1 Escopo MAPA/SDA/CGAL Página 1 de 5 Este método tem como objetivo descrever os procedimentos para o ensaio Pesquisa de Fosfatase Alcalina em Leite Fluido por Colorimetria. 2 Fundamentos O principal objetivo do ensaio é verificar se o processo de pasteurização do leite foi eficiente. Também pode ser utilizado para verificação de fraude por adição de leite cru ao pasteurizado. A enzima fosfatase alcalina, que está sempre presente no leite cru, é desnaturada em temperaturas próximas a de pasteurização. O tratamento térmico igual ou mais severo do que temperaturas de 62,8ºC por 30 minutos ou a 71,8ºC por 15 segundos, aplicados comercialmente para a pasteurização, elimina todos os microrganismos patogênicos e também toda a atividade enzimática da fosfatase alcalina. Logo, o leite e seus derivados que apresentem um teste negativo para fosfatase alcalina são considerados pasteurizados e próprios para o consumo. Um teste positivo, neste caso, significa que não se alcançou a temperatura adequada. No leite UHT, o teste não é realizado rotineiramente, pois a temperatura para a esterilização atinge os 150º C, inativando a enzima. A atividade ótima da enzima ocorre em ph 9,65 e temperatura de 37-39 C sendo aparentemente aumentada pelos elementos cálcio, lítio, manganês e, especialmente, o magnésio. É fortemente inibida pelo zinco, mercúrio e cádmio. Vários fatores podem interferir na quantidade de fosfatase alcalina no leite, tais como raça, individualidade, período de lactação, produção (a quantidade de fosfatase, é inversamente proporcional à produção) e nos casos de mamite em que há grande aumento da fosfatase. A verificação da atividade enzimática é feita mediante a adição do substrato específico da enzima, em condições ideais para sua atuação, à amostra. A fosfatase alcalina hidrolisa ésteres de monofosfatos à temperatura e ph apropriados liberando compostos que podem ser detectados por desenvolvimento de cor. O método utiliza como substrato para a enzima o fenil fosfato dissódico. O fenol liberado reage com 2,6-dicloroquina cloroimida na presença de sulfato de cobre gerando um indofenol de cor azul. A quantidade de cor desenvolvida é proporcional à concentração da fosfatase.
Página 2 de 5 3 Reagentes, padrões e materiais 3.1 Reagentes a) Catalisador Preparo: dissolver 0,2 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO 4.5 H 2 O) p.a. em 100 ml de água. b) Solução reagente Preparo: pesar 0,150 g de 2,6-dicloroquinona cloroimida (C 6 H 2 Cl 3 NO) p.a. e dissolver em 50 ml de álcool etílico p.a. Transferir para frasco âmbar e estocar em geladeira. A coloração da solução recentemente preparada é amarelo-citrina, passando a amarelo-ouro e tendendo a escurecer, adquirindo tons amarronzados com o envelhecimento. Recomenda-se usar a solução por um período máximo de duas semanas, desde que conservada sob refrigeração e ao abrigo da luz. c) Substrato Preparo: em um béquer, pesar 0,5 g de fenilfosfato dissódico dihidratado (C 6 H 5 Na 2 O 4 P.2 H 2 O) p.a. Dissolver com o tampão carbonato diluído e transferir para balão volumétrico de 500 ml. Completar o volume com o mesmo tampão. Recomenda-se usar esta solução durante um período máximo de duas semanas. d) Tampão carbonato (1) Preparo da solução estoque: pesar 46,89 g de carbonato de sódio anidro (Na 2 CO 3 ) p.a. e 37,17 g de bicarbonato de sódio (NaHCO 3 ) p.a. Dissolver em água e transferir para balão volumétrico de 1000 ml, completando o volume. (2) Preparo da solução de uso: retirar uma alíquota de 25 ml da solução estoque e transferir para balão volumétrico de 500 ml e completar o volume. O ph deste tampão diluído situa-se entre 9,5 e 9,7. 3.2 Materiais a) Tubo de ensaio com tampa rosca; b) Estante para tubos;
Página 3 de 5 c) Pipetas graduadas de 2 e 5 ml, ou material volumétrico similar. 4 Equipamentos a) Banho-maria com temperatura entre 39-41ºC b) Termômetro calibrado com divisão de pelo menos 1ºC. 5 Precauções analíticas a) Ajustar a temperatura do banho-maria para que a mesma fique na faixa entre 40 ± 1º C. b) Os tubos de ensaio e suas tampas precisam encontrar-se perfeitamente limpos e sem qualquer vestígio de detergentes em decorrência do processo de lavagem e livres de fenol. c) As provas positivas são repetidas com reagentes recentemente preparados (usar somente o regente do substrato até duas semanas do preparo). d) A amostra sofre cuidadosa agitação antes de ser analisada, visando distribuir a gordura ou a camada de creme pelo líquido. A retirada de uma alíquota da amostra a partir da sua camada superior pode levar a resultado positivo ou suspeito, ainda que o leite tenha sido adequadamente pasteurizado. A fosfatase alcalina encontra-se adsorvida aos glóbulos de gordura. e) A fosfatase alcalina pode sofrer reativação após algum tempo de pasteurização do leite. Esta interferência é rara, porém pode ocorrer principalmente em leites com mais de 24 horas de processamento. Alguns fatores que podem aumentar a reativação são o aumento da temperatura de pasteurização com diminuição do tempo de exposição, aumento da temperatura de estocagem do leite pasteurizado (10 a 34ºC), presença de certos elementos como cálcio e magnésio. A acidez, ao contrário, age inibindo a ativação da fosfatase. 6 Procedimentos 1) Transferir 0,5 ml da amostra a analisar para um tubo de ensaio; 2) Adicionar 5 ml do substrato e tampar. Agitar ligeiramente e levar ao banho-maria mantido a 39-41º C durante 20 minutos. 3) Esfriar o tubo de ensaio em água corrente. 4) Adicionar 6 gotas de solução reagente e 2 gotas do catalisador. 5) Levar o tubo novamente ao banho-maria a 39 41º C por 5 minutos. 6) Fazer a leitura do teste.
Página 4 de 5 A cada novo lote de substrato realizar o ensaio da amostra em paralelo com controle positivo (leite cru) e negativo (leite cru fervido). 7 Resultados O resultado do ensaio fosfatase alcalina é registrado no formulário Dados brutos da análise de leite anexo do POP POA/06 e inserido na planilha eletrônica IT POA/04. O teste é qualitativo e o resultado é expresso como positivo ou negativo. O resultado é considerado positivo com aparecimento de coloração azul intensa (quanto mais intensa a coloração, maior é a deficiência de pasteurização) e negativo com aparecimento de coloração cinza. 7. 1 Critérios para aceitação do resultado Para o leite cru, o resultado esperado é positivo, pois ainda não sofreu nenhum tipo de processamento. Imediatamente após a pasteurização, o leite deve apresentar teste negativo para fosfatase alcalina. Quando o resultado for discordante, o ensaio é repetido com uso de controles. 8 Arquivamento dos registros Não aplicável. Observação: os formulários utilizados neste método de ensaio são arquivados conforme procedimento descrito no POP POA/06 Controle de Itens de ensaio Leite e Derivados Lácteos e IT POA/04 Uso de Planilha Eletrônica na Revisão de Cálculos de Dados Brutos nas Análises de Leite, Derivados Lácteos, Água e Mel. 9 Referências BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuária. Métodos Analíticos Físico-Químicos para Controle de Leite e Produtos Lácteos. Instrução Normativa 68, 12/12/06. Brasília: Ministério da Agricultura, 2006. BRASIL. Ministério da Agricultura. Regulamentos Técnicos de Produção, Identidade e Qualidade do Leite. Instrução Normativa 51, 18/09/02. Brasília: Ministério da Agricultura, 2002. CASTRO, Paula Rosa Schetino. Modificação de Método de Scharer para Determinação da Atividade de Fosfatase Alcalina em Leite. Viçosa, Minas Gerais, 2005. Consultado em
Página 5 de 5 29/07/2014:http://alexandria.cpd.ufv.br:8000/teses/ciencia%20e%20tecnologia%20de%20aliment os/2005/190246f.pdf 10 Anexos Não aplicável. 11 Alterações Alterado o texto do item 2 Fundamentos visando facilitar o entendimento da reação química e implicações no resultados do ensaio. Incluído no item 5 Precauções analíticas, subitem a a importância da vidraria estar livre de fenol (interferente) e no subitem e alguns fatores que podem interferir na reativação enzimática. Incluído uma referência bibliográfica (terceira bibliografia citada). 12 Responsabilidades É de responsabilidade do RT ou seu substituto do POA assegurar que os analistas que utilizarem este MET tenham sido treinados e capacitados para sua execução e o mesmo esteja sendo corretamente seguido. Elaboração/Revisão: Aprovação: Verificação: Rita Beatriz Andrade - POA Tiago Charão de Oliveira - POA Eliana Menezes - UGQ Data: 30/07/2014 Data: 06/08/2014 Data: 07/08/2014