AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE BIOMASSAS NA PRODUÇÃO DE ETANOL LIGNOCELULÓSICO
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- Maria do Mar Macedo Madureira
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1 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE BIOMASSAS NA PRODUÇÃO DE ETANOL LIGNOCELULÓSICO T. F. PACHECO 1, T. D. MENDES 1, F. B. P. CARVALHO 1, D. S. RODRIGUES 1, C. M. M. MACHADO 1, M. AYRES 2 1 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Agroenergia 2 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Cerrados para contato: thalyta.pacheco@embrapa.br RESUMO A viabilidade da produção de etanol lignocelulósico depende da disponibilidade de matérias-primas com elevada produtividade e estrutura química susceptível a desconstrução, reduzindo o gasto de energia e reagentes no processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de produção de etanol a partir de Brachiaria brizantha, bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de sorgo sacarino e eucalipto. Para a avaliação, as biomassas foram submetidas à secagem, moagem, pré-tratamento com ácido diluído (1,5% v/v), pré-tratamento com hidróxido de sódio (4% p/v), hidrólise enzimática e fermentação. Primeiramente, o efeito da quantidade de reagentes, enzimas e tempo de reação para a desconstrução da biomassa, até a máxima conversão da celulose, foi determinado em biomassa modelo (B. brizantha). Os teores de celulose nas biomassas pré-tratadas foram: B. brizantha, 92%; bagaço de cana, 93%; bagaço de sorgo, 95% e eucalipto, 60%. Dentre as biomassas avaliadas, o bagaço de sorgo sacarino foi mais facilmente hidrolisado, atingindo 98% de conversão da celulose (97 g/l de glicose no hidrolisado) após 24 h de hidrólise. Nas mesmas condições, as conversões de celulose dos demais materiais foram: Brachiaria, 88%; bagaço de cana, 84% e para o eucalipto 32,5%. Não foram observados efeitos inibitórios durante a fermentação em nenhum dos materiais hidrolisados. A metodologia proposta permitiu avaliar o potencial das biomassas de estudo. 1. INTRODUÇÃO A produção de etanol no mundo é basicamente proveniente de fontes amiláceas e sacarinas, sendo o milho e a cana-de-açúcar, respectivamente, seus principais representantes. O primeiro respondeu por mais de 50 milhões de m³ nos Estados Unidos, enquanto o segundo por mais de 24 milhões de m³ no Brasil, totalizando 86% de todo etanol produzido em 2010 (U.S. Department of Energy). Porém, toda essa produção corresponde a apenas 17% do consumo dos Estados Unidos de gasolina em 2010 (U.S. Energy Information Admnistration). Para um aumento significativo da participação do etanol no mercado de combustíveis será necessário uma oferta de etanol que ou demandará novas tecnologias ou uma produção ainda mais extensiva dessas culturas, o que implicaria num uso maior de terras férteis (cada vez mais escassas) para a produção desse combustível. Uma das possíveis soluções para esse dilema poderá ser a adoção da tecnologia de produção de etanol de fontes lignocelulósicas (ex. florestas energéticas e resíduos agrícola-
2 florestais). Segundo estimativas de Ferreira-Leitão et al. (2010), a produção brasileira de etanol poderia ser mais que duplicada, sem o aumento da área plantada, utilizando-se resíduos da produção de cana-de-açúcar, milho e trigo. Isso representaria uma oferta de etanol equivalente a 95% do consumo brasileiro de combustíveis para veículos leves ao invés dos atuais 47%, considerando dados de produção e consumo de gasolina e etanol de 2010 (BEN 2011). Ou ainda, poderia ser incrementada dos atuais 80 L por tonelada de cana-de-açúcar para 116,5 L por tonelada de cana-de-açúcar através da produção de etanol lignocelulósico de 12% do bagaço e 50% da palha disponíveis (sem comprometer a cogeração de energia e a reposição de nutrientes do solo). Essa produção, aliada a preços competitivos do etanol, seria facilmente assimilada num mercado que, em 2010, 86% da frota de novos veículos leves vendidos eram bicombustíveis (Anuário Anfavea 2011). Já fora do Brasil, segundo um estudo de Mabee et al. (2011), o etanol de resíduos agrícolas e florestais poderia suprir 5,2% da demanda de combustíveis dos Estados Unidos em 2010 e 13,7% da demanda do Canadá em Porém para atingir valores mais significativos, ainda seria necessária a produção de uma matéria prima dedicada a este propósito. Com o objetivo de avaliar o potencial de produção de etanol lignocelulósico, as seguintes biomassas foram objetos de estudo deste trabalho: a forrageira B. brizantha, por ser um dos principais representantes das pastagens brasileiras, principalmente na região do cerrado brasileiro; o bagaço de cana-de-açúcar, por ser a matéria prima de mais fácil acesso e de menor custo às destilarias; o bagaço de sorgo sacarino, por ser o sorgo um possível substituto da cana-de-açúcar nos períodos de entressafra; e o eucalipto, por ser uma das principais culturas florestais brasileiras. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Material Para avaliação do potencial de diferentes biomassas na produção de etanol foram utilizadas quatro matérias-primas lignocelulósicas: a forrageira B. brizantha cv. Marandu (produzida em campos da Embrapa Cerrados), bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de sorgo sacarino BRS 506 (cedido pela Embrapa Milho e Sorgo) e Eucalipto benthamii (Embrapa Rondônia). Para hidrólise enzimática foi utilizado um complexo enzimático comercial Cellic CTec2, da Novozymes, e para fermentação alcoólica levedura comercial CAT-1 (cedida pela Usina Jalles Machado) Métodos Preparo da biomassa: Os materiais lignocelulósicos foram secos a 70 C por 48 horas e processados em moinho de facas com granulometria máxima de 2 mm. Pré-tratamento: O material seco e moído foi pré-tratado adicionando-se ácido sulfúrico 1,5% (v/v) à biomassa, numa razão sólido/líquido de 1/10. Esta suspensão foi mantida por 30 minutos em autoclave a 121º C. Este material foi filtrado e o sólido foi então lavado com água, utilizando-se o dobro do volume de ácido empregado no pré-tratamento. Ao sólido
3 lavado adicionou-se hidróxido de sódio 4% (m/v), numa razão sólido/líquido de 1/10. Esta suspensão foi autoclavada por 30 minutos a 121º C. Este material foi filtrado, e o sólido retirado deste pré-tratamento foi lavado com água a aproximadamente 100 C (utilizando um volume equivalente a 5 vezes o volume de hidróxido de sódio utilizado). Parte da fração sólida de ambas as etapas foi reservada para a determinação da umidade do material em estufa de secagem a 92 C e caracterização quanto ao teor de celulose. Hidrólise enzimática: Os materiais pré-tratados foram submetidos à hidrólise enzimática em tampão citrato de sódio/ácido cítrico 0,1 M e ph 5,0 numa razão sólido/líquido de 1/10. Para avaliação e determinação das condições ótimas de hidrólise enzimática foram utilizados, para a B. brizantha, 30, 60, 120 e 240 FPU do extrato enzimático comercial Cellic CTec2 (Novozymes) por grama de substrato seco. Avaliou-se também a hidrólise enzimática numa razão sólido/líquido de 1/7,5. As hidrólises foram conduzidas em shaker rotativo de bancada, a 50 C e 200 rpm por 72 horas. Para os demais materiais utilizou-se 30, 60 e 120 FPU do mesmo extrato enzimático por grama de substrato seco, numa razão sólido/líquido de 1/10. Foram retiradas amostras periodicamente para determinação da curva de produção de glicose, descontando-se a concentração de glicose presente na carga do extrato enzimático adicionada. Caracterização dos materiais: O material bruto e frações dos sólidos obtidos nos prétratamentos ácido e alcalino foram caracterizados segundo metodologia de hidrólise ácida adaptada de Gouveia et al. (2009), para determinação da concentração de açúcares e do teor de celulose exposta à hidrólise enzimática após cada um dos pré-tratamentos. Fermentação: Os materiais hidrolisados foram centrifugados e as frações líquidas fermentadas. De posse da análise da concentração de glicose presente no hidrolisado, adicionou-se glicose até que a concentração final do meio atingisse 100 g/l. Não foi feita suplementação de sais no meio. O meio foi inoculado com 25 g/l em base seca da levedura comercial CAT-1. As fermentações foram conduzidas, em shaker rotativo de bancada a 31 C e 100 rpm, até completo consumo da glicose presente no meio. Foram realizadas amostragens periódicas para determinação da curva de consumo de glicose e produção de etanol. O rendimento das fermentações foi calculado com base no rendimento teórico de uma fermentação alcoólica (0,511 g de etanol por g de glicose consumida). A produtividade, grandeza cinética que expressa a velocidade média de produção de etanol, foi definida como a razão da concentração de etanol obtida pelo tempo total de fermentação, expressa em g etanol /L.h. As amostras de caracterização da biomassa nas diferentes etapas dos pré-tratamentos, hidrólise enzimática e fermentação foram analisados por método colorimétrico de dosagem de glicose e por técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) segundo metodologia descrita por Gouveia et al. (2009), e adaptada para a análise de frações líquidas. As amostras foram diluídas e clarificadas em cartuchos C18 e em seguida foram analisadas utilizando coluna aminex HPX 87 H e detector de índice de refração. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4 Os materiais brutos e pré-tratados foram caracterizados segundo metodologia proposta por Gouveia et al. (2009). O pré-tratamento ácido seguido de alcalino resulta na liberação de parte da fração hemicelulósica e da lignina, promovendo o enriquecimento em celulose da fase sólida. Na Tabela 1 pode-se observar a porcentagem de celulose presente no material bruto, no material após tratamento ácido e ao término do pré-tratamento alcalino. Tabela 1 Porcentagem de celulose presente nos materiais bruto e pré-tratado, indicando o enriquecimento em celulose após as etapas. % celulose no material Bruto Pré-tratamento ácido Pré-tratamento alcalino Brachiaria brizantha 37,29 56,91 92,58 Bagaço de cana-de-açúcar 42,78 60,40 91,63 Bagaço de sorgo sacarino 40,04-95,4 Eucalipto 44,96-60,55 Teor de celulose em cada um dos pré-tratamentos e no material bruto, calculada de acordo com procedimento descrito em Gouveia et al. (2009). A combinação dos pré-tratamentos ácido e alcalino, nas condições acima especificadas, é, exceto para o eucalipto, suficiente para remover grande parte dos compostos que inibem as etapas biológicas subsequentes. Entretanto, tem a vantagem de não ser rigorosa o suficiente para que ocorra a quebra da celulose e perda da glicose nas frações líquidas. A soma da glicose perdida nos pré-tratamentos ácido e alcalino representa aproximadamente 0,8% da glicose obtida após a hidrólise enzimática, valor de perda aceitável do ponto de vista industrial. A Figura 1 mostra a curva de produção de glicose para a forrageira B. brizantha cv. Marandu utilizando diferentes concentrações do complexo enzimático numa razão sólido/líquido de 1/10. Foi também avaliada a hidrólise enzimática utilizando 30 FPU/g de material seco numa razão sólido/líquido de 1/7,5. Para todas as concentrações do complexo enzimático utilizado obteve-se a mesma concentração de glicose ao término da hidrólise, aproximadamente 88 g/l, em diferentes tempos. Utilizando 30 FPU/g de material seco são necessárias 72 horas de hidrólise, para 60 FPU/g de material seco em 56 horas a mesma conversão é atingida. Utilizando-se 120 e 240 FPU/ g de material seco, a hidrólise se completou em 48 horas. Por essa razão, não se justifica a utilização de 240 FPU do complexo enzimático por grama de material nos demais experimentos. A menor diluição da biomassa para a hidrólise enzimática prejudicou a formação de glicose. Em 72 horas, a hidrólise enzimática com razão sólido/líquido de 1/7,5 atingiu 77,2 g/l de glicose, correspondente a 83% da conversão possível. As demais condições atingiram aproximadamente 95% de conversão de celulose em glicose. Optou-se então por conduzir a etapa de hidrólise enzimática sempre com razão sólido/líquido de 1/10.
5 Figura 1 Curva de produção de glicose para a forrageira B. brizantha cv. Marandu utilizando diferentes concentrações do complexo enzimático numa razão sólido/líquido de 1/10 e 30 FPU/g de material seco numa razão sólido/líquido de 1/7,5. A curva de formação de glicose para o bagaço de cana-de-açúcar utilizando 30, 60 e 120 FPU do complexo enzimático por grama de material seco e razão sólido/líquido de 1/10 pode ser observada na Figura 2. Figura 2 - Curva de produção de glicose para bagaço de cana-de-açúcar utilizando diferentes concentrações do complexo enzimático numa razão sólido/líquido de 1/10. Para todas as concentrações do complexo enzimático utilizadas obteve-se conversão de aproximadamente 95% da celulose. Essa conversão foi atingida em 72 horas para o experimento que utilizou 30 FPU/g de material seco, em 56 horas para 60 FPU e 48 horas para 120 FPU/g de material seco.
6 A Figura 3 ilustra a formação de glicose para o bagaço de sorgo sacarino BRS utilizando 30 e 120 FPU/g de material seco e razão sólido/líquido de 1/10. Foi atingida conversão de 99,6% da celulose em 72 horas para o experimento de 30 FPU/g de material e de 98,1% para 120 FPU/g de material seco em 56 horas. Figura 3 - Curva de produção de glicose para bagaço de sorgo sacarino BRS utilizando 30 e 120 FPU do complexo enzimático por grama de material seco. Na hidrólise enzimática do eucalipto, a conversão da celulose em 72 horas para o experimento que utilizou 30 FPU do complexo enzimático/g de material seco foi de 35,0%, para 60 FPU foi de 41,5% e para 120 FPU/ g de material seco foi de 47,4%. Os perfis de formação de glicose para as diferentes concentrações do complexo enzimático podem ser visualizado da Figura 4. Figura 4 - Curva de produção de glicose para Eucalipto benthamii utilizando 30, 60 e 120 FPU do complexo enzimático por grama de material seco. Pode-se observar que uma maior quantidade de celulose no material bruto não necessariamente garante maior teor de glicose após a hidrólise enzimática. A hidrólise do eucalipto, que apresentava o maior teor de celulose no material bruto, foi menos eficiente,
7 possivelmente em razão da presença de inibidores da hidrólise no material sólido, principalmente lignina. Para o eucalipto, a sequência de pré-tratamentos proposta não promoveu o enriquecimento satisfatório da fase sólida em celulose. Seria necessário um prétratamento mais drástico, que fosse capaz de retirar com maior eficiência os demais compostos e expor maior quantidade de celulose. Todos os hidrolisados foram suplementados com glicose até que atingissem 100 g/l, para então serem fermentados. A Figura 5 mostra os perfis de consumo de glicose para cada um dos materiais avaliados. Pode-se observar que as quatro biomassas lignocelulósicas utilizadas nos experimentos apresentaram perfis de consumo de glicose semelhantes. As fermentações tiveram duração aproximada de 4 horas, com fase Lag curta, indicando rápida adaptação dos microrganismos ao meio hidrolisado. Obteve-se, com o completo consumo da glicose, para a B. brizantha, 49,2 g/l de etanol, correspondente a um rendimento de 96,3% do teórico e uma produtividade de 13,1 g etanol /L.h. O bagaço de cana-de-açúcar produziu, com o processo fermentativo, 46,1 g/l de etanol, ou seja, 90,2% do rendimento teórico de uma fermentação alcoólica, com produtividade de 12,3 g etanol /L.h. A fermentação do bagaço de sorgo sacarino produziu 48,6 g/l de etanol (95% do rendimento teórico) com produtividade de 12,95 g etanol /L.h. Finalmente, o hidrolisado de eucalipto, na fermentação alcoólica, resultou em um meio com 44,3 g/l de etanol, correspondente a 86,7% do rendimento teórico, com uma produtividade de 11,8 g etanol /L.h. Figura 5 Perfis de consumo de glicose na fermentação das biomassas lignocelulósicas avaliadas. Com base nos valores de rendimento e produtividade de etanol obtidos para a forrageira, bagaço de cana-de-açúcar e de sorgo sacarino, pode-se perceber que a fermentação não sofreu efeito inibitório. É freqüente a formação, nas etapas de pré-tratamento, de componentes como ácidos fracos, furfurais e compostos aromáticos, tais compostos causam efeito inibitório sobre a etapa de fermentação do hidrolisado. Não se pode garantir que a estratégia de pré-tratamento empregada neste trabalho não originou estes componentes. Provavelmente, os inibidores foram retirados do material pré-tratado em decorrência dos processos de lavagem empregados. A fermentação do eucalipto apresentou menor rendimento e produtividade, possivelmente em razão dos mesmos fatores que prejudicaram a hidrólise enzimática, indicando que, para processamento e produção de etanol a partir deste material, é necessário adotar outra estratégia de pré-tratamento.
8 O processo descrito neste trabalho, incluindo pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação alcoólica se mostra bastante promissor. Cao et al. (2012), por exemplo, avaliou cinco diferentes pré-tratamentos para bagaço de sorgo sacarino e obteve, para a melhor condição, pré-tratamento alcalino seguido de imersão em peróxido de hidrogênio, conversão de 90,94% da celulose em glicose na hidrólise enzimática em 96 horas com 2% de sólido e, na fermentação, 6,12 g/l de etanol. Li et al. (2010) trabalhou na otimização do pré-tratamento explosão à vapor com adição de amônia (AFEX) utilizando bagaço de sorgo sacarino, e obteve, na melhor condição, 42,3 g/l de etanol na fermentação do hidrolisado. O bagaço de sorgo sacarino, neste trabalho, apresentou conversão de 98,1% em 72 horas com 10% de sólido na hidrólise enzimática e 48,6 g/l de etanol na fermentação. Rocha et al. (2011) avaliou o pré-tratamento utilizando uma combinação de ácido sulfúrico e ácido acético numa razão sólido/líquido de 1:10 de bagaço de cana-de-açúcar, atingindo conversão de 76% da celulose em glicose na hidrólise enzimática após 72 horas. Hernandéz-Salas et al. (2009) conseguiu conversão de 56% da celulose presente no bagaço de cana-de-açúcar, tendo na fermentação alcoólica rendimento de 63,8% com uma combinação de tratamento alcalino e hidrólise enzimática. Neste trabalho, o bagaço de cana-de-açúcar apresentou conversão de celulose em glicose de 95%, com produção de 46,1 g/l de etanol na fermentação. McIntosh et al. (2012), estudando a produção de etanol a partir de eucalipto pré-tratado com ácido sulfúrico obteve 74% de conversão na hidrólise enzimática em 96 horas, atingindo aproximadamente 38 g/l de glicose no meio. Na fermentação obteve 18 g/l de etanol, correspondente a um rendimento de 92%.O presente trabalho atingiu conversão máxima de 47,4% na hidrólise enzimática, com produção de 44,3 g/l de etanol, correspondente a 86,7% do rendimento teórico. Não foram encontrados relatos na literatura da utilização de B. Brizantha na produção de etanol. 4. CONCLUSÃO A forrageira B. brizantha cv. Marandu, o bagaço de cana-de-açúcar e o bagaço de sorgo sacarino se mostraram biomassas lignocelulósicas promissoras para produção de etanol utilizando a estratégia de pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação apresentadas. Os três materiais apresentaram respostas semelhantes em termos de teor de celulose após o prétratamento, conversão de celulose em glicose na hidrólise enzimática e rendimento de etanol na fermentação alcoólica. O bagaço de sorgo sacarino apresentou ligeiro destaque, pois forneceu a maior concentração de celulose na biomassa pré-tratada, 95,4%. Em consequência, apresentou também a maior conversão na hidrólise enzimática (maior que 98%). Para o eucalipto deve ser avaliada uma nova estratégia, pois o pré-tratamento empregado não foi capaz de expor adequadamente a celulose para a hidrólise enzimática, que ficou prejudicada, possivelmente em razão da estrutura do material. Além disso, a fermentação desse material não apresentou rendimento e produtividade de etanol comparáveis às demais biomassas avaliadas.
9 Foi estabelecido um processo, contemplando pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação alcoólica, eficiente para diferentes matérias-primas sem que seja necessário o ajuste de parâmetros operacionais. Tal fato é extremamente vantajoso para uma possível operação industrial, visto que a fábrica não ficaria dependente da sazonalidade da matériaprima e poderia ser instalada em qualquer região do país. 5. REFERÊNCIAS ANFAVEA Associação Nacional dos Fabricantes de Veículos Automotores. Anuário da Indústria Automobilística Brasileira. São Paulo, BEN BALANÇO ENERGÉTICO NACIONAL. Brasília: MME, CAO, W.; SUN, C.; LIU, R.; YIN, R.; WU, X., Comparison of the effects of five pretreatment methods on enhancing the enzymatic digestibility and ethanol production from sweet sorghum bagasse. Bioresource Technology (2012). EPE - Empresa de Pesquisa Energética. Balanço Energético Nacional Brasília, FERREIRA-LEITÃO, V.; GOTTSCHALK, L.M.F.; FERRARA, M.A.; NEPOMUCENO, A.L.; MOLINARI, H. B. C.; BOM, E.P.S. Biomass Residues in Brazil: Availability and Potential Uses. Waste Biomass Valor, v. 1, p (2010). GOUVEIA, R.; NASCIMENTO, R. T.; SOUTO-MAIOR, A. M; ROCHA, G. J. M. Validação de metodologia para a caracterização química de bagaço de cana-de-açúcar. Química Nova, v. 32, n. 6 (2009). HERNANDÉZ-SALAS, J. M.; VILLA-RAMÍREZ, M. S.; VELOZ-RENDÓN, J. S.; RIVERA-HERNÁNDEZ, K. N.; GONZÁLEZ-CÉSAR, R. A.; PLASCENCIA-ESPINOSA, M. A.; TREJO-ESTRADA, S. R. Comparative hydrolysis and fermentation of sugarcane and agave bagasse. Bioresource Technology, v. 100, p (2009). LI, B. Z.; BALAN, V.; YUAN, Y. J.; DALE, B. E. Process optimization to convert forage and sweet sorghum bagasse to ethanol based on fiber expansion (AFEX) pretreatment. Bioresource Technology, v. 101, p (2012). MABEE, W.E.; MCFARLANE, P.N.; SADDLER, J.N. Biomass availability for lignocellulosic ethanol production. Biomass and bioenergy, v. 35, p (2011). McINTOSH, S.; VANCOV, T.; PALMER, J.; SPAIN, M. Ethanol production from Eucalyptus plantation thinnings. Bioresource Technology (2012). ROCHA, G. J. M.; MARTIN, C.; SOARES, I. B.; MAIOR, A. M. S.; BAUDEL, H. M.; ABREU, C. A. M. Dilute mixed-acid pretreatment of sugarcane bagasse for ethanol production. Biomass and Bioenergy, v. 35, p (2011).
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