescimento microbiano durante a hidrólise. Esta mistura foi mantida em uma incubadora shaker sob agitação de 150 rpm e temperatura de 50 C. Para cada experimento foram coletadas amostras em tempos pré-definidos para o estudo da cinética da hidrólise enzimática e assim obteve-se as melhores condições para a obtenção da máxima concentração de glicose. As Tabelas 1 e 2 contêm as variáveis de entradas na forma codificada e não codificada, bem como, a matriz do planejamento experimental. 1963

Tabela 1 - Níveis codificados e reais das variáveis independentes para o planejamento Variáveis -1 0 +1 Carga enzimática (FPU/g) 10 17,5 25 % da razão massa seca do bagaço do sisal/ volume total 2 3 4 Tabela 2 - Matriz de planejamento fatorial 2 ² Exp. Carga % da razão Massa Volume Volume Volume Tetraciclina enzimática massa seca/ volume de extrato de sisal de extrato total do tampão 1-1 -1 3,00 2,68 150,00 147,32 0,6 2 +1-1 3,00 6,69 150,00 143,31 0,6 3-1 +1 3,00 2,68 75,00 72,32 0,3 4 +1 +1 3,00 6,69 75,00 68,31 0,3 5 0 0 3,00 4,68 100,00 95,32 0,4 6 0 0 3,00 4,68 100,00 95,32 0,4 7 0 0 3,00 4,68 100,00 95,32 0,4 Determinação de pentoses e hexoses nos processos de hidrólises O teor de açúcar e aldeídos (HMF e Furfural) foram determinados através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) equipado com uma bomba modelo ProStar 210 (Varian); Injetor manual com loop de 20 µl; Detector de índice de refração modelo ProStar 356 (Varian) e UV/visivel 284nm (aldeidos); Coluna analítica de aço inox Hi-Plex H (300 mm x 7,7 mm; Varian), e as condições das operações foram as seguintes: Temperatura da coluna de 60 ºC; Fase móvel: água miliq com vazão de 0,6 ml/min; Tempo de análise: 60 minutos para teores de açúcares e aldeídos respectivamente Soluções padrões interno de açucares: glicose, xilose, arabinose e sacarose (Sigma 99,99% grau HPLC), congêneres 5- hidroximetilfurfural HMF (Aldrich 99,98%) e furfural (Vetec 99,9 UV/HPLC) foram utilizadas na quantificação dos componentes do licor. RESULTADOS E DISCUSSÕES Caracterização do material lignocelulósico 1964

Na Tabela 3 encontra-se a composição química para o bagaço do sisal in natura e pré-tratado. Tabela 3 Caracterização físico-química do bagaço in natura e pré-tratado Parâmetros analisados Bagaço sem pré-tratamento *Bagaço pré-tratado (%) (%) Umidade b.u 14,22 ± 0,48 5,47 ± 0,15 Umidade b.s 16,58 ± 0,05 5,78 ± 0,16 Cinzas 8,79 ± 0,23 7,45 ± 0,61 Extrativos 11,87 ± 0,32 8,62 ± 0,51 Lignina 12,04 ± 0,53 8,20 ± 0,27 Holocelulose 51,02 ± 0,42 71,07 ± 0,22 Alfa Celulose 29,68 ± 0,55 53,47 ± 0,13 Hemicelulose 21,34 ± 0,69 17,76 ± 0,10 *Bagaço de sisal submetida pré-tratamento ácido seguido de básico Por meio dos dados percebeu-se que houve uma redução nos teores de umidade, cinzas, extrativos, ligninas e hemicelulose após os pré-tratamentos, no entanto houve um aumento nos teores de holocelulose e alfa celulose. O aumento nos parâmetros citados se deve ao fato do bagaço ter passado pela etapa da de retirada de hemecelulose e lignina, devido aos pré-tratamentos químicos utilizados no presente trabalho. Os valores de cinzas encontrados nesse trabalho foram de 8,79 % e 7,45 para o material in natura e para o material pré-tratado respectivamente, no entanto esses valores são bastantes destoantes dos valores relatado por Banerjee e Pandey (2012) (9) que trabalhando com bagaço de cana encontraram 2 a 3 %. Os valores de extrativos foram de 11,87% e 8,62% para o material in natura e para o material pré-tratado respectivamente, valores esses similares aos encontrados em outros materiais lignocelulósicos como o bagaço de cana-de-açúcar 9,38 % (CANILHA et al. 2010) (10), cladódios da palma forrageira 7,9 % (PRADO, 2010) (11), palha de trigo 9,8 % (SILVA, 2011) (1). Para α-celulose, lignina e hemicelulose os valores encontrados neste trabalho foram de 29,68%, 12,04% e 21,34 %, após o pré-tratamento foi de 53,47%, 8,20% e 17,76 % um aumento de 55,50% para celulose e uma redução de 31,89 % para lignina e 16,78% para hemicelulose o que difere, principalmente no valor encontrado para lignina por Wanderley (2012) (12), este trabalhando com bagaço de cana para produção de etanol de 2ª geração obteve um aumento de 74,98% para 1965

celulose, uma diminuição de 13,4% de hemicelulose, enquanto que a lignina diminuiu 83,35 % em relação ao bagaço pré-tratado. Os resultados da caracterização físico-química mostram que o pré-tratamento com ácido seguido de básico tem a vantagem de remover uma parte da lignina, solubilizar a hemicelulose e concentrar a celulose. No caso da produção de etanol deseja-se teores menores para a lignina e hemicelulose, pois estes quanto mais elevados para estas matérias-primas, mais dificuldades são encontradas na reação de hidrólise, pois os mesmos dificultam a ação dos agentes hidrolíticos (ácido ou enzimas). Hidrólise enzimática Estequiometricamente para 1g de celulose seca pode-se obter teoricamente 1,11 g de glicose. A Tabela 4 apresenta a quantidade teórica máxima que se pode obter do bagaço de sisal pré-tratado nas condições de razão massa de bagaço de sisal/volume de extrato. Tabela 4 Concentração teórica de glicose para cada condição trabalhada. Concentração de Glicose Experimento Teórica (mg/l) 1 11870,34 2 11870,34 3 23740,68 4 23740,68 5 17805,51 6 17805,51 7 17805,51 A Tabela 5 apresenta os resultados da cinética para os rendimentos do processo realizado no planejamento fatorial 2 2. Tabela 5 Valores da concentração de glicose (mg.l -1 ) durante a hidrólise do bagaço de sisal no hidrolisado Experimentos Tempo (h) 1 2 3 4 5 6 7 36 10699,15 8266,82 13706,93 14506,74 12938,78 11817,34 14602,24 48 8593,57 9473,91 19280,15 17138,37 14654,94 13311,49 16713,49 60 7897,86 7758,16 18719,02 18734,96 14463,81 10600,64 15291,75 1966

A Figura 1 mostra o perfil da cinética da concentração de glicose obtidos nos experimentos para uma melhor visualização dos valores expostos na Tabela 5. Figura 1 - Cinética da glicose na hidrólise enzimática: Carga=10 FPU/g, Razão=2 % Carga=25 FPU/g, Razão=2 % Carga=10 FPU/g, Razão=4 % Carga=25 FPU/g, Razão=4 % Carga=17,5 FPU/g, Razão=3 % Carga=17,5 FPU/g, Razão=3 % Carga=17,5 FPU/g, Razão=3 %. Do comportamento da cinética da hidrólise mostrado na figura acima, observase que as maiores concentrações de glicose no hidrolisado ocorre, na maioria, no tempo de 48 horas. Durante o processo de hidrólise enzimática ocorreu também a formação da celobiose que é um dímero de glicose, produto da hidrólise incompleta da celulose. A Figura 2 apresenta a cinética da concentração de celebiose no hidrólisado. Figura 2 - Cinética da celobiose da hidrólise enzimática: Carga=10 FPU/g, Razão=2 % Carga=25 FPU/g, Razão=2 % Carga=10 FPU/g, Razão=4 % Carga=25 FPU/g, Razão=4 % Carga=17,5 FPU/g, Razão=3 % Carga=17,5 FPU/g, Razão=3 % Carga=17,5 FPU/g, Razão=3 % 1967

A presença da celobiose pode ser justificada provalvelmente pela quantidade insuficiente da enzima beta-glicosidase colocada na solução de hidrólise. Essa enzima tem a função quebrar a ligação da celobiose, ou seja, do dímero de glicose. Após análises dos resultados, observou-se que na condição de carga 10 FPU/g e percentual razão massa do bagaço de sisal/volume total igual à 4%, após 48h obteve-se a maior concentração de glicose 19280mg.L -1. No entanto, observa-se que haveria uma conversão mais elevada de celulose em glicose se a celobiose estivesse sido totalmente quebrada pela ação da beta-glicosidase. O diagrama de Pareto é apresentado na Figura 3. Pode-se afirmar que para a hidrólise o percentual da razão massa seca do bagaço do sisal/volume total (g/ml), influencia o processo aumentando a concentração de glicose. Os dados foram analisados em nível estatístico de 95% de confiança apresentando um coeficiente de determinação de 90,95 %. Percentual 5,35490 Carga by Percentual -,881866 Carga -,368093 p=,05 Figura 3 - Diagrama de Pareto para a hidrólise enzimática em 48h Na Tabela 6 está apresentado os valares da ANOVA das variáveis estudadas na presente pesquisa. Tabela 6 - Análise de variância (ANOVA) para o licor hidrolisado com 48 horas. Fonte de variação SQ GL MQ Teste F Regressão 86871,277 3 28957,09 1,1 1968

Resíduo 8644874 3 2881,62 Falta de ajuste 2772,844 0 Erro puro 5872030 4 Total 95516151 6 % R 2 90,949 Ftabelado = 9,28 Fcalculado =10,049 GL grau de liberdade; SQ - soma dos quadrados; MQ. média quadrática dos desvios ;Teste F - (Fcalculado / Ftabelado). A partir da razão entre o Fcalculado e o Ftabelado que foi igual a 1,1; pode-se dizer que o modelo proposto para a variável dependente é estatisticamente significativo, ao nível de 95% de confiança. Pois segundo Rodrigues e Iemma (2005) para valores de F maior que 1,00 o modelo estatístico é considerado significativo. O modelo estatístico codificado com as variáveis significativa é apresentado na Equação (A). Glicose(mg.L -1 ) = 14166,56 315,36.C + 4587,76.P 755,53 C.P (A) Sendo o modelo da resposta em estudo estatisticamente significativo, pode-se construir a superfície de resposta. A Figura 4 apresenta a superfície de resposta para a variável concentração de glicose do licor obtido da hidrólise enzimática do bagaço do sisal. Figura 4 - Superfície de resposta para produção de glicose por hidrólise enzimática no tempo de 48h Analisando os resultados obtidos percebe-se que para as condições estudadas a maior concentração de glicose do bagaço do sisal ocorreu para níveis mais altos 1969

da razão massa seca do bagaço de sisal/extrato enzimático e que a concentração da carga enzimática não influenciou de forma significativa, podendo assim, trabalhar com menores valores da carga enzimática, o que significa menor gasto com a enzima. Vale ressaltar que a condição teórica máxima de conversão de celulose em glicose não foi atingida porque há a necessidade de aumentar a concentração de enzima beta-glicosidases no extrato enzimático. CONCLUSÃO A partir dos resultados obtidos, pode-se verificar que o pré-tratamento ácido seguido de básico foi eficiente, pois ocorreu uma redução da lignina e hemicelulose, deixando, assim, a celulose livre, o que favorece o processo de hidrólise por expor as regiões cristalinas da mesma facilitando a ação enzimas para conversão em glicose. Na hidrólise enzimática, operando-se na menor carga enzimática (10) e na maior relação massa seca de bagaço/extrato (4%) obtive-se o melhor resultados da concentração de glicose (19280,15 mg.l - ¹). Os valores de conversão de celulose em glicose podem ser melhorados aumentando-se a concentração da enzima beta-glicosidase na hidrólise enzimática. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS LIMA, C. S. S. CONCEIÇÃO, M. M. SILVA, F. L. H. LIMA, E. E. CONRADO, L. S. LEÃO, D. A. S. Characterization of acid hydrolysis of sisal. Applied Energy 102, p. 254-259. 2013. ANDRADE, R. ORNELAS, J. BRANDÃO, W. Revista Bahia Agrícula, v.9, n.1, novembro de 2011. Disponível em http://www.seagri.ba.gov.br/sites/default/files/3_comunicacao01v9n1.pdf. Acesso em 22 de maio de 2015. SEABRA, J. E. A. Análise de opções tecnológicas para uso integral da biomassa no setor de cana-de-açúcar e suas implicações. Campinas: Universidade Estadual de Campinas,Faculdade de Engenharia Mecânica, 2008 (Tese de Doutorado). 1970

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USE OF SISAL BAGASSE (AGAVE SISALANA) FOR LIQUOR PRODUCTION BY ENZYMATIC HYDROLYSIS ABSTRACT In recent years has intensified the research on lignocellulosic waste such as sugar cane bagasse, used for the prodution of the second-generation ethanol, as these materials are abundant carbohydrate sources, great potential is developed for bioconversion, besides that, low added value and they are usually wasted. This work is intended to produce by enzymatic hydrolysis glycoside liquor sisal bagasse (Agave sisalana) previously treated, to evaluate its potential in the conversion of cellulose to glicose. With the results obtained, the best conversion condition is 27.7438 g / L glucose, after 36 hours. Therefore, is concluded that the proposed method has achieved significant results as regards the solubilization of the hemicellulose and lignin removal following the acidic and basic pretreatment, respectively, which influenced in good conversion of cellulose results in glucose, from enzymatic hydrolysis. Keywords: Sisal (Agave sisalana), enzymatic hydrolysis, glucose production. 1972